孫 彥，郭校民，周 禾

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院草業(yè)科學(xué)系 草業(yè)科學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

白穎苔草(Carexrigescens)別名小羊胡子草，隸屬于莎草科苔草屬。喜冷涼氣候，耐寒力強(qiáng)，且耐干旱、耐瘠薄，能適應(yīng)多種土壤類(lèi)型。該草葉綠、纖細(xì)，外形整齊美觀，是很好的疏林游樂(lè)草坪植物，我國(guó)北方地區(qū)多用作觀賞草坪和裝飾草坪，也可用作高速公路、鐵路兩旁等優(yōu)良的地被植物以及人流量不多的公園、庭院、街道、花壇等綠化材料[1]。

在植物細(xì)胞內(nèi)有一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子在熱激條件下可以激活熱激基因的表達(dá)，被稱(chēng)為熱激轉(zhuǎn)錄因子(HSF)[2]。隨著對(duì)植物逆境響應(yīng)研究的逐漸深入，熱激因子參與植物環(huán)境脅迫響應(yīng)的證據(jù)越來(lái)越多[3-7]。迄今,研究人員已在多種生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了不同種類(lèi)的HSF,并通過(guò)多種方法探明了HSF分子上的大部分重要結(jié)構(gòu),同時(shí)對(duì)這些重要結(jié)構(gòu)的定位、空間構(gòu)象、功能及調(diào)節(jié)進(jìn)行了充分的研究[8-10]。

對(duì)于草坪草相關(guān)熱激轉(zhuǎn)錄因子的研究報(bào)道很少，黨衛(wèi)玲[11]已完成白穎苔草熱激轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆，本研究進(jìn)行白穎苔草熱激轉(zhuǎn)錄因子(HSF1)真核表達(dá)載體的構(gòu)建，以期為進(jìn)一步研究HSF1在熱激蛋白(HSP)合成及提高植物耐熱性中的作用和培育耐熱植物新品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株和克隆載體 用于轉(zhuǎn)化真核生物的農(nóng)桿菌LBA4404菌株，用于克隆和載體構(gòu)建的大腸桿菌DH5α菌株、CrHsf全長(zhǎng)cDNA的大腸桿菌菌液及真核表達(dá)載體PBI 121(圖1)均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所保存?？寺≥d體Pmd-18T由TaKaRa公司提供。載體在pUC18載體的多克隆位點(diǎn)處的Xba I和Sal I識(shí)別位點(diǎn)之間插入了EcoR V識(shí)別位點(diǎn)，用EcoR V進(jìn)行酶切反應(yīng)后，再在兩側(cè)的3′端添加“T”而成。因大部分耐熱性DNA聚合酶反應(yīng)時(shí)都有在PCR產(chǎn)物的3′端添加一個(gè)“A”的特性，使PCR產(chǎn)物的連接、克隆效率大大提高。pMD-18T載體圖譜如圖2。

圖1 真核表達(dá)載體PBI 121

圖2 pMD-18T載體圖譜

1.1.2溶液的配制 10×TAE：Tris 48.4 g，冰醋酸11.42 mL，0.5 mol·L-1EDTA(pH值8.0)20 mL，加水定容至1 L。

6×DNA Loading Buffer：0.25%溴酚藍(lán)，40%甘油水溶液，4 ℃保存。

LB培養(yǎng)基(1 L)：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，調(diào)pH值至7.0(固體培養(yǎng)基每升加10 g瓊脂粉)，高壓滅菌20 min。

YEB培養(yǎng)基：牛肉浸膏5 g，酵母提取物1 g，胰化蛋白胨5 g，蔗糖5 g，氨芐青霉素(Amp)貯液(100 mg·mL-1)即100 mg Amp溶于1 mL蒸餾水中，-20 ℃保存。

溶液 Ⅰ：50 mmol·L-1Tris·HCl(pH值7.5)，10 mmol·L-1EDTA(pH值8.0)，高壓滅菌。

溶液Ⅱ：0.2 mol·L-1NaOH，1% SDS，分別配制0.4 mol·L-1NaOH和2% SDS的貯液，使用時(shí)以1∶1比例混合。

溶液Ⅲ：1.32 mol·L-1KAc(pH值4.8)，高壓滅菌。

1.2質(zhì)粒PMD-CR的構(gòu)建

1.2.1PCR擴(kuò)增

CRHSF 全長(zhǎng)cDNA 的大腸桿菌菌液，200 mL PCR管中混合，共25.0 μL，組分如下：ddH2O 17.75 μL，10×PCR buffer(含Mg2+)2.5 μL，dNTP(10 mmol·L-1each)0.5 μL，Primer CP1(10 μmol·L-1)1.0 μL，Primer CP2(10 μmol·L-1)1.0 μL菌液2.0 μL，Taq DNA(5 U·μL-1)0.25 μL?；旌暇鶆蚝蟀聪铝袟l件進(jìn)行反應(yīng)：94 ℃ 3 min后，94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s,進(jìn)行40循環(huán)后,72 ℃ 5 min。

1.2.2PCR產(chǎn)物的回收和純化

1)PCR產(chǎn)物在2.0%的瓊脂糖凝膠上電泳，待回收的DNA 片段經(jīng)電泳分離后，從瓊脂糖凝膠上切下所需的DNA片段，放在1.5 mL離心管中，稱(chēng)取質(zhì)量。

2)加入3倍體積的溶膠液PN，50 ℃水浴放置10 min，期間不斷溫和地翻轉(zhuǎn)離心管，直至瓊脂糖凝膠完全溶解。

3)待膠溶液冷卻至室溫后，將其加入一個(gè)吸附柱CA2中，13 000 r·min-1，離心30 s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放入收集管中。

4)向吸附柱中加入700 L漂洗液PW，13 000 r·min-1，離心30 s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放入收集管中。

5)向吸附柱中加入500 L漂洗液PW，13 000 r·min-1，離心30 s，倒掉收集管中的廢液，13 000 r·min-1，離心2 min，室溫干燥數(shù)分鐘，使漂洗液中的乙醇揮發(fā)完全。

6)將吸附柱放到一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加適量洗脫緩沖液EB，室溫放置2 min，13 000 r·min-1，離心1 min，收集DNA溶液。此溶液即為回收的片段。

1.2.3連接反應(yīng) 將上一步回收的PCR產(chǎn)物直接與pMD-18T載體連接[按(3～9)∶1的摩爾比連接]，反應(yīng)體系：pMD-18T Vector (50 ng·μL-1)1.0 μL，PCR 產(chǎn)物 4.0 μL，Ligation Solution Ⅰ 5.0 μL，共10.0 μL?；靹蚝螅?6 ℃連接過(guò)夜，-20 ℃保存。

1.2.4大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備(CaCl2法) 挑單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。取500 μL菌液加到50 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃震蕩培養(yǎng)2～3 h，至OD600值為0.3～0.5。冰浴20～30 min，9 000 r·min-1，4 ℃離心2 min，收集菌體。用預(yù)冷的20 mL 80 mmol·L-1CaCl2懸浮。冰浴20～30 min，9 500 r·min-1，4 ℃離心2 min，收集菌體。再用預(yù)冷的20 mL 80 mmol·L-1CaCl2懸浮，菌液置于冰浴中備用(12～14 h內(nèi)轉(zhuǎn)化效率最高)，或者加入20%甘油，每管以200 μL分裝于1.5 mL離心管中，液氮速凍后，保存于-70 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化 在超凈臺(tái)內(nèi)將5 μL連接產(chǎn)物加入到200 μL的DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，混勻，置冰上30 min。42 ℃熱激90 s，冰浴5 min。加入800 μL LB液體培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)1 h。3 500 r·min-1，離心5 min，棄去800 μL上清液，剩余物涂板于含Ampicillin(100 g·mL-1)的LB平板上。37 ℃避光培養(yǎng)過(guò)夜，第2天觀察結(jié)果。

1.2.6菌液PCR 隨機(jī)挑取克隆單菌落接種于含有相應(yīng)抗生素的1 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。與第1次PCR擴(kuò)增相同的引物對(duì)和PCR反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增。按下列方法準(zhǔn)備反應(yīng)體系：在200 μL PCR管中混合，共25.0 μL如下組分：ddH2O 17.75 μL，10×PCR buffer(含Mg2+)2.5 μL，dNTP(10 mmol·L-1)0.5 μL，Primer CP1(10 μmol·L-1)1.0 μL，Primer CP2(10 μmol·L-1)1.0 μL，菌液 2.0 μL，Taq DNA酶(5 U·μL-1)0.25 μL。混合均勻后按下列條件進(jìn)行反應(yīng)：94 ℃ 3 min后，94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，40循環(huán)后，72 ℃ 5 min。

1.2.7質(zhì)粒提取(堿裂解法) 將陽(yáng)性(PCR擴(kuò)增后，顯示有目的片斷的菌即是陽(yáng)性克隆，否則就是陰性)克隆單菌落接種于含有相應(yīng)抗生素的5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。取3 mL 菌液，12 058 r·min-1，離心60 s，收集菌體。加100 μL溶液Ⅰ(50 mmol·L-1EDTA,10 mmol·L-1Tris-HCl,pH值7.5)，輕輕顛倒混勻。加200 μL新配制的溶液Ⅱ(1%SDS,0.2 mol·L-1NaOH)，顛倒混勻。待溶液澄清后立即加入預(yù)冷的150 μL溶液Ⅲ(1.32 mol·L-1醋酸鉀,pH值4.8)，混勻后冰上放置5～10 min。12 058 r·min-1，離心10 min，棄去沉淀。加1倍體積異丙醇，室溫放置5 min。12 058 r·min-1，離心10 min。沉淀用70%乙醇洗滌2次，晾干沉淀。用50 μL含RNase A(20 μg·mL-1)的TE緩沖液溶解質(zhì)粒DNA，37 ℃消化30 min，-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｔ撡|(zhì)粒命名為PMD-CR。

1.3表達(dá)載體的構(gòu)建

1.3.1酶切質(zhì)粒pMD-CR和表達(dá)載體PBI 121酶切的反應(yīng)體系：pMD-CR(orPBI 121)8 μL，Xba I 1 μL，BamH I 1 μL，10×Buffer K 1 μL，ddH2O 9 μL， 37 ℃保溫6 h，回收目的片段。

1.3.2將酶切的目的基因片段和載體片段進(jìn)行連接 連接的反應(yīng)體系：PBI 121 3 μL,PMD-CR 9 μL,10× Buffer 2 μL,Ligase 1 μL,ddH2O 5 μL,共20 μL。16 ℃下保溫16 h，連接產(chǎn)物在-20 ℃保存或用于轉(zhuǎn)化。

1.3.3農(nóng)桿菌感受態(tài)的制備 挑取根癌農(nóng)桿菌單菌落于3 mL的含利福平50 μg·mL-1的YEB液體培養(yǎng)基，28 ℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。取過(guò)夜培養(yǎng)菌液500 μL接種于50 mL YEB(含相應(yīng)抗生素)液體培養(yǎng)基中，28 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.5。5 000 r·min-1，離心5 min。加10 mL 0.15 mmol·L-1NaCl懸浮農(nóng)桿菌細(xì)胞，5 000r·min-1,離心5 min。1 mL預(yù)冷的20 mmol·L-1CaCl2懸浮細(xì)胞，冰浴，24 h內(nèi)使用，或分裝成每管200 μL，液氮中速凍1 min，置-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化及鑒定 取200 μL感受態(tài)細(xì)胞，加入1 μg構(gòu)建好的質(zhì)粒DNA，液氮中速凍1 min，37 ℃水浴5 min，然后加入1 mL YEB培養(yǎng)基，28 ℃慢速振蕩培養(yǎng)4 h。1 000 r·min-1，離心30 s，棄上清，加入0.1 mL YEB培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞，涂布于含有100 μg·mL-1Kna和50 μg·mL-1Rif的YEB平板上，28 ℃培養(yǎng)約48 h。挑取平板上長(zhǎng)出的單菌落，接種于YEB液體培養(yǎng)液(含有100 μg·mL-1Kna和50 μg·mL-1Rif)中，28 ℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。小量提取質(zhì)粒DNA，以質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定。陽(yáng)性質(zhì)粒命名為PBICR，并將其測(cè)序。

2 結(jié)果與討論

2.1含有酶切位點(diǎn)CrHsf開(kāi)放閱讀框片段的獲得 以實(shí)驗(yàn)室的CrHsf 全長(zhǎng)cDNA 的大腸桿菌菌液為材料，以 Primer CP1，Primer CP2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖電泳檢測(cè)擴(kuò)增，擴(kuò)增的DNA片段與預(yù)期的1 000 bp大小一致(圖3)。

圖3 CrHsf全長(zhǎng)cDNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2重組質(zhì)粒PMD-CR的構(gòu)建及酶切結(jié)果 用PCR產(chǎn)物回收試劑盒對(duì)cDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，然后與克隆載體質(zhì)粒PMD-18T進(jìn)行連接，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。挑取白色菌株做PCR擴(kuò)增，提取質(zhì)粒，連接后的質(zhì)粒命名為PMD-CR。對(duì)質(zhì)粒PMD-CR進(jìn)行BamHⅠ和XbaⅠ雙酶切，約1 000 bp處即為目的基因片段(圖4)。結(jié)果證明，酶切后獲得了預(yù)期目的基因片段。

2.3表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定 對(duì)植物表達(dá)載體PBI 121進(jìn)行XbaⅠ/BamHⅠ雙酶切，大于2 000 bp的即為載體片段(圖5)。分別對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行回收，把目的基因片段定向克隆到植物表達(dá)載體PBI121上，連接構(gòu)建載體PBI 121-HSF。轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，挑取飽滿菌落進(jìn)行PCR擴(kuò)增和XbaⅠ/BamHⅠ雙酶切消化，有一段外源片段放出。經(jīng)瓊脂糖電泳，在1 000 bp處呈現(xiàn)的條帶(圖6)與質(zhì)粒PMD-CR雙酶切后的圖顯示一致，表明目的基因片段已插入植物表達(dá)載體PBI 121中，證明植物表達(dá)載體PBI-HSF構(gòu)建成功(圖7)。載體的構(gòu)建成功可以為轉(zhuǎn)基因做準(zhǔn)備，同時(shí)可以為進(jìn)一步研究HSF1基因在熱激蛋白合成及提高植物耐熱性中的作用、培育耐熱植物新品種打下一定的基礎(chǔ)。

圖4 質(zhì)粒PMD-18T的酶切結(jié)果

圖5 PBI 121酶切圖譜

圖6 PBI-HSF酶切圖譜

圖7 PBI 121-HSF構(gòu)建圖

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