潘多鋒，張?jiān)聦W(xué)，申忠寶，王建麗，張瑞博，李道明，高 超，孔福全，王 瀟，劉錄祥

(1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院草業(yè)研究所，黑龍江 哈爾濱 150086； 2.中國(guó)原子能科學(xué)研究院，北京 102413；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所 國(guó)家農(nóng)作物航天誘變技術(shù)改良中心，北京 100081)

牧草現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)體系的建立，對(duì)推動(dòng)區(qū)域牧草產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)，拉動(dòng)全國(guó)草業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展，維護(hù)國(guó)家生態(tài)安全、糧食安全和能源安全具有重要的意義。牧草品種是草業(yè)發(fā)展的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，優(yōu)良品種的選育是草業(yè)研究的主要內(nèi)容。誘變育種能突破原有基因庫(kù)的限制，誘發(fā)新基因或新的基因組合，形成有現(xiàn)實(shí)或潛在利用價(jià)值的新種質(zhì)資源[1]。目前，牧草輻射誘變育種的誘變?cè)慈砸?0Co-γ射線和太空誘變?yōu)橹鱗2-9]。近年來，我國(guó)有關(guān)離子束誘變育種的研究報(bào)道也較多[10-11]，而對(duì)于快中子輻射植物育種的研究較少[12-15]，特別是在牧草中鮮見報(bào)道?？熘凶訉儆诟邆髂芫€密度(Linear Energy Transfer，LET)照射，易產(chǎn)生難以修復(fù)的DNA雙鏈斷裂，其相對(duì)生物學(xué)效應(yīng)(Relative Biological Effectiveness，RBE)較高。本試驗(yàn)應(yīng)用14 Mev快中子輻射羊草(Leymuschinensis)、無芒雀麥(Bromusinermis)和老芒麥(Elymussibiricus)3種多年生禾本科牧草種子，對(duì)輻射后牧草種子的萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)進(jìn)行分析，旨在明確快中子輻射對(duì)3種禾草的損傷效應(yīng)特征，為牧草快中子誘變育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料 供試材料為黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院草業(yè)研究所保存的野生東北羊草、無芒雀麥和老芒麥種子。

1.2輻射處理 在中國(guó)原子能科學(xué)研究院對(duì)3種牧草種子進(jìn)行快中子輻射處理?？熘凶虞椛淠芰繛?4 Mev，劑量分別為3.60×1011、7.10×1011和3.54×1012個(gè)·cm-2(分別記作T1、T2和T3)。以同一批次相同數(shù)量未經(jīng)處理的種子作為對(duì)照。

1.3發(fā)芽試驗(yàn) 參考中華人民共和國(guó)牧草種子檢驗(yàn)規(guī)程(GB/T 2930.4-2001)進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)。將上述3種牧草處理及對(duì)照種子放在直徑9 cm的培養(yǎng)皿內(nèi)，內(nèi)鋪兩層濾紙。每處理3次重復(fù)，每重復(fù)選取50粒飽滿種子。發(fā)芽溫度16 ℃/28 ℃，12 h黑暗/12 h光照。從第1次調(diào)查發(fā)芽開始，每天調(diào)查1次直至萌發(fā)結(jié)束。3種牧草發(fā)芽統(tǒng)計(jì)時(shí)間不同，羊草從第6天開始調(diào)查發(fā)芽，發(fā)芽時(shí)間為20 d；無芒雀麥從第7天開始調(diào)查，發(fā)芽時(shí)間為14 d；老芒麥從第5天開始調(diào)查，發(fā)芽時(shí)間為12 d。發(fā)芽試驗(yàn)結(jié)束時(shí)記錄根長(zhǎng)和苗高，并計(jì)算發(fā)芽指數(shù)(GI)和活力指數(shù)(VI)，對(duì)僅胚根或胚芽突破種皮而沒有伸長(zhǎng)的種子不記錄其根長(zhǎng)或苗高。

GI=∑(Gi/Di)；

VI=GI×Ss。

式中，Gi為第i天的發(fā)芽率，Di為發(fā)芽天數(shù)[16]，Ss為幼苗高度[16]。

1.4統(tǒng)計(jì)分析 利用SPSS 11.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，Excel制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1快中子輻射對(duì)3種禾草種子發(fā)芽率的影響 輻射處理后羊草的發(fā)芽率極顯著低于對(duì)照(P<0.01)，輻射劑量越大種子發(fā)芽率越低。T1、T2和T3的發(fā)芽率依次為45.0%、31.7%和26.3%，對(duì)照為64.7%，處理T3的發(fā)芽率僅為對(duì)照的40.65%(圖1)?？熘凶虞椛浣档土藷o芒雀麥的發(fā)芽勢(shì)，其中，T3與對(duì)照和T1差異極顯著(P<0.01)。發(fā)芽率的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，低劑量輻射可提高無芒雀麥種子的發(fā)芽率(T1的發(fā)芽率是100%，對(duì)照為98.7%)，而高劑量輻射降低其發(fā)芽率(圖2)?？熘凶虞椛涮幚泶龠M(jìn)老芒麥種子的萌發(fā)，種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率都高于對(duì)照(P<0.01)，各處理和對(duì)照間差異不顯著(P>0.01)(圖3)。在本試驗(yàn)的輻射劑量范圍內(nèi)，老芒麥種子的發(fā)芽率隨著輻射劑量的增加呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢(shì)(y=-2.775x2+14.245x+75.775，R2=0.638 1)。試驗(yàn)結(jié)果表明，快中子輻射對(duì)牧草種子發(fā)芽率的影響因牧草種而異。

圖1 快中子輻射對(duì)羊草的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率的影響Fig.1 Effects of fast neutron irradiation on germination vigor and rate of Leymus chiensis seed

圖2 快中子輻射對(duì)無芒雀麥的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率的影響Fig.2 Effects of fast neutron irradiation on germination vigor and rate of Bromus inermis seed

圖3 快中子輻射對(duì)老芒麥的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率的影響Fig.3 Effects of fast neutron irradiation on germination vigor and rate of Elymus sibiricus seed

2.2快中子輻射對(duì)3種禾草種子發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)的影響 快中子輻射處理后羊草種子發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)都極顯著低于對(duì)照(P<0.01)，其變化趨勢(shì)與發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率相似，表現(xiàn)為隨輻射劑量增加而降低(圖4、圖5)。其中，處理T3的發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)降低至17.8和16.4，分別為對(duì)照的29.3%和3.7%。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明快中子輻射能降低羊草種子活力，抑制其種子萌發(fā)速度。無芒雀麥發(fā)芽指數(shù)的變化趨勢(shì)與羊草相似，除T3處理與對(duì)照差異顯著外(P<0.05),其他處理間差異均不顯著(P>0.05)。處理T1中無芒雀麥種子活力指數(shù)高于對(duì)照，T2和T3極顯著低于對(duì)照?？熘凶虞椛浜罄厦Ⅺ湴l(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)的變化趨勢(shì)相反，低劑量輻射提高老芒麥的發(fā)芽指數(shù)(T1的發(fā)芽指數(shù)為105，對(duì)照為90.4)，高輻射劑量輻射發(fā)芽指數(shù)低于對(duì)照。活力指數(shù)變化趨勢(shì)為隨輻射劑量的增加，活力指數(shù)先降低后上升，T1和T2的活力指數(shù)極顯著低于對(duì)照和T3。T3的活力指數(shù)比對(duì)照高14.5%，但差異不顯著。

圖4 快中子輻射對(duì)3種禾草的發(fā)芽指數(shù)的影響Fig.4 Effects of fast neutron irradiation on germination indexes of three grass spicies

圖5 快中子輻射對(duì)3種禾草的活力指數(shù)的影響Fig.5 Effects of fast neutron irradiation on vigor indexes of three grass spicies

2.3快中子輻射對(duì)3種禾草幼苗生長(zhǎng)的影響 快中子輻射處理對(duì)3種牧草根長(zhǎng)和苗高的影響不同。快中子輻射抑制羊草根和苗的生長(zhǎng)，根長(zhǎng)和苗高隨輻射劑量的增加呈顯著下降趨勢(shì)(P<0.05)(表1)，羊草對(duì)照的根長(zhǎng)分別是T1、T2、T3的2.87、3.18和11.02倍，對(duì)照的苗高分別是3個(gè)處理的2.91、3.19和7.91倍。試驗(yàn)結(jié)果說明高劑量輻射對(duì)羊草根的抑制作用大于對(duì)苗的抑制作用。處理T1無芒雀麥根長(zhǎng)和苗高都高于對(duì)照，但差異不顯著(P>0.05)，而T2和T3顯著低于對(duì)照。結(jié)果表明,在試驗(yàn)的劑量范圍內(nèi)，低劑量的快中子輻射可促進(jìn)無芒雀麥幼苗的生長(zhǎng)，高劑量則抑制其生長(zhǎng)?？熘凶犹幚砗罄厦Ⅺ溣酌缟L(zhǎng)的變化趨勢(shì)與無芒雀麥相反。T3處理根長(zhǎng)比對(duì)照增加27.4%，苗高增加26.6%，T1和 T2顯著低于對(duì)照。

表1 快中子輻射對(duì)3種禾草幼苗生長(zhǎng)的影響Table 1 Effects of fast neutron irradiation on seedling growth of three grass spicies cm

3 討論與結(jié)論

羊草是一種多年生根莖禾草，為旱生草原、鹽生草甸的優(yōu)勢(shì)種，是我國(guó)重要的優(yōu)良牧草之一，也是建立栽培草地和治理鹽堿化草地的理想草種[17]。羊草在自然生境中以無性繁殖為主，有性繁殖為輔，其本身固有的“三低”問題(羊草草地的結(jié)實(shí)率僅為20%～40%，抽穗率為30%～40%，發(fā)芽率在10%～50%[18-21])嚴(yán)重限制了它在生產(chǎn)中大面積的應(yīng)用。我國(guó)羊草育種工作還處于起步階段，羊草育成品種較少，“三低” 問題依然存在，羊草育種研究嚴(yán)重滯后于生產(chǎn)實(shí)踐的需要。因此，把常規(guī)選育和誘變育種(空間誘變、高能粒子照射、γ輻射等)結(jié)合起來，充分利用各種突變類型創(chuàng)造滿足不同需要的羊草品種，尤其是選育高結(jié)實(shí)率、高抽穗率和高發(fā)芽率的羊草新品種和遺傳材料，是今后羊草育種的重要研究課題之一。

不同植物品種的種子萌發(fā)及幼苗對(duì)快中子輻射及輻射劑量的敏感性不同。張圣君[22]在研究中子和電子束輻照對(duì)水稻(Oryzasativa)等農(nóng)作物育種的影響時(shí)得出十字花科植物比禾本科植物耐輻射。王丹等[23]報(bào)道，中子輻射兩種觀賞羽衣甘藍(lán)(Brassicaoleraceavar.acephala)的半致死劑量、過氧化物酶和過氧化氫酶活性等差異明顯。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)快中子輻射對(duì)3中牧草種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的影響不同，具體表現(xiàn)為快中子輻射降低羊草種子的發(fā)芽率、萌發(fā)速度和種子活力，同時(shí)抑制其幼苗生長(zhǎng)。低劑量快中子輻射(3.60×1011個(gè)·cm-2)能提高無芒雀麥種子萌發(fā)能力(種子發(fā)芽率和種子活力)，促進(jìn)其幼苗生長(zhǎng)，高劑量輻射有降低和抑制作用?？熘凶虞椛涮岣呃厦Ⅺ湻N子的發(fā)芽率，在試驗(yàn)輻射劑量范圍內(nèi)，劑量越高，種子活力指數(shù)越大，且幼苗生長(zhǎng)越好。

在植物輻射誘變育種中常以種子發(fā)芽率作為判定輻射半致死劑量及適宜輻射劑量范圍的標(biāo)準(zhǔn)。本試驗(yàn)設(shè)置的輻射間隔較大，加之3種牧草的發(fā)芽率對(duì)中子輻射和輻射劑量的響應(yīng)不同，未能準(zhǔn)確地確定它們的半致死劑量。本試驗(yàn)初步認(rèn)為，羊草和無芒雀麥適宜低劑量輻射處理，輻射劑量應(yīng)小于3.60×1011個(gè)·cm-2，而老芒麥適宜高劑量輻射。另外，應(yīng)對(duì)輻射后的活化苗進(jìn)行系統(tǒng)的研究，包括細(xì)胞學(xué)、形態(tài)學(xué)、生理生化、營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)等方面的研究，以期得到變異單株或有益突變體。

快中子輻射育種技術(shù)優(yōu)于γ射線、X射線和化學(xué)誘變育種方法[24]，具有廣闊的發(fā)展前景。為了提高牧草快中子輻射育種的效率，需要進(jìn)一步研究不同牧草品種的最適輻射劑量、誘變機(jī)理(細(xì)胞、分子水平)、誘變后代的遺傳穩(wěn)定性和分化規(guī)律及其分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

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