李超 石芳瓊 楊丹 王潔 翦新春 蔣燦華

（1.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 口腔頜面外科；2.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院 免疫學(xué)系，長(zhǎng)沙 410078）

口腔鱗癌細(xì)胞過表達(dá)MHC-Ⅰ類鏈相關(guān)蛋白A對(duì)自然殺傷細(xì)胞與細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞殺傷活性影響的實(shí)驗(yàn)研究

李超1石芳瓊1楊丹1王潔2翦新春1蔣燦華1

（1.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 口腔頜面外科；2.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院 免疫學(xué)系，長(zhǎng)沙 410078）

目的 探討口腔鱗癌細(xì)胞過表達(dá)MHC-Ⅰ類鏈相關(guān)蛋白A（MICA）對(duì)自然殺傷細(xì)胞（NK）與細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）殺傷活性的影響。方法 通過繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線、檢測(cè)細(xì)胞周期、進(jìn)行平板集落形成率及裸鼠皮下成瘤等方法對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染并過表達(dá)MICA的口腔鱗癌細(xì)胞株進(jìn)行生物學(xué)特性鑒定。采用乳酸脫氫酶釋放法及流式細(xì)胞術(shù)分析口腔鱗癌細(xì)胞過表達(dá)MICA對(duì)NK與CTL細(xì)胞殺傷活性及自然殺傷細(xì)胞2族成員D（NKG2D）受體表達(dá)的影響。結(jié)果 口腔鱗癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染MICA基因后主要生物學(xué)特性未發(fā)生改變，但能顯著增強(qiáng)NK與CTL細(xì)胞殺傷活性并上調(diào)其表面NKG2D的表達(dá)，與未轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染空白載體的細(xì)胞比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 MICA可作為口腔鱗癌免疫基因治療的潛在靶標(biāo)，值得進(jìn)一步研究。

口腔； 鱗狀細(xì)胞癌； MHC-Ⅰ類鏈相關(guān)蛋白A； 殺傷活性； 基因治療

MHC-Ⅰ類鏈相關(guān)蛋白A（MHC classⅠchainrelated protein A，MICA）是新近發(fā)現(xiàn)的由MHC基因編碼的跨膜糖蛋白，其主要功能是作為自然殺傷細(xì)胞（natural killer，NK）、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）等免疫效應(yīng)細(xì)胞活化性受體自然殺傷細(xì)胞2族成員D（natural killer group 2，member D，NKG2D）的配體，能與NKG2D特異性結(jié)合，傳遞活化信號(hào)，誘導(dǎo)免疫效應(yīng)細(xì)胞迅速清除異常表達(dá)此種配體的腫瘤細(xì)胞[1-3]。正常情況下MICA組織分布局限，但近年來發(fā)現(xiàn)MICA在許多腫瘤細(xì)胞均有表達(dá)或上調(diào)，因而被視為一種腫瘤相關(guān)性抗原[4-7]。

在前期研究中，成功構(gòu)建了MICA基因的真核表達(dá)載體，采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染人舌鱗癌腦高轉(zhuǎn)移Tb細(xì)胞系，經(jīng)G418篩選，有限稀釋法建立單克隆細(xì)胞株。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）及免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)顯示，轉(zhuǎn)染后MICA mRNA和蛋白均呈過表達(dá)狀態(tài)[8]。本研究主要通過體外實(shí)驗(yàn)觀察人舌鱗癌腦高轉(zhuǎn)移Tb細(xì)胞系穩(wěn)定轉(zhuǎn)染并過表達(dá)MICA后對(duì)NK與CTL細(xì)胞NKG2D表達(dá)及細(xì)胞毒活性的影響，為通過MICA基因調(diào)控來進(jìn)行口腔鱗癌的免疫治療提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

胎牛血清、馬血清、RPMI1640及α-MEM培養(yǎng)液（GIBCO公司，美國），人重組白細(xì)胞介素-2（recombine human interleukin-2，rhIL-2）（長(zhǎng)春生物制品研究所），甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、淋巴細(xì)胞分離液（Sigma公司，美國），異藻藍(lán)蛋白（allophycocyanin，APC）標(biāo)記的鼠抗人NKG2D/ CD314單克隆抗體（eBioscience公司，美國），乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞系

選取BALB/C-nu/nu裸小鼠18只（購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司），4～6周齡，雄性，飼養(yǎng)于中南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心無特定病原體（special pathogen free，SPF）級(jí)動(dòng)物房。人舌鱗癌腦高轉(zhuǎn)移Tb細(xì)胞系由上海交通大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院腫瘤生物實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)。人NK細(xì)胞系NK92由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)免疫學(xué)系饋贈(zèng)，培養(yǎng)于含12.5%胎牛血清、12.5%馬血清和rhIL-2（100U·mL-1）的α-MEM培養(yǎng)液中。轉(zhuǎn)染MICA基因重組質(zhì)粒pEGFP-N1-MICA或空白質(zhì)粒pEGFPN1的細(xì)胞株Tb-pEGFP-N1-MICA及Tb-pEGFP-N1由本課題組建立。

1.3 Tb-pEGFP-N1-MICA細(xì)胞株生物學(xué)特性的鑒定

以Tb細(xì)胞及Tb-pEGFP-N1細(xì)胞為對(duì)照，對(duì)Tb細(xì)胞轉(zhuǎn)染并過表達(dá)MICA后的生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定。

1.3.1 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線 接種細(xì)胞于96孔板，每孔103個(gè)，培養(yǎng)于200μL含10%胎牛血清的RMPI1640培養(yǎng)液中，每組15孔，每24 h每組取3孔加入10μL MTT溶液（5mg·mL-1），繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄上清，每孔加入200μL二甲基亞砜，充分溶解藍(lán)紫色結(jié)晶后于酶標(biāo)儀上（檢測(cè)波長(zhǎng)為570nm）測(cè)定光密度值（A值），連續(xù)5 d，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.3.2 細(xì)胞周期檢測(cè) 無血清RMPI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞過夜，0.25%胰酶消化后重懸，1 500 r·min-1離心5min，PBS洗滌2次，70%預(yù)冷乙醇4℃固定過夜，PBS洗滌3次，加入1mL碘化丙啶（propidium iodide，PI）染液（50μg·mL-1），37℃孵育30min后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3.3 平板集落形成實(shí)驗(yàn) 臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞，稀釋于含10%胎牛血清的RMPI1640培養(yǎng)液中，6孔板每孔加入細(xì)胞數(shù)為200個(gè)，37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周，棄上清，用PBS小心浸洗2次，甲醇固定15min，加適量結(jié)晶紫染液染色15min，洗去染液，空氣干燥。顯微鏡下計(jì)數(shù)，細(xì)胞數(shù)大于50計(jì)為1個(gè)集落。計(jì)算集落形成率=集落數(shù)/細(xì)胞接種數(shù)× 100%。

1.3.4 裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn) 消化細(xì)胞調(diào)整密度至每毫升5×106個(gè)，皮下接種裸小鼠，成瘤后頸椎脫臼處死，無菌條件下剝離腫瘤，修整成2mm×2mm×2mm大小組織塊，共6塊，分別植入另6只裸鼠背部皮下。植入后第11天開始用游標(biāo)卡尺測(cè)量移植瘤最小徑a，最大徑b，計(jì)算移植瘤體積V=a2b/2，2 d 1次，繪制移植瘤生長(zhǎng)曲線，至第23天處死裸鼠，剝離腫瘤稱重。

1.4 口腔鱗癌細(xì)胞過表達(dá)MICA對(duì)NK細(xì)胞NKG2D表達(dá)及殺傷活性的影響

調(diào)整NK92細(xì)胞密度為每毫升1×107個(gè)，作為效應(yīng)細(xì)胞；Tb、Tb-pEGFP-N1和Tb-pEGFP-N1-MICA細(xì)胞密度為每毫升1×106個(gè)，作為靶細(xì)胞，設(shè)效靶比為10∶1，按以下方案在96孔板中加樣。1）測(cè)定孔：效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞各100μL；2）自然釋放孔：靶細(xì)胞100μL，RPMI1640培養(yǎng)液100μL；3）最大釋放孔：靶細(xì)胞100μL，20%十二烷基硫酸鈉（dodecyl sulfate sodium salt，SDS）100μL；4）細(xì)胞對(duì)照孔：效應(yīng)細(xì)胞100μL，RPMI1640培養(yǎng)液100μL。以上每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。將96孔板輕輕混勻后置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。收集測(cè)定孔NK92細(xì)胞用于流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。吸取各孔上清于另一96孔板中繼續(xù)培養(yǎng)10min，每孔加入底物溶液100μL，室溫避光孵育10min，加入終止反應(yīng)溶液30μL，用酶標(biāo)儀（檢測(cè)波長(zhǎng)490 nm）測(cè)定A值。計(jì)算殺傷活性（%）=（測(cè)定孔A值-自然釋放孔A值-細(xì)胞對(duì)照孔A值）/（最大釋放孔A值-細(xì)胞對(duì)照孔A值）×100%。

測(cè)定孔NK92細(xì)胞重懸后加入2個(gè)流式細(xì)胞儀專用檢測(cè)管中，其中1個(gè)管加入APC標(biāo)記的鼠抗人NKG2D/ CD314單克隆抗體5μL，另1個(gè)管不加抗體作為空白對(duì)照管，振蕩混勻后避光室溫孵育15min，1200 r·min-1離心5min，棄上清，每管加入PBS溶液0.3mL，重懸后上機(jī)檢測(cè)。利用CELLQUEST軟件，先用空白對(duì)照管設(shè)置儀器檢測(cè)參數(shù)，再以每管不少于10 000個(gè)細(xì)胞的條件收集另1管中的細(xì)胞。在CELLQUEST軟件上結(jié)合“畫門”（gating）技術(shù)對(duì)收集的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.5 口腔鱗癌細(xì)胞過表達(dá)MICA對(duì)CTL細(xì)胞NKG2D表達(dá)及細(xì)胞毒活性的影響

密度梯度離心法分離人外周血（健康志愿者提供）單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），分別與經(jīng)過絲裂霉素C滅活處理的Tb、TbpEGFP-N1和Tb-pEGFP-N1-MICA細(xì)胞按1∶1的比例混合，培養(yǎng)7 d對(duì)PBMC進(jìn)行預(yù)刺激，調(diào)整密度后作為效應(yīng)細(xì)胞；對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Tb細(xì)胞作為靶細(xì)胞，設(shè)效靶比為10∶1，共同孵育24 h，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CTL細(xì)胞NKG2D的表達(dá)，LDH釋放法檢測(cè)CTL細(xì)胞對(duì)Tb細(xì)胞的細(xì)胞毒活性（方法同1.4）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件包兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Tb-pEGFP-N1-MICA細(xì)胞株的生物學(xué)特性

Tb細(xì)胞轉(zhuǎn)染并穩(wěn)定過表達(dá)MICA后細(xì)胞生長(zhǎng)曲線、細(xì)胞周期、平板集落形成及皮下成瘤等生物學(xué)特性未發(fā)生明顯改變（圖1～3、表1）。

圖1 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線Fig 1 Cell growth curve

圖2 裸鼠移植瘤體積生長(zhǎng)曲線Fig 2 Growth curve of transplanted tumors in nude mice

圖3 裸鼠重量的比較Fig 3 Comparison of transplanted tumors in weight

表1 細(xì)胞周期及平板集落形成率的比較Tab 1 Com parison of cell cycle distribution and p late clone form ing rate

2.2 口腔鱗癌細(xì)胞過表達(dá)MICA對(duì)NK與CTL細(xì)胞NKG2D表達(dá)及殺傷活性的影響

Tb-pEGFP-N1-MICA細(xì)胞能明顯上調(diào)NK與CTL細(xì)胞NKG2D的表達(dá)并增強(qiáng)其對(duì)腫瘤靶細(xì)胞的殺傷活性，與Tb和Tb-pEGFP-N1細(xì)胞比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，表2）。

表2 口腔鱗癌細(xì)胞過表達(dá)M ICA對(duì)NK與CTL細(xì)胞NKG2D表達(dá)及殺傷活性的影響Tab 2 Effects on NKG2D receptor expression and cytotoxicity of NK and CTL by genetic overexpression of M ICA in OSCC cells %

3 討論

NK和CTL是機(jī)體內(nèi)主要的抗腫瘤免疫效應(yīng)細(xì)胞，其功能狀態(tài)與細(xì)胞表面的C型凝集素樣活化型受體NKG2D密切相關(guān)。NKG2D識(shí)別的配體在人類主要有3個(gè)，分別為MICA、MICB及ULBP（UL16-binding protein），但現(xiàn)有研究表明：在抗腫瘤免疫中起主要作用的是MICA[9-10]。腫瘤細(xì)胞MICA與NK細(xì)胞NKG2D結(jié)合后，能誘導(dǎo)死亡伴隨蛋白-10的YxxM基序磷酸化，繼而激活磷脂酰肌醇-3-激酶的P85亞基，使下游的蛋白激酶B磷酸化，從而激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/ 2和促絲裂原激活蛋白激酶旁路，并促使Ca2+內(nèi)流，傳遞活化信號(hào)。此外，MICA還能夠與CTL的NKG2D結(jié)合并促進(jìn)其增殖，顯著增強(qiáng)T細(xì)胞抗原受體依賴性的細(xì)胞毒作用，而且MICA-NKG2D可替代CD28-B7產(chǎn)生共刺激信號(hào)，活化CTL細(xì)胞[11]。因而，近年來MICA-NKG2D信號(hào)通路介導(dǎo)的免疫監(jiān)視在抗腫瘤免疫研究中的作用越來越受到學(xué)者們的重視。

MICA在機(jī)體內(nèi)存在2種功能形式，即細(xì)胞表面的膜結(jié)合型MICA（member MICA，mMICA）和游離狀態(tài)的可溶性MICA（soluble MICA，sMICA），后者在免疫效應(yīng)中的作用恰好相反，通過誘導(dǎo)NKG2D的內(nèi)化和降解，促進(jìn)腫瘤逃逸免疫應(yīng)答。mMICA可通過多種機(jī)制脫落而成為sMICA。近年的研究多集中在金屬基質(zhì)蛋白酶和解聚素對(duì)MICA脫落的影響[12-14]。前期研究發(fā)現(xiàn)，口腔鱗癌MICA mRNA高于癌旁組織但蛋白表達(dá)卻低于癌旁組織，而血清中sMICA高于正常，提示腫瘤細(xì)胞表面的MICA因發(fā)生脫落不足以充分活化NKG2D，導(dǎo)致NK和CTL細(xì)胞殺傷效應(yīng)降低。

本研究中首先以未轉(zhuǎn)染的Tb細(xì)胞及轉(zhuǎn)染空白載體的Tb-pEGFP-N1細(xì)胞為對(duì)照，對(duì)Tb-pEGFP-N1-MICA細(xì)胞的生物學(xué)特性進(jìn)行了鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：3組細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)速度、細(xì)胞周期、平板集落形成及皮下成瘤等均未見差異，表明Tb細(xì)胞轉(zhuǎn)染并穩(wěn)定過表達(dá)MICA后主要生物學(xué)特性未發(fā)生改變。

以人NK92細(xì)胞或經(jīng)過滅活處理的Tb、Tb-pEGFPN1和Tb-pEGFP-N1-MICA細(xì)胞預(yù)刺激的人PBMC作為效應(yīng)細(xì)胞，以Tb、Tb-pEGFP-N1及Tb-pEGFP-N1-MICA細(xì)胞作為靶細(xì)胞在體外共同培養(yǎng)，流式細(xì)胞術(shù)及LDH釋放法檢測(cè)結(jié)果顯示：口腔鱗癌細(xì)胞過表達(dá)MICA蛋白能顯著上調(diào)NK及CTL細(xì)胞表面NKG2D的表達(dá)并增強(qiáng)其殺傷活性。與其他研究結(jié)果[15-16]基本一致。

總之，口腔鱗癌細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染并過表達(dá)MICA后，生物學(xué)特性未發(fā)生明顯改變，但能顯著上調(diào)NK與CTL細(xì)胞NKG2D表達(dá)及殺傷活性。MICA有望成為口腔鱗癌免疫基因治療的新靶標(biāo)，值得進(jìn)一步深入研究。

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（本文編輯 杜冰）

Natural killer and cytotoxic T lymphocyte-mediated cytotoxicity enhanced by genetic overexpression of MHC classⅠchain-related protein A in oral squamous cell carcinoma：An experimental study in vivo

Li Chao1,Shi Fangqiong1,Yang Dan1,Wang Jie2,Jian Xinchun1,Jiang Canhua1.（1.Dept.of Oral and Maxillofacial Surgery,Xiangya Hospital,Central-south University,Changsha410078,China;2.Dept.of Immunology,Xiangya Medical School,Central-south University,Changsha410078,China）

ObjectiveTo investigate the effect on natural killer（NK）and cytotoxic T lymphocyte（CTL）-mediated cytotoxicity by genetic overexpression of MHC classⅠchain-related protein A（MICA）in oral squamous cell carcinoma（OSCC）.MethodsThe OSCC cells by genetic overexpression of MICA were detected to identify the biological features including cell growth curve,cell cycle distribution,plate clone forming rate and tumorigenicity in nude mice.The expression of natural killer group 2,member D（NKG2D）receptor and the cytotoxicity to target tumor cells of NK92 and CTL cells,which co-cultured with the transfected OSCC cells or the non-transfected or blank vector-transfected controls,were measured by flow cytometry and lactate dehydrogenase（LDH）release assay.Results There was no difference in biological features before and after MICA gene transfection to OSCC cells.Flow cytometry and LDH release assay showed that MICA-overexpressed OSCC cells enhanced the cytotoxicity to target tumor cells and up-regulated the expression of NKG2D on NK92 and CTL（P<0.05）.ConclusionMICA may be considered as a promising immunotherapy target of OSCC.

oral； squamous cell carcinoma； MHC classⅠchain-related protein A； cytotoxicity； gene therapy

Q 78

A

10.3969/j.issn.1000-1182.2012.01.008

1000－1182（2012）01-0032-04

2011-02-25；

2011-11-17

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（30772437）；湖南省科技計(jì)劃一般基金資助項(xiàng)目（06sk3026，06sk3044）

李超（1985—），女，湖南人，碩士

蔣燦華，Tel：0731-84327475

·基礎(chǔ)研究·