張?jiān)戚x， 劉成成， 祝愛(ài)珍， 陳小宇， 劉革修， 何冬梅， 譚廣銷

(暨南大學(xué)1附屬第一醫(yī)院校門診部，2醫(yī)學(xué)院血液病研究所，廣東廣州510632)

木通皂苷D通過(guò)絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路促進(jìn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞*

張?jiān)戚x1△， 劉成成2， 祝愛(ài)珍2， 陳小宇2， 劉革修2， 何冬梅2， 譚廣銷2

(暨南大學(xué)1附屬第一醫(yī)院校門診部，2醫(yī)學(xué)院血液病研究所，廣東廣州510632)

目的:探討木通皂苷D(ASD)是否促進(jìn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)分化為成骨細(xì)胞及其機(jī)制。方法:分離培養(yǎng)大鼠BMSCs;觀察ASD對(duì)其向成骨細(xì)胞分化的影響以及p38絲裂原激活蛋白激酶(p38 MAPK)抑制劑SB203580和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)抑制劑PD098059的干預(yù)作用;檢測(cè)BMSCs分化過(guò)程中堿性磷酸酶(ALP)活性和骨鈣素(OC)含量;實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)護(hù)骨素(OPG)和核因子κB受體活化因子配體(RANKL)mRNA的表達(dá);Western blotting法檢測(cè)p38 MAPK和ERK活性水平。結(jié)果:ASD處理后第9 d，成骨性分化標(biāo)志物OPG mRNA表達(dá)量明顯增高，RANKL mRNA的表達(dá)量明顯降低，同時(shí)顯著提高BMSCs分化為成骨細(xì)胞的ALP活性和OC的表達(dá)，而且p38 MAPK和ERK活性也顯著增加。SB203580和PD098059則顯著抑制ASD的成骨作用。結(jié)論:ASD在體外具有促進(jìn)大鼠BMSCs向成骨細(xì)胞分化的作用，這一作用與MAPK途徑的p38 MAPK和ERK蛋白有關(guān)。

木通皂苷D;間充質(zhì)干細(xì)胞;成骨細(xì)胞;分化;信號(hào)通路

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)亦稱骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(bone mar-row stromal cells，BMSCs)，主要存在于機(jī)體骨髓腔中，具有干細(xì)胞特性，具有多向分化能力［1－3］。其向成骨分化特性是骨組織工程、骨折修復(fù)和骨質(zhì)疏松等研究的理論基礎(chǔ)。木通皂苷D(Akebia saponin D，ASD)是續(xù)斷、木通藥材的主要活性成分，又稱川續(xù)斷皂苷IV，具有明確的藥理活性［4］，主要用于制備防治骨質(zhì)疏松和/或促進(jìn)骨愈合的藥物。有研究表明，ASD可促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化，提高成骨細(xì)胞的活性和數(shù)量，促進(jìn)基質(zhì)鈣化、骨痂生長(zhǎng)，從而防止骨質(zhì)疏松、促進(jìn)骨折的愈合［5］。目前研究表明，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞定向分化，主要通過(guò)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular signal－regulated kinase 1/2，ERK1/2)和p38絲裂原激活蛋白激酶(p38 mitogen－activated protein kinase，p38 MAPK)信號(hào)通路調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Runx2的轉(zhuǎn)錄活性，Runx2則調(diào)節(jié)下游成骨性標(biāo)志物的表達(dá)，例如護(hù)骨素(osteoprotegerin，OPG)、核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor－kappa B ligand，RANKL)等，促進(jìn)MSCs的成骨分化［6－9］。本研究觀察ASD是否促進(jìn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化及其對(duì)ERK和p38 MAPK活性的影響。

材料和方法

1 材料

4周齡雄性SD大鼠購(gòu)自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心;DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶購(gòu)自Gibco;青霉素和鏈霉素購(gòu)自華北制藥;細(xì)胞裂解液、地塞米松、β－甘油磷酸鈉和DMSO購(gòu)自Sigma;SB203580和PD098059購(gòu)自Gibco;堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所;細(xì)胞茜素紅鈣染色試劑盒購(gòu)自上海杰美基因醫(yī)藥有限公司;ERK1/2、p－ERK1/2、p38和p－p38抗體購(gòu)自Santa Cruz。

2 方法

2.1 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng) 按照文獻(xiàn)［9］，取4周齡雄性SD大鼠利用頸椎脫臼法處死，然后用75%乙醇浸泡5 min，在無(wú)菌條件下分離出兩側(cè)股骨及脛骨，剔除干凈表面附著的肌肉、筋膜等組織，剪去股骨近端和脛骨遠(yuǎn)端，充分暴露骨髓腔，用DMEM完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素及100 mg/L鏈霉素)反復(fù)沖洗骨髓腔，直至骨髓腔發(fā)白，收集細(xì)胞轉(zhuǎn)移至15 mL的離心管中，1 000 r/min離心8 min，棄上清，混成細(xì)胞懸液，約2 ×106個(gè)細(xì)胞接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，標(biāo)記為原代P0，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后換液以去除未貼壁細(xì)胞和各種雜質(zhì)，加入5 mL新鮮完全培養(yǎng)液。此后每隔2～3 d換液1次，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，直至細(xì)胞接近80%匯合時(shí)進(jìn)行傳代。此后每隔3～4 d傳代1次。取第4代細(xì)胞進(jìn)行MSCs鑒定:成骨分化采用茜素紅染色、成脂分化細(xì)胞采用油紅O染色、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表面標(biāo)記CD44和CD45。

2.2 ASD對(duì)BMSCs成骨分化的影響 取第4代已鑒定的BMSCs為研究對(duì)象，根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)需要將細(xì)胞種植于培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板中，加入成骨誘導(dǎo)液(含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素及100 mg/L鏈霉素、10－8mol/L地塞米松、10 mmol/L β－甘油磷酸鈉、50 mg/L抗壞血酸的DMEM低糖培養(yǎng)基)培養(yǎng)。觀察不同濃度的ASD對(duì)BMSCs成骨分化的影響:實(shí)驗(yàn)分6組，A組:空白對(duì)照組，正常培養(yǎng)MSCs;B組:實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，成骨誘導(dǎo)分化MSCs;C組:成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)+ASD(0.1 μmol/L);D組:成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)+ ASD(1.0 μmol/L);E組:成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)+ASD(10 μmol/L);F組:成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)+ASD(1.0 μmol/ L)+SB203580(20 μmol/L)+PD098059(50 μmol/ L)。1.0 μmol/L ASD是根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)分析得出的實(shí)驗(yàn)適合濃度。

2.3 ALP活性的測(cè)定 取已鑒定的BMSCs，以1× 108/L的密度接種于96孔板，每孔100 μL，設(shè)5個(gè)復(fù)孔。各組于成骨性誘導(dǎo)培養(yǎng)第3、6、9和12 d測(cè)定ALP活性，檢測(cè)時(shí)將細(xì)胞洗滌后以0.2%Triton X－100裂解液及反復(fù)凍融法充分裂解，裂解液經(jīng)低溫離心機(jī)12 000×g離心10 min，取上清50 μL，按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，于酶標(biāo)儀520 nm波長(zhǎng)處測(cè)定ALP值。ALP活性以mmol·L－1·min－1·(g protein)－1表示。

2.4 采用ELISA法檢測(cè)骨鈣素(osteocalcin，OC)的含量 成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后每3 d換液1次，每次換液時(shí)留取1 mL舊培養(yǎng)液，于－20℃保存，收集第3、6、9和12 d各組的樣品，采用ELISA法檢測(cè)骨鈣素的分泌量，以μg/L表示，具體操作步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2.5 成骨性分化基因表達(dá) 收集第12 d各組的細(xì)胞，用Trizol試劑按照常規(guī)方法抽提總RNA，采用A260/A280比值來(lái)確定總RNA的質(zhì)量，并用2%瓊脂糖電泳檢測(cè)其完整性。應(yīng)用隨機(jī)引物和反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈，按常規(guī)方法進(jìn)行。使用SYBR PremixEx TaqTMReal－time PCR試劑盒配制20 μL PCR反應(yīng)體系，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)成骨性基因OPG mRNA、RANKL mRNA表達(dá)情況。反應(yīng)條件為:熒光定量PCR 93℃3 min，然后93℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)。以目的基因擴(kuò)增量/內(nèi)參照(β－actin)基因擴(kuò)增量表示所要檢測(cè)基因的表達(dá)量。OPG/RANKL mRNA的相對(duì)表達(dá)量以公式2－ΔCt表示，其中ΔCt=Ct(OPG/ RANKL)－Ct(β－actin)。實(shí)時(shí)定量PCR引物及探針:OPG:sense strand(5'－3')CGGCACATTGGACATGCTAA;anti－sense strand(5'－3')TCCCGGTAAGCTTTCCATCA;probe(5'－3')FAM－TCACCTTCGAGCAGCTTCGTAGC－TAMRA。RANKL:sense strand(5'－3')CGATGGTGGATGGCTCATG;antisense strand(5'－3')TGAGCAAAAGGCTGAGCTTCA; probe(5'－3')FAM－TTAGATCTGGCCAAGAGGAGCAAGC－TAMRA。β－actin:sense strand(5'－3') GCGCGGCTACAGCTTCA;anti－sense strand(5'－3') TCTCCTTAATGTCACGCACGAT;probe(5'－3')FAM－CACCACGGCCGAGCGGGA－TAMRA。

2.6 Western blotting檢測(cè)ERK和p38 MAPK的表達(dá)及活性 細(xì)胞處理48h后，用預(yù)冷的PBS洗2遍，加入細(xì)胞裂解液，4℃裂解30 min，12 000 r/min離心10 min，取上清液，用BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量。50 μg總蛋白經(jīng)SDS－PAGE分離后，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，50 g/L脫脂牛奶常溫下封閉1 h，用Ⅰ抗ERK1/2(1∶1 000)、p38(1∶1 000)、p－ERK1/2 (1∶1 000)、p－p38(1∶1 000)、β－actin(1∶5 000)分別4℃孵育過(guò)夜，用TBST洗3次，每次10 min，加入Ⅱ抗(1∶2 500)孵育1.5 h，再用TBST洗3次，每次10 min。將膜用發(fā)光試劑ECL顯色，暗室曝光，凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(珋x±s)表示，采用SPSS 13.0軟件處理數(shù)據(jù)，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)

骨髓細(xì)胞接種24 h后，大部分細(xì)胞仍然懸浮，少量細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)、呈梭形，細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，2～3 d后增殖加快，7 d左右達(dá)融合。通過(guò)傳代、常規(guī)貼壁法分離純化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，第3代細(xì)胞形態(tài)單一，呈梭形，可見(jiàn)集落形成，細(xì)胞增生活躍。第4代細(xì)胞進(jìn)行成骨成脂分化鑒定顯示可以分化為成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞，見(jiàn)圖1;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD44表達(dá)率為93.50%，CD45表達(dá)率為0.21%。

Figure 1. The BMSCs isolated from rat bone marrow(×200).A:the primary cells;B:the fourth generation cells;C: oil red O staining after adipogenic induction of differentiation;D:alizarin red staining after osteogenic induction of differentiation.圖1 分離培養(yǎng)的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

2ASD對(duì)BMSCs ALP活性影響

常規(guī)成骨誘導(dǎo)分化的細(xì)胞在第3、6、9和12 d均表達(dá)ALP，且逐漸增加，其活性與正常MSCs相比差異顯著(P＜0.01);低劑量ASD對(duì)細(xì)胞成骨分化則作用不明顯，在第3、6、9和12 d ALP活性與常規(guī)成骨分化相比無(wú)顯著差異(P＞0.05);中、高劑量ASD則促進(jìn)MSCs成骨分化，在第3、6、9和12 d ALP活性與常規(guī)成骨分化相比差異顯著 (P＜0.01)，中、高劑量ASD之間無(wú)顯著差異(P＞0.05);p38 MAPK抑制劑 SB203580(20 μmol/L)和 ERK抑制劑PD098059(50 μmol/L)則抑制MSCs成骨分化，第3、6、9和12 d ALP活性與其它成骨分化組相比差異顯著(P＜0.01)。

3 ASD對(duì)BMSCs誘導(dǎo)分化過(guò)程中OC分泌的影響

A組在第3、6、9和12 d僅有微量OC生成;B組在第3、6、9和12 d OC含量與A組相比差異顯著(P＜0.01);D組在第3、6、9和12 d OC含量明顯增多，與B組相比差異顯著(P＜0.01);F組在第3、6、9、12 d OC含量明顯降低，與B、D組相比差異顯著(P＜0.01)，見(jiàn)圖1。這說(shuō)明1.0 μmol/L ASD對(duì)MSCs成骨分化具有促進(jìn)作用。

4 ASD對(duì) BMSCs誘導(dǎo)分化過(guò)程中 OPG與RANKL表達(dá)的影響

正常培養(yǎng)的MSCs幾乎不表達(dá)OPG和RANKL mRNA，成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)的細(xì)胞在第9 d表達(dá)了一定量的OPG mRNA和RANKL mRNA，兩者比值為1.52±0.45;1.0 μmol/L ASD則可以進(jìn)一步促進(jìn)其OPG mRNA的表達(dá)，兩者比值增加為3.87±1.20，與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組相比差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);而SB203580(20 μmol/L)和PD098059(50 μmol/L)則可顯著抑制OPG的表達(dá)，兩者比值增加為1.13± 0.32，分別與B、D組相比差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)圖2。

表1 ASD對(duì)BMSCs成骨分化過(guò)程中堿性磷酸酶活性的影響Table 1.Effects of Akebia saponin D(ASD)on ALP activity of BMSCs during differentiation to osteoblasts［mmol·L－1·min－1·(g protein)－1.珋x±s.n=5］

表2 ASD對(duì)BMSCs成骨分化過(guò)程中骨鈣素分泌的影響Table 2.Effects of ASD on osteocalcin secretion of BMSCs cells during differentiation to osteoblasts(μg·L－1.珋x±s.n=5)

5 ASD對(duì)BMSCs向成骨細(xì)胞分化過(guò)程中ERK和p38 MAPK的影響

成骨誘導(dǎo)分化過(guò)程中ASD(1.0 μmol/L)處理的細(xì)胞不僅表達(dá)ERK和p38 MAPK水平總量顯著增加，而且p－ERK1/2和p－p38 MAPK也顯著增加。SB203580(20 μmol/L)和PD098059(50 μmol/L)則可顯著抑制p－ERK1/2和p－p38 MAPK水平，見(jiàn)圖3。

討論

BMSCs具有多向分化潛能，能促進(jìn)間充質(zhì)組織的再生，如:骨、軟骨、肌肉、韌帶、肌腱、脂肪及基質(zhì)等組織。自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植不會(huì)發(fā)生免疫排斥反應(yīng)，但是在骨髓中，BMSCs占骨髓有核細(xì)胞總數(shù)的0.001%～0.1%，含量極低。因此，體外培養(yǎng)獲取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞，已經(jīng)成為骨組織工程等的研究熱點(diǎn)。

骨組織由細(xì)胞和骨基質(zhì)組成。骨質(zhì)疏松癥是一種系統(tǒng)性骨病，主要是由于成骨細(xì)胞形成不足和破骨細(xì)胞吸收亢進(jìn)所致的骨重建失衡。ALP是主要分布于細(xì)胞膜的鈣結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，一種較為肯定的成骨細(xì)胞分化的早期指標(biāo)，促進(jìn)細(xì)胞成熟、鈣化，它的表達(dá)和分泌會(huì)隨著細(xì)胞的分化而增強(qiáng)，ALP活性越強(qiáng)表明成骨細(xì)胞骨形成的狀況越好。骨鈣素是骨質(zhì)鈣化必需的因子，維持骨組織的正常礦化。ALP和骨鈣素分別是成骨細(xì)胞早期和中期分化的標(biāo)志物。本研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs用成骨誘導(dǎo)液加1 μmol/L ASD培養(yǎng)，在細(xì)胞分化過(guò)程中堿性磷酸酶和骨鈣素合成較對(duì)照組增多，說(shuō)明ASD可促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化。研究結(jié)果還顯示，BMSCs在ASD作用后第9 d，堿性磷酸酶和骨鈣素合成最多，說(shuō)明ASD在細(xì)胞內(nèi)起作用的時(shí)間需要9 d左右。

MAPK是一系列絲氨酸/蘇氨酸激酶，是介導(dǎo)細(xì)胞反應(yīng)的重要信號(hào)系統(tǒng)，包括3個(gè)信號(hào)途徑蛋白: ERK、c－Jun氨基末端激酶(JNK)和p38 MAPK。它們可激活多種轉(zhuǎn)錄因子來(lái)調(diào)控基因表達(dá)，在細(xì)胞增殖、分化、運(yùn)動(dòng)及凋亡等多種生理過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用［10－12］。

Figure 2. Effects of ASD on expression of OPG/RANKL during BMSCs differentiation.A:normal control;B:osteogenic differentiation;D osteogenic differentiation+ASD(1.0 μmol/L);F:osteogenic differentiation+ASD(1.0 μmol/L)+SB203580(20 μmol/L)+PD098059(50 μmol/L).珋x±s.n=5.＊＊P＜0.01 vs A group;##P＜0.01 vs B group;△△P＜0.01 vs D group.圖2 BMSCs分化過(guò)程中ASD對(duì)BMSCs OPG/RANKL的影響

Suzuki等［13］研究發(fā)現(xiàn)，以MAPK細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在成骨細(xì)胞的活化中最為重要，MAPK通路主要參與成骨細(xì)胞的分化，破骨細(xì)胞的形成和凋亡，并且在RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)中具有主要的調(diào)控作用，是骨質(zhì)疏松癥發(fā)病的重要細(xì)胞信號(hào)途徑。

Giner等［14］研究表明，成骨細(xì)胞能分泌OPG和RANKL，具有調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化、發(fā)育的作用，其與破骨細(xì)胞上的RANK形成了一個(gè)骨調(diào)節(jié)軸，RANK是RANKL的唯一受體，RANK介導(dǎo)的信號(hào)是破骨細(xì)胞分化、活化的一道關(guān)鍵閘門。OPG抑制骨吸收功能通過(guò)與RANKL競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合RANK來(lái)實(shí)現(xiàn)，其中OPG扮演RANKL的誘餌性受體角色。RANKL與RANK結(jié)合后啟動(dòng) RANKL信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，OPG則與RANKL競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合RANK，RANKL/OPG濃度比決定破骨細(xì)胞分化、成熟及功能。因此，RANKL、RANK和OPG形成了一個(gè)調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化、成熟、功能的軸，這個(gè)調(diào)節(jié)軸也是影響破骨細(xì)胞分化、發(fā)育，調(diào)節(jié)其功能唯一的、最終的途徑，在多種骨質(zhì)疏松中起重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)ASD可以上調(diào) BMSCs OPG mRNA表達(dá)，下調(diào)RANKL mRNA表達(dá)，使得OPG/ RANKL比值升高;另外，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)成骨誘導(dǎo)分化過(guò)程中川續(xù)斷皂苷VI(1.0 μmol/L)處理的細(xì)胞表達(dá)ERK和p38 MAPK水平總量顯著增加，說(shuō)明ASD可能通過(guò)上調(diào)OPG/RANKL，使得ERK和p38 MAPK通路蛋白增加，進(jìn)而誘導(dǎo)BMSCs向成骨細(xì)胞分化。

Figure 3. Effects of ASD on expression of p－ERK1/2 and p－p38 MAPK during BMSCs differentiation.A:normal control;B:osteogenic differentiation;D:osteogenic differentiation+ASD(1.0 μmol/L);F:osteogenic differentiation+ASD(1.0 μmol/ L)+SB203580(20 μmol/L)+PD098059(50 μmol/L).珋x±s.n=5.＊＊P＜0.01 vs A group;##P＜0.01 vs B group;△△P＜0.01 vs D group.圖3 ASD對(duì)BMSCs向成骨細(xì)胞分化過(guò)程中ERK和p38 MAPK的影響

本研究提示，ASD可以促進(jìn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，并可以上調(diào)OPG/RANKL，增加ERK和p38 MAPK蛋白表達(dá)，對(duì)于探討外傷、骨折后利用ASD治療，促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞方向分化，促進(jìn)骨愈合的機(jī)制具有重要意義。

［1］Pileggi A.Mesenchymal stem cells for the treatment of diabetes［J］.Diabetes，2012，61(6):1355－1356.

［2］Han R，Kan Q，Sun Y，et al.MiR－9 promotes the neural differentiation of mouse bone marrow mesenchymal stem cells via targeting zinc finger protein 521［J］.Neurosci Lett，2012，515(2):147－152.

［3］Zhang LL，Liu JJ，Liu F，et al.MiR－499 induces cardiac differentiation of rat mesenchymal stem cells through wnt/β－catenin signaling pathway［J］.Biochem Biophys Res Commun，2012，420(4):875－881.

［4］楊中林.木通皂苷D在制備防治骨病藥物中的應(yīng)用:中國(guó)CN1493299A［P］.

［5］程志安，吳燕峰，黃智清，等.續(xù)斷對(duì)成骨細(xì)胞增殖、分化、凋亡和細(xì)胞周期的影響［J］.中醫(yī)正骨，2004，16 (12):1－3.

［6］Chen YJ，Kuo YR，Yang KD，et al.Activation of extracellular signal－regulated kinase(ERK)and p38 kinase in shock wave－promoted bone formation of segmental defect in rats［J］.Bone，2004，34(3):466－477.

［7］Dai Z，Li Y，Quarles LD，et al.Resveratrol enhances proliferation and osteoblastic differentiation in human mesenchymal stem cells via ER－dependent ERK1/2 activation［J］.Phytomedicine，2007，14(12):806－814.

［8］Yang L，Wang NL，Cai GP.Maohuoside A promotes osteogenesis of rat mesenchymal stem cells via BMP and MAPK signaling pathways［J］.Mol Cell Biochem，2011，358(1－2):37－44.

［9］Peng S，Zhou G，Luk KD，et al.Strontium promotes osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells through the Ras/MAPK signaling pathway［J］.Cell Physiol Biochem，2009，23(1－3):165－174.

［10］Chang L，Karin M.Mammalina MAP kinase signaling cascades［J］.Nature，2001，410(6824):37－40.

［11］Han YC，Liu LY，Yan DX，et al.Correlation between expression of P38 MAPK－signaling and uPA in breast cancer［J］.Chin J Clin Oncol，2008，5(3):161－164.

［12］Tsubaki M，Matsuoka H，Yamamoto C，et al.The protein kinase C inhibitor，H7，inhibits tumor cell invasion and metastasis in mouse melanoma via suppression of ERK1/2［J］.Clin Exp Metastasis，2007，24(6):431－438.

［13］Suzuki A，Guicheux J，Palmer G，et al.Evidence for a role of p38 MAP kinase in expression of alkaline phosphatase during osteoblastic cell differentiation［J］.Bone，2002，30(1):91－98.

［14］Giner M，Rios MA，Montoya MA，et al.RANKL/OPG in primary cultures of osteoblasts from post－menopausal women.Differences between osteoporotic hip fractures and osteoarthritis［J］.J Steroid Biochem Mol Biol，2009，113 (1－2):46－51.

Akebia saponin D promotes differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into osteoblasts through MAPK signaling pathways

ZHANG Yun－h(huán)ui1，LIU Cheng－cheng2，ZHU Ai－zhen2，CHEN Xiao－yu2，LIU Gexiu2，HE Dong－mei2，TAN Guang－xiao2
(1Campus Clinic，the First Affiliated Hospital，2Institute of Hematology，School of Medicine，Jinan University，Guangzhou 510632，China.E－mail:z001yh@163.com)

AIM:To explore the role of Akebia saponin D(ASD)in the differentiation of rat bone marrowderived mesenchymal stem cells(BMSCs)into osteoblasts.METHODS:The rat BMSCs were cultured using routine methods.The effects of ASD on the differentiation of MSCs into osteoblasts were observed.The p38 mitogen－activated protein kinase(p38 MAPK)inhibitor SB203580 and extracellular signal－regulated kinase(ERK)inhibitor PD098059 were used to evaluate the mechanisms.The activity of alkaline phosphate(ALP)and content of osteocalcin(OC)were assayed during differentiation.The mRNA expression of osteoprotegerin(OPG)and receptor activator of nuclear factor－κB ligand(RANKL)was determined by real－time fluorescence quantitative PCR.The activity of p38 MAPK and ERK was measured by Western blotting.RESULTS:Six days after treatment with ASD，the mRNA expression of OPG significantly increased，while the mRNA level of RANKL significantly decreased in induced cells.ASD increased the activity of ALP and the content of OC.Moreover，ASD enhanced the activity of both p38 MAPK and ERK，which was inhibited by SB203580 and PD098059.SB203580 and PD098059 also inhibited the positive role of ASD in the differentiation of MSCs into osteoblasts.CONCLUSION:Akebia saponin D significantly enhances differentiation of rat BMSCs into osteoblasts in vitro，which may be mediated by the p38 MAPK and ERK signaling pathways.

Akebia saponin D;Mesenchymal stem cells;Osteoblast;Differentiation;Signaling pathway

R332

A

10.3969/j.issn.1000－4718.2012.08.021

1000－4718(2012)08－1455－06

2012－04－09

2012－06－13

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.30670902)

△通訊作者Tel:020－85225658－809;E－mail:z001yh@163.com