(山東省海水養(yǎng)殖研究所,山東 青島,266071)

抗生素的發(fā)現(xiàn)促進了人類醫(yī)學的巨大進步,大量的抗生素的廣泛應用,使動物養(yǎng)殖業(yè),尤其是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)不斷受益。從生產(chǎn)實踐來看,使用傳統(tǒng)的消毒劑和抗生素并不能有效地防止疾病的發(fā)生[1],而且還可能導致抗藥性菌株的出現(xiàn)[2],其抗藥性基因還可轉(zhuǎn)移給從未暴露于抗生素的其他菌株,因此迫切需要減少抗微生物藥物的使用[3-4]。

益生菌是一種活的微生物,能維持腸道平衡而有效地影響宿主動物,目前也稱為微生態(tài)調(diào)節(jié)劑(Microecological modulator)、EM 菌制劑(Efficient microbe agent)等[5],現(xiàn)代的定義傾向為:在微生態(tài)理論指導下,調(diào)整微生態(tài)失調(diào),保持微生態(tài)平衡,增強新陳代謝,促進生長發(fā)育,從而提高宿主的健康水平或增進健康狀態(tài)的微生物及其代謝產(chǎn)物和生長促進物質(zhì)[6]。益生菌菌種主要有芽孢桿菌屬(Bacillusspp.)、乳酸菌屬(Lactobacillusspp.)、弧菌屬(Vibriospp.)、和酵母(Saccharomycesspp.)等。

Kozasa首次將微生態(tài)制劑應用于水產(chǎn)養(yǎng)殖,采用1株從土壤中分離的芽孢桿菌(Bacillus toyoi)處理日本鰻鱺(Anguilla japonica),降低了由愛得華氏菌引起的死亡,之后微生態(tài)制劑的研究便得到迅速發(fā)展[7];Gatesoupe[8]加乳酸細菌于輪蟲的培養(yǎng)基中,并用該輪蟲作為大菱鲆仔魚的餌料,當仔魚被病原弧菌感染時,能有效降低其死亡率; Moriarty[9]在印度尼西亞蝦場的研究表明,在沒有使用芽孢桿菌的蝦池中,80 d之內(nèi)蝦因發(fā)光弧菌病而死亡,而使用幾株芽孢桿菌培養(yǎng)物的蝦池,160 d之后蝦沒有任何問題;Rengpipat等[10]以添加芽孢桿菌S11的餌料飼育斑節(jié)對蝦后期幼體100 d之后,以病原菌哈氏弧菌(Vibrio harveyi)浸浴感染,10 d之后所有芽孢桿菌S11 處理組的對蝦100 %存活,而對照組的成活率只有 26%。Gildberg[11]等從大西洋鱈(Gauds morhua)腸道中分離到的一株乳酸桿菌并制成凍干粉添加到該鱈魚的飼料中喂食魚苗,結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌可以提高對鰻弧菌產(chǎn)生疾病的抵抗力。

作者以大菱鲆(Scophthalmus maximus)幼魚為研究對象,旨在探討大菱鲆苗種培育養(yǎng)殖生產(chǎn)實踐中,在飼料中直接添加單一及復合種類的常見益生菌對大菱鲆幼魚消化道酶活力和腸道菌群的變化,從而為益生菌在大菱鲆養(yǎng)殖中的直接應用提供理論依據(jù)。本次實驗選用的芽孢桿菌種類為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)和地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis),選用的乳酸菌種類為嗜酸乳酸菌(Lactobacillus acidophilus)和雙歧桿菌(Bifidobacterium inopinatum)。

1 材料與方法

1.1 實驗用魚及分組

實驗于2008年4月15日～6月15日在山東省海水養(yǎng)殖研究所中試基地實驗室進行,實驗用大菱鲆體質(zhì)健康,體長 5～6cm。在海水良種繁育中心實驗室暫養(yǎng)一周后隨機分為8組:對照組、枯草芽孢桿菌組、地衣芽孢桿菌組、地衣芽孢桿菌+枯草芽孢桿菌(質(zhì)量比為1∶1)、嗜酸乳酸菌組、雙歧桿菌組、嗜酸乳酸菌+雙歧桿菌(質(zhì)量比為1∶1)組、地衣芽孢桿菌+枯草芽孢桿菌+嗜酸乳酸菌+雙歧桿菌(質(zhì)量比為1∶1∶1∶1)組。每組3個重復,每個重復100尾魚,養(yǎng)殖在容積1 m3循環(huán)水水族箱中,養(yǎng)殖密度100 尾/ m3。

1.2 實驗用飼料

基礎飼料以魚粉、豆粕為主要原料配制飼料,飼料原料經(jīng)粉碎過60 目篩,用雙螺桿壓條機擠壓出直徑分別為2 mm和3 mm兩種粒徑的飼料,在90℃熟化30 min后,于陰涼處晾干,剪切成3 mm長的顆粒貯存于-20℃的冰柜中待用。

8組實驗組除分別添加了不同菌種及比例的菌液外,各種營養(yǎng)成分均相同(實驗中枯草芽孢桿菌及地衣芽孢桿菌單菌菌液購自山東濟南大吉飼料有限公司,菌含量不小于 1010CFU/mL;嗜酸乳酸桿菌及雙歧桿菌干粉購自江蘇沃爾德實業(yè)有限公司,菌含量不小于1010CFU/g)。芽孢桿菌屬能耐高溫高壓[12],而乳酸菌屬在 50℃可以保持 100%的存活率[13],所以實驗組采用攪拌法,把菌液直接加入飼料中,制成濕顆粒,于 40℃烘至半干,然后在-20℃冰箱保存,以備投喂。每克飼料約含菌 3.0×109個/g干質(zhì)量。

日投喂量為體質(zhì)量的5%～10%,分2次投喂。

1.3 飼養(yǎng)管理

分組后的實驗用魚養(yǎng)殖在循環(huán)水水族箱中,每天換水 2次,每次換水 1/2。每天投餌兩次,分別為7:30～8:30,16:30～17:30,投喂量以飽食為標準。每箱魚投喂的飼料于投喂前和投喂后稱質(zhì)量。每次投喂前先吸取糞便,投喂后吸取殘餌,將殘餌過濾烘干保存,以備計算攝食量。飼養(yǎng)條件恒定(水溫17℃±1℃,鹽度32±0.2),實驗共進行60 d。

1.4 腸道菌群檢測

養(yǎng)殖中期(第30天)和后期(第60天)測定對大菱鲆腸道弧菌及細菌總數(shù)。測定方法參考李繼秋[14]的方法,從每水族箱中隨機取10尾大菱鲆,用1/10000 的MS222 麻醉后,無菌操作將大菱鲆解剖,去除腸道糞便,置于滅菌的玻璃勻漿器中,加入10 mL無菌生理鹽水勻漿。再依次以10倍系列稀釋,選擇合適的稀釋度測弧菌以及細菌總數(shù)。養(yǎng)殖實驗后期,收集魚糞便測弧菌以及細菌總數(shù),測定方法同腸道細菌測定。細菌總數(shù)和弧菌數(shù)分別通過涂布2216E和 TCBS培養(yǎng)基測定,用N表示,單位為cfu/ind腸道,并用lgN處理。

1.5 血液免疫指標測定

實驗結(jié)束后饑餓24 h。用1 mL無菌注射器,按照血淋巴與抗凝劑(10 mmol/L EDTA·Na2,450 mmol/L NaCl,10 mmol/L KCl,10 mmol/L HEPES,pH7.3,850 mOsm/kg)體積比為 1∶2的比例,每個養(yǎng)殖箱隨機取 3尾魚,從心臟部位進行取血,進行血細胞總數(shù)計數(shù)。

用于其余血液指標測定的采樣方法為:用 1mL的無菌注射器自對魚心臟抽取血液,每個養(yǎng)殖箱隨機取20尾魚血液合并置于無菌離心管中4℃靜置過夜后,3 000 r/min離心 10 min,取上層血清置于-80℃超低溫冰箱保存待測。

酚氧化酶活性測定:采用Hernández-López等[15]的方法。以實驗條件下,每 mL血清每 min 吸光值增加0.001,定義為1個酶活性單位(U)。

血清溶菌酶活性通過濁度比色法測定。以實驗條件下,每mL血清每min吸光值減少0.001為1個酶活性單位(U)。

血清蛋白濃度、SOD和總抗氧化力使用南京建成試劑盒測定。血清中 SOD酶活性單位定義為每mL血清中SOD 抑制率達到50% 所對應的SOD量為1個酶活性單位?？偪寡趸钚詥挝欢x為37℃時,每mL血清每分鐘吸光度增加0.001為1個酶活性單位。

1.6 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS12.0軟件進行單因素方差分析。當差異顯著時,用Duncan檢驗法進行多重比較,差異顯著度P為0.05。

2 實驗結(jié)果

2.1 腸道內(nèi)細菌總數(shù)和弧菌總數(shù)

各實驗組及對照級養(yǎng)殖中期(30 d)和養(yǎng)殖后期(60 d)腸道細菌總數(shù)和弧菌總數(shù)見表1。

表1 大菱鲆養(yǎng)殖中期和后期腸道細菌總數(shù)和弧菌總數(shù)Tab.1 Effects of different dietary probiotics on total bacterium counts (TBC) and Vibrios bacterium counts (VBC) in intestine tract of Scophthal musmaximus n=3;X ±SE;lgCFU/ind

與對照組相比,整個實驗過程中,添加了益生菌的各實驗組對大菱鲆幼魚腸道中的總菌數(shù)均無顯著影響(P＞0.05),但在中期和后期均顯著降低了大菱鲆幼魚腸道弧菌數(shù)(P<0.05);但實驗后期大菱鲆幼魚腸道弧菌數(shù)與中期相比沒有顯著變化(P<0.05)。

2.2 對大菱鲆幼魚免疫力的影響

免疫指標與對照組相比,添加益生菌能不同程度提高大菱鲆幼魚的血細胞數(shù)、血清蛋白濃度、酚氧化酶活力(表2)及溶菌酶、超氧化物歧化酶及總抗氧化力(表3)。

表2 飼料中益生菌對大菱鲆免疫功能的影響ITab.2 Effects of different dietary probiotics on immunity of Scophthal musmaximus n=3;X ±SE

實驗數(shù)據(jù)表明,添加益生菌的實驗組均能使大菱鲆幼魚的血細胞數(shù)顯著增加(P＜0.05)。復合益生菌能使大菱鲆幼魚的血清蛋白濃度顯著提高(P＜0.05),其中,添加單一及復合乳酸菌的3個實驗組和添加地衣芽孢桿菌+枯草芽孢桿菌+嗜酸乳酸菌+雙歧桿菌的實驗組與對照組相比血清蛋白濃度顯著提高(P＜0.05),添加單一及復合芽孢桿菌的 3個實驗組與對照組相血清蛋白濃度略有提高,但差異不顯著(P＞0.05),說明單一及復合乳酸菌在提高大菱鲆幼魚血清蛋白濃度方面起主要作用。

各實驗組均能顯著提高大菱鲆血清中酚氧化酶活力(P＜0.05),其中添加單一及復合乳酸菌的 3個實驗組和添加地衣芽孢桿菌+枯草芽孢桿菌+嗜酸乳酸菌+雙歧桿菌的實驗組與對照組相比,差異更為明顯。

各實驗組均能顯著提高大菱鲆幼魚血清中溶菌酶活力(P＜0.05),其中添加復合芽孢桿菌和復合乳酸菌的實驗組在提高大菱鲆幼魚血清中溶菌酶活力方面比添加單一菌種效果更為明顯,添加地衣芽孢桿菌+枯草芽孢桿菌+嗜酸乳酸菌+雙歧桿菌復合益生菌的實驗組,效果非常顯著,比對照組提高了126.7%。

添加了嗜酸乳酸菌+雙歧桿菌的實驗組和添加了地衣芽孢桿菌+枯草芽孢桿菌+嗜酸乳酸菌+雙歧桿菌復合益生菌的實驗在提高大菱鲆幼魚血清中超氧化物歧化酶活力方面與對照組相比差異更為顯著(P＜0.05)。

各實驗組均能顯著提高大菱鲆幼魚血清的總抗氧化力(P＜0.05),各實驗組之間差異不顯著(P＞0.05)。

表3 飼料中益生菌對大菱鲆免疫功能的影響IITab.3 Effects of different dietary probiotics on immunity of Scophthal musmaximus n=3;X ±SE

3 討論

本實驗中選用的芽孢桿菌菌種為枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌。芽孢桿菌可用作飼料添加劑,是一種需氧的非致病菌,以內(nèi)孢子的形式存在于腸道微生物群落中,能使腸內(nèi)的 pH下降,氨濃度降低,促進淀粉、纖維素等分解。芽孢桿菌耐酸、耐鹽、耐高溫(100℃)和擠壓,是一種比較穩(wěn)定的益生菌。本實驗中選取中的乳酸菌菌種為嗜酸乳酸菌和雙歧桿菌。乳酸菌能分解糖類產(chǎn)生乳酸,通過酸化作用提高動物對飼料的消化效果,厭氧或兼性厭氧,不能形成芽孢,穩(wěn)定性較低。雙歧桿菌制劑可抑制革蘭氏陰性菌,減少腸桿菌細胞壁內(nèi)毒素進入魚體,保護肝臟。

本實驗中,與對照組相比,添加了益生菌的各實驗組對大菱鲆幼魚腸道中的總菌數(shù)均無顯著影響,但都顯著降低了大菱鲆幼魚腸道中的弧菌總數(shù)。分析其作用機制,益生菌可以通過與有害微生物競爭營養(yǎng)物質(zhì)及生存和繁殖空間,抑制有害微生物生長,從而維持機體微生態(tài)平衡。郭志勛[16]等在飼料中添加芽孢桿菌能夠促進凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)的生長及免疫力,這些研究結(jié)果均與本研究結(jié)果相似。

劉克林等[17]采用有益芽孢桿菌制成的微生態(tài)添加劑飼喂鯉魚苗 100 d后發(fā)現(xiàn),實驗組免疫器官胸腺、脾臟生長發(fā)育較對照組迅速、成熟快,電鏡觀察免疫器官內(nèi)T、B淋巴細胞較對照組成熟快、數(shù)量增多,產(chǎn)生抗體增多,免疫功能增強。

在本實驗中,益生菌對大菱鲆血細胞數(shù)、溶菌酶、血清蛋白濃度、血清酚氧化酶、血清超氧化歧化酶和血清總抗氧化力都有不同程度的提高。說明飼料中添加益生菌可以提高大菱鲆非特異性免疫能力。

復合益生菌組有比單一益生菌組更高的血清蛋白濃度及溶菌酶活力,與 Salinas等[18]在烏頰魚(Sparus aurataL.) 中發(fā)現(xiàn)的芽孢桿菌和乳酸菌的復合菌比單一的芽孢桿菌和乳酸菌有更好的免疫效果相似。

可見益生菌可以作為良好的免疫激活劑,通過激發(fā)機體的體液免疫和細胞免疫來增強機體免疫機能。其作用機理可能是通過細菌本身或細胞壁成分刺激非特異性免疫系統(tǒng)使其發(fā)揮作用,從而提高動物免疫力[19]。多種來自細菌細胞壁的成分可作為免疫增強劑已在甲殼動物中得到證實[20-22]

本實驗發(fā)現(xiàn)添加單一及復合乳酸菌的3個實驗組和添加地衣芽孢桿菌+枯草芽孢桿菌+嗜酸乳酸菌+雙歧桿菌的實驗組與對照組相比血清蛋白濃度顯著提高(P＜0.05),添加單一及復合芽孢桿菌的 3個實驗組與對照組相血清蛋白濃度略有提高,但差異不顯著(P＞0.05),說明飼料中添加乳酸菌在提高大菱鲆幼魚血清蛋白濃度方面起主要作用。具體作用機理有待于進一步實驗研究。

4 結(jié)論

在本實驗條件下,飼料中添加益生菌,可通過競爭作用機制,維持大菱鲆幼魚腸道細菌平衡,顯著降低大菱鲆幼魚腸道中的弧菌總數(shù);飼料中添加了益生菌的實驗組與對照組相比,各項免疫指標均顯著提高,且復合益生菌的添加效果好于單一益生菌。這對于大菱鲆飼料中益生菌的添加有重要的指導作用。對于不同養(yǎng)殖條件下,益生菌的添加比例及效果還有待進一步研究。

[1]Balcázar J L,Blas I de,Ruiz-Zarzuela I,et al.Review:The role of probiotics in aquaculture[J].Vet Microbiol,2006,114:173-186.

[2]Gatesoupe F J.The use of probiotics in aquaculture[J].Aquaculture,1999,180:147-165.

[3]Bruno G G,Ana R,James F T.The use and selection of probiotic bacteria for use in the culture of larval aquatic organisms[J].Aquac,2000,191 (1/3):259-270.

[4]Rosalie A S.International harmonization of antimicrobial sensitivity determination for aquaculture drugs[J].Aquac,2001,196(3 /4):277-288.

[5]沈德中.污染環(huán)境的生物修復[M].北京:化學工業(yè)出版社,2002:1-356.

[6]Otles S,Cagindi O,Akcicek E.Probiotics and health[J].Asian Pac J Cancer Prev,2003,4 (4):369-372.

[7]Kozasa M.Toyocerin (Bacillus toyoi) as growth promotor for animal feeding[J].Microbiol Aliment Nutr,1986,4:121-135.

[8]Gatesoupe F J.Lactic acid bacteria increase the resistance of turbot larvae(Scophthalmus maximus) against pathogenic Vibrio[J].Aquat Living Resour,1994,7:277-282.

[9]Moriarty D.Control of luminous Vibrio species in penaeid aquaculture ponds[J].Aquaculture,1998,164:351-358.

[10]Rengpipat S,Phianphak W,Piyatiratitivorakul S,et al.Effect of a probiotic bacterium on black tiger shrimp(Penaeus monodon) survival and growth[J].Aquaculture,1998,167:301-313.

[11]Gildberg A,Mikkelsen H,Sandarker E,et al.Probiotic effect of latic acid bacterial in the feed on growth and survival of fry of Atlantic cod (Gadus morhua) [J].Hydrobiologia,1997,352:279-285.

[12]王福強.牙鲆腸道益生菌的分離鑒定及其應用研究[D].北京:中國農(nóng)業(yè)大學,2004,81-86.

[13]周東明,程林春.益生素中菌株對溫度、pH值及抗生素的耐受性試驗[J].飼料工業(yè),1995,16(11):34-36.

[14]李繼秋.對蝦微生態(tài)制劑的研制與應用[D].青島:中國海洋大學,2003.

[15]Hernández López J,Gollas Galvan T,Vargas Albores F.Activation of the prophenoloxidase system of the brown Penaeus californiensis Holmes [J].Comp Biochem Physiol,1996,113C:61-66.

[16]郭志勛,李卓佳,林黑著,等.芽孢桿菌對凡納濱對蝦生長及免疫的影響[M]//王衍亮.可持續(xù)水產(chǎn)養(yǎng)殖—資源,環(huán)境,質(zhì)量.北京:海洋出版社,2004:121-126.

[17]劉克林,何明清.益生菌對鯉魚免疫功能影響的研究[J].飼料工業(yè),2000,6:13-14.

[18]Salinas I,Cuesta A,Esteban M.Dietary administration of Lactobacillus delbrùeckii and Bacillus subtilis,single or combined,on gilthead seabream cellular innate immune responses[J].Fish Shellfsh Immunol,2005,19:67-77.

[19]Rengpipat S,Rukpratanporn S,Piyatiratitivorakul S,et al.Immunity enhancement on black tiger shrimp(Penaeus monodon)by a probiont bacterium[J].Aquaculture,2000,191:271-288.

[20]譚北平,周歧存,鄭石軒,等.β-1,3/1,6葡聚糖制劑對凡納濱對蝦生長及免疫力的影響[J].高技術(shù)通訊,2003,13(5):73-77.

[21]王秀華,宋曉玲,黃倢.肽聚糖制劑對南美白對蝦體液免疫因子的影響[J].中國水產(chǎn)科學,2004,11(1):26-30.

[22]Chang C F,Su M S,Chen H Y,et al.Dietary ?-1,3-glucan effectively improves immunity and survival of(Penaeus monodon)challenged with white spot syndrome virus[J].Fish Shellfsh Immunol,2003,15:297-310.