吳 彪,楊愛國,劉志鴻,周麗青,程 鵬,于 濤,2

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 黃海水產(chǎn)研究所,農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)資源可持續(xù)利用重點開放實驗室,山東 青島266071;2.上海海洋大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,上海 201306)

雜交是動、植物種質(zhì)改良的重要手段之一,通過雜交可使遺傳背景不同的兩個親本遺傳物質(zhì)進(jìn)行組合,雜合子會擁有一個全新的胞內(nèi)環(huán)境和核質(zhì)關(guān)系,雜合子在這種全新系統(tǒng)的調(diào)控下可能會產(chǎn)生在生長勢、成活力等方面的優(yōu)勢。雜交育種技術(shù)已經(jīng)在海水養(yǎng)殖貝類諸如鮑魚[1]、牡蠣[2]、扇貝[3-4]、珠母貝[5]等多個種類中得到應(yīng)用,在貝類遺傳改良研究中起到了重要作用。

隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展,研究發(fā)現(xiàn)DNA胞嘧啶甲基化可能與雜種優(yōu)勢的表達(dá)有關(guān)。所謂DNA胞嘧啶甲基化是指生物體在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下,以 S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體,將甲基轉(zhuǎn)移到胞嘧啶的5′位置上,是基因表達(dá)調(diào)控的方式之一[6]。甲基化敏感擴增多態(tài)性(methylation-sensitive amplification polymorphism,MSAP)技術(shù)由于具有簡便、高效、可靠等特點逐漸成為研究DNA甲基化的主要方法之一,是利用內(nèi)切酶HpaII和MspI分別與內(nèi)切酶EcoRI一起對基因組 DNA進(jìn)行雙酶切,之后接上相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶的接頭,再利用接頭序列設(shè)計引物進(jìn)行 AFLP分析,通過擴增圖譜辨別位點甲基化情況,由Reyna-López等[7]首次報道。MSAP技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用到豬(Sus domesticus)[8]、牛(Bos taurus)[9]、草魚(Ctenopharyngodon idellus)[10]、水稻(Oryza sativa)[11]等多種生物的基因組DNA甲基化研究中。

2003年以來,作者選用蝦夷扇貝(Patinopecten yessoensis)與櫛孔扇貝(Chlamys farreri)作為親本進(jìn)行了多年的雜交育種研究,實驗結(jié)果表明,所篩選到的雜交組合蝦夷扇貝♂×櫛孔扇貝♀的雜交子一代成體表觀性狀偏向母本、遺傳距離與母本相對較近,但在生長和夏季成活力方面具有明顯的雜種優(yōu)勢[12]。作者通過一定的交配策略構(gòu)建不同的家系,比較分析了扇貝雜交家系和自交家系幼蟲早期生長存活差異,并運用MSAP技術(shù)分析了各家系DNA甲基化水平及其與生長性能的相關(guān)性,為研究雙親對雜交扇貝的遺傳貢獻(xiàn),為雜種優(yōu)勢的研究奠定良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 親貝來源

蝦夷扇貝于2009年2月份采自于大連長?？h海域,櫛孔扇貝于同年3月采自于山東日照海區(qū),于中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長島增殖實驗站室內(nèi)暫養(yǎng)育肥。

1.2 家系建立

選取性腺飽滿成熟且同種類個體間大小沒有差異的個體作為親貝,以雄性蝦夷扇貝(A)、雌性櫛孔扇貝(B、D)、雄性櫛孔扇貝(C)建立家系,交配策略如下：

每個交配組合設(shè)3個平行組,共9個家系,分別表示為 A1B1、B1C1、C1D1、A2B2……C3D3。構(gòu)建家系具體方法為,將挑選出的每個親貝分別置于一個單獨的容器內(nèi),高于育肥水溫 1～2℃條件下刺激親貝產(chǎn)卵排精,待精卵排出后鏡檢質(zhì)量,并以每個卵子周圍 4～6個精子的比例進(jìn)行人工授精。授精在卵子排出1 h內(nèi)完成,保證半同胞家系授精同步性,實驗過程中杜絕交叉污染。

1.3 幼蟲培育

幼蟲孵化和培育過程中,每個家系幼蟲都分別置于一個特制的網(wǎng)箱中,所有網(wǎng)箱放在同一個水池中以保證幼蟲生長環(huán)境的統(tǒng)一性。授精1 h后將各個家系移入網(wǎng)箱中,于18℃水溫下孵化。幼蟲發(fā)育至D形幼蟲期進(jìn)行選優(yōu),并校正幼蟲密度為3～5 個/mL。每天換水兩次,每次1/3體積,5d倒池一次,餌料以金藻為主,配合投喂扁藻和少量硅藻。幼蟲培育過程中,每2天對各家系的幼蟲密度進(jìn)行一次測量,根據(jù)測得的密度對各個家系進(jìn)行密度均等矯正,以消除實驗過程中密度因素對實驗結(jié)果的影響。

1.4 數(shù)據(jù)獲得及分析

用顯微鏡上的目微尺測量每個家系卵徑;統(tǒng)計D形幼蟲孵化情況,計算孵化率;每天從各個家系隨機取樣,分別測量30個個體的殼長。測量殼長時,用碘液將幼蟲殺死。SPSS分析各家系間數(shù)據(jù)差異性,建立殼長與日齡的一元線性回歸方程。

1.5 MSAP分析

1.5.1 DNA提取

幼蟲發(fā)育至擔(dān)輪幼蟲、D形幼蟲時,用無水乙醇固定3次,－20℃下保存。提取基因組DNA時,將幼蟲置于培養(yǎng)皿中將無水乙醇自然揮干,1×PBS沖洗2遍后,離心去除PBS,加0.1×TE,用槍頭挑取單個幼蟲放在PCR管中,加入20 μL 500 μg/mL的蛋白酶K后56℃裂解1 h,95℃滅活蛋白酶K 10 min。

1.5.2 MSAP反應(yīng)

參照Xiong等[11]的方法,適當(dāng)優(yōu)化實驗條件。本實驗室優(yōu)化后的MASP反應(yīng)步驟為：每個樣品DNA設(shè)置EcoRI+MspI和EcoRI+HpaII兩種酶切反應(yīng),反應(yīng)體系包括400 ng DNA,3 UEcoRI(Fermentas),3 UHpaII/MspI(Fermentas),2 μL 10 × Buffer TangoTM,37 ℃水浴6 h,65 ℃酶切變性10 min。連接體系為20 μL：5 μL酶切產(chǎn)物,50 pmol HM接頭,10 pmol E接頭,5 U T4DNA Ligase(Fermentas),4 μL 5 × T4DNA Ligase Buffer,補水至20 μL,16 ℃連接過夜,產(chǎn)物稀釋10倍用于預(yù)擴增。

預(yù)擴增體系為 20 μL：l μL 稀釋連接產(chǎn)物,20 pmol E0和 HM0預(yù)擴引物,0.1 UTaqDNA Polymerase(Tiangen),40 pmol Mg2+,4 pmol dNTPs,2 μL 10 × Taq Buffer,補水至 20 μL。擴增程序為：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 S,56 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,共進(jìn)行25個循環(huán);72 ℃10 min 。產(chǎn)物稀釋30倍。

選擇擴增體系為20 μL：3 μL稀釋的預(yù)擴增產(chǎn)物,20 pmol HMn和5 pmol En選擴引物,其他相應(yīng)組分與預(yù)擴增體系內(nèi)的相同。選擴程序為：94 ℃預(yù)變性5 min;第一輪擴增為13個循環(huán)(94 ℃,30 s;65 ℃,30 s;72 ℃,1 min),退火溫度每個循環(huán)降低0.7 ℃,降低到56 ℃為止;第二輪擴增為27個循環(huán)(94 ℃,30 s;56 ℃,30 s;72 ℃,1 min),72℃延伸5 min。

擴增產(chǎn)物與等量的變性上樣緩沖液混合后,95℃變性10 min,迅速冰浴5 min,6%聚丙烯酰胺凝膠電泳60 W恒功率電泳2.5 h,電泳結(jié)束后采用銀染法顯色。實驗所用接頭及引物組合見表1。

1.5.3 甲基化率統(tǒng)計與分析

同一DNA分別用HpaII和MspI酶切后選擴,統(tǒng)計50～1500 bp的條帶,計算各個家系總甲基化率,利用 SPSS 17.0進(jìn)行甲基化率與殼長生長速度相關(guān)性分析?？偧谆?(全甲基化位點數(shù)+半甲基化位點數(shù))/總擴增位點數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 幼蟲卵徑大小和孵化率

3個不同家系組合的卵徑大小和孵化率統(tǒng)計結(jié)果如表2。結(jié)果表明,家系 AB、BC、CD卵徑分別為 65.667 μm、65.778 μm、65.889 μm,沒有顯著差異(P＞0.05);其孵化率分別為91.830 %、94.500 %、94.330 %,雜交家系稍低于自交家系,但差異不顯著(P＞0.05)。各家系母體來源的卵子大小在同一個水平,幼蟲營養(yǎng)發(fā)育起點沒有顯著差異。

表1 所用接頭和引物組合Tab.1 List of MSAP primers and adapters used

表2 不同家系卵徑大小、孵化率和殼長的日增長速度Tab.2 Mean size of egg dismeter,embryonic hatching rates and daily mean growth rate of shell length for different shellfish lines

2.2 家系幼蟲生長速度差異及方程建立

根據(jù)每個家系幼蟲測量數(shù)據(jù),計算各家系幼蟲殼長日增長速度并建立了殼長與生長日齡的一元線性回歸方程,結(jié)果如表2和表3。結(jié)果表明,家系A(chǔ)B、BC、CD附著前期平均生長速度分別為6.231、5.429、5.190 μm/d,雜交家系明顯快于自交家系,具有顯著性差異(P＜0.05),而兩個同父異母的半同胞自交家系幼蟲間生長速度沒有差異,說明雜交扇貝在生長速度方面產(chǎn)生了優(yōu)勢;各家系生長方程相關(guān)系數(shù)均達(dá)到 0.99以上,說明所建立的回歸方程具有較強的代表性,符合扇貝幼蟲前期生長規(guī)律。

表3 各家系的殼長(y,μm)和培育時間(x,d)的線性回歸方程Tab.3 Linear regression equation between shell length(y,μm) and larvae reared day (x,d) for all lines

2.3 各家系 DNA甲基化水平及其與生長速度的相關(guān)性

在40對引物組合中篩選到擴增效果好的4對組合,分別為 E2HM3、E3HM1、E3HM3、E5HM3。對各家系 20個幼蟲進(jìn)行擴增,各家系日生長速度及甲基化率結(jié)果見表4。AB、BC、CD的平均 DNA甲基化率分別為18.672 %、22.661 %、22.303 %,雜交家系甲基化率低于自交家系,而兩個自交家系的甲基化率在同一水平。SPSS對9個家系進(jìn)行DNA甲基化水平和殼長生長的相關(guān)性分析得到它們的相關(guān)系數(shù)為-0.934(表5),達(dá)到了極顯著水平的負(fù)相關(guān)(P＜0.01)。雜交使后代 DNA甲基化水平降低,殼長生長表現(xiàn)出的雜種優(yōu)勢與DNA甲基化水平有一定的關(guān)系。

3 討論

3.1 構(gòu)建家系的必要性

運用家系材料進(jìn)行種質(zhì)改良、實驗研究已經(jīng)在諸如合浦珠母貝(Pinctada fucata)[13]、菲律賓蛤仔(Ruditapes plilippinarum)[14]、蝦夷扇貝[15]等多種貝類中得到應(yīng)用。多數(shù)家系建立目的是獲得某個目的性狀基因的純合系進(jìn)而進(jìn)行后續(xù)培育或雜交育種,如Beattie等[16]對太平洋牡蠣(Crassostreagiga)抗夏季死亡的親本進(jìn)行選擇,通過建立家系進(jìn)行選育耐高溫太平洋牡蠣新品系,獲得了耐高溫能力顯著提高的家系;Haskin等[17]對美洲牡蠣(Crassostrea virginica)抗孢子病(MSX)能力進(jìn)行了連續(xù)4代選擇,最終使得選擇系抗該病能力比野生群體提高了 8～9倍。另一方面,家系材料具有明晰的親緣譜系關(guān)系,是進(jìn)行遺傳研究的良好素材,比如遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建、特定性狀遺傳特性的研究等都需要家系材料。群體雜交過程中,有人會質(zhì)疑雜交子代身份的真實性,建立家系可以有效保證每個家系子代的雙親遺傳物質(zhì)來源的唯一性,杜絕“交叉污染”,為遺傳研究提供可靠保障。同時,半同胞之間的差異比較能夠明確父母遺傳對子代的影響作用。

表4 各家系殼長生長速度與甲基化率Tab.4 Daily growth rate of shell length and methylation rate for all the lines

表5 生長速度與甲基化率的相關(guān)性Tab.5 The phenotype correlation coefficient between growth rate and methylation rate

3.2 幼蟲前期生長及雙親對生長勢的影響

貝類家系幼蟲早期生長性能的研究在蝦夷扇貝[15]、青蛤(Cyclina sinensis)[18]、海灣扇貝(Argopecten irradians)[19]、菲律賓蛤仔[14]等種類中已有報道。在自交家系研究中,家系幼蟲在附著前期一般沒有生長速度上的顯著差異,但楊鳳等[18]在青蛤的研究中發(fā)現(xiàn)有些家系前期的生長速度與其他家系存在顯著差異,認(rèn)為幼蟲浮游期間生長速度主要是受母本影響,這種差異可能主要來自于母本。貝類雜交研究中,鄭懷平等[19]對海灣扇貝雜交家系與自交家系生長的比較結(jié)果表明,雜交家系在 3日齡開始表現(xiàn)出顯著的雜種優(yōu)勢而且隨時間的推進(jìn)逐步放大。本研究結(jié)果表明,雜交組在浮游期間殼長生長表現(xiàn)出雜種優(yōu)勢,其日平均生長速度為6.231 μm/d,比BC組提高14.77 %,與兩個自交組相比均有顯著性提高。自交組 BC與 CD為同父異母半同胞,它們之間卵徑大小、孵化率和生長速度都沒有顯著性差異,說明不同的母本沒有對后代造成生長發(fā)育上的顯著差異。雜交組AB與自交組BC為同母異父半同胞,與CD組沒有親緣關(guān)系,雜交組卵徑、孵化率均比自交組小但是差異不顯著,而在生長速度上卻產(chǎn)生了極顯著的優(yōu)勢,說明雜交組生長速度的主要影響因素來自于父本,雜交種在浮游前期就表現(xiàn)出顯著的雜種優(yōu)勢,這與鄭懷平等[19]研究海灣扇貝的結(jié)果相似。本研究中,可以認(rèn)為雜種的父本蝦夷扇貝影響了它們的前期生長,但雙親遺傳物質(zhì)進(jìn)行了怎樣的重組融合,之后發(fā)育過程中又以什么樣的方式在子代中傳遞來影響了子代,還需要作者今后在分子生物學(xué)方面做更多的研究。

3.3 殼長生長與DNA甲基化的相關(guān)性

除了顯性效應(yīng)、超顯性效應(yīng)、上位效應(yīng)、加性效應(yīng)、互補效應(yīng)等,基因的差異表達(dá)也成為雜種優(yōu)勢形成原因的一個解釋。對家畜、農(nóng)作物的一些研究表明 F1代基因表達(dá)的變化決定了雜種的形狀表現(xiàn),而DNA甲基化作為基因調(diào)控機制之一可能會導(dǎo)致基因的差異表達(dá),所以DNA甲基化在雜種優(yōu)勢機理研究中具有重要的意義。

很多有關(guān)動植物的研究認(rèn)為雜種優(yōu)勢與DNA甲基化有一定的關(guān)系。Tsaftaris等[20-21]對玉米雜交種及其親本DNA甲基化程度進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)兩個親本胞嘧啶甲基化比例分別為28.3 %和31.4 %,雜交子代為 27.4 %,基因表達(dá)活性與 DNA甲基化顯著相關(guān);蔣曹德等[8]研究豬DNA甲基化與雜種優(yōu)勢關(guān)系時發(fā)現(xiàn),有 3種甲基化差異類型與雜種表現(xiàn)相關(guān);Xiong等[11]對水稻的研究發(fā)現(xiàn),某些特異位點上的甲基化程度改變會對雜種優(yōu)勢產(chǎn)生顯著影響。貝類雜種優(yōu)勢的研究中,尚未涉及 DNA甲基化角度的研究,作者實驗室嘗試從DNA甲基化角度研究雜種優(yōu)勢,現(xiàn)已經(jīng)取得了一些實驗結(jié)果。本研究運用MSAP技術(shù)分析了扇貝雜交家系組和自交家系組DNA甲基化水平差異及幼蟲早期生長性能與其相關(guān)性,其結(jié)果為雜交使得DNA甲基化比例降低,DNA甲基化與生長速度顯著負(fù)相關(guān)。結(jié)合本實驗室雜交扇貝群體研究結(jié)果,蝦夷扇貝、櫛孔扇貝的總甲基化率約為32.79%、24.13%[22],可以認(rèn)為甲基化率的降低確實發(fā)生在雜交效應(yīng)上,雜種優(yōu)勢與甲基化率具有一定的關(guān)系,與蔣曹德[8]、Xiong[11]等研究結(jié)果一致。初步認(rèn)為,本雜交組合后代DNA甲基化的改變可能調(diào)控了某些基因的差異表達(dá),在表觀性狀上表現(xiàn)的雜種優(yōu)勢為生長速度的加快。當(dāng)然,雜種優(yōu)勢是一種非常復(fù)雜的遺傳學(xué)效應(yīng),作者不能依此斷定DNA甲基化水平的改變必然產(chǎn)生種優(yōu)勢,它們之間的聯(lián)系還需要更多分子生物學(xué)方面的研究來闡釋,以提升雜種優(yōu)勢機理的理論研究水平,讓更多的雜種優(yōu)勢為人類應(yīng)用。

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