張素芝 杜麗榮 韓宏偉 李國正 韓省華 劉效群 趙邦榮 張亦心

反復自然流產(chǎn)(recurrent spontaneous abortion，RSA)是指連續(xù)發(fā)生2次或2次以上的自然流產(chǎn)。其病因復雜，在發(fā)病患者中有60%～70%是不明原因的。滋養(yǎng)細胞的分化、浸潤行為十分復雜，但調(diào)節(jié)極為精細，時間僅限于早孕期，滋養(yǎng)細胞具有與腫瘤細胞相似的浸潤性生長的生物學特性，早孕期滋養(yǎng)細胞迅速增生并侵蝕子宮內(nèi)膜。生存素(Survivin)是一類結構獨特的哺乳類動物凋亡抑制蛋白，具有抑制細胞凋亡和調(diào)節(jié)細胞有絲分裂的雙重功能，可表達于大多數(shù)腫瘤組織及多種轉化細胞。近來研究發(fā)現(xiàn)，Survivin基因的上游啟動片段中存在信號傳導子和轉錄活化子3(STAT3)的反應元件，STAT3可能從上位調(diào)節(jié)Survivin的表達［1］;而血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)亦可以通過激活Akt/PKB信號途徑，提高Survivin基因在細胞中的表達。本研究從滋養(yǎng)層細胞浸潤能力的調(diào)控角度，探討RSA患者孕早期妊娠組織中Survivin、VEGF及Stat3的表達及可能調(diào)控途徑。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2007年1至6月石家莊市婦幼保健院婦科門診就診的20～35歲RSA患者40例(RSA組)。病例選擇條件:發(fā)生過2次或2次以上自然流產(chǎn);孕周12周;流產(chǎn)前B超證實胚胎停育;夫婦外周染色體核型正常，無家族遺傳病史;血三碘甲狀腺原氨酸(T3)、甲狀腺素(T4)和促甲狀腺激素(TSH)檢查無甲狀腺功能異常、黃體功能不全、多囊卵巢綜合癥、高泌乳素血癥等內(nèi)分泌疾病;排除子宮畸形、Rh血型不合及TORCH(弓形蟲抗體、風疹病毒抗體、巨細胞病毒抗體、柯薩奇病毒抗體和生殖器皰疹病毒抗體)檢測異常。同期隨機選擇無不良孕產(chǎn)史，有正常足月分娩史或無生育史的正常同年齡段、孕周相同要求人工流產(chǎn)的正常早孕女性20例做對照(對照組)。

1.2 研究方法

1.2.1 主要試劑與儀器:兔抗人VEGF單克隆抗體、兔抗人Survivin多克隆抗體(北京中杉金橋生物技術有限公司)，TNF-α酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒(北京博奧森生物公司)，聯(lián)苯二胺(DAB)底物顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)。流式細胞儀Epics-XLⅡ型(Beckman Coulter，美國)，全自動酶聯(lián)免疫檢測儀Bio-Rad 255型(Bio-Rad，美國)。

1.2.2 組織免疫化學(SP法):10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片厚4 μm，經(jīng)逐級酒精水化至蒸餾水，微波抗原修復，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗，3%過氧化氫孵育5 min阻斷內(nèi)源性過氧化酶，加正常羊血清封閉后，滴加一抗，37℃孵育1 h，PBS洗滌3次，每次3 min，加生物素標記的抗兔IgG，37℃10 min，PBS洗滌3次，每次3 min，加辣根過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素，37℃10 min，PBS洗滌3次，每次3 min，DAB顯色，蘇木素淡復染，封片。陽性對照Survivin為人胃癌組織，VEGF為人結腸癌組織，PBS代替一抗作為陰性對照。在光鏡下觀測結果。

1.2.3 結果判定:細胞中出現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽性細胞。根據(jù)陽性細胞顯色強度分級為陰性(0分)、黃色為弱陽性(1分)、棕黃色為陽性(2分)、深棕黃色為強陽性(3分)。然后，應用Image-Pro Plus多功能真彩色細胞圖象分析管理系統(tǒng)(Media Cybernetics，美國)進行圖象分析，每張切片隨機選取5個視野，觀察高倍視野中的所有細胞，記錄陽性染色細胞百分數(shù)，0%～1%記0分，2%～10%記1分、11%～50%記2分、51%～80%記3分、81%～100%記4分。將細胞顯色強度和陽性染色細胞百分數(shù)計分相乘得免疫組織化學積分(IHS)值［2］。

1.3 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件分析，計數(shù)資料采用秩和檢驗，兩因素間的相關性采用Spearman等級相關分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

VEGF僅在絨毛膜滋養(yǎng)層細胞和蛻膜細胞的胞質(zhì)中有表達;Survivin、Stat3在絨毛膜滋養(yǎng)層細胞和蛻膜細胞的胞質(zhì)及胞核中均有表達。RSA患者絨毛組織中Survivin、VEGF的表達水平高于對照組(P＜0.05)，二者在絨毛中的表達呈正相關(r=0.268，P＜0.05);RSA組與對照組的絨毛中Stat3的表達差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，絨毛中Survivin與Stat3的表達不存在相關關系(r=-0.006，P＞0.05);RSA組與對照組蛻膜中Survivin、VEGF和 Stat3的表達差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見表1～6。

表1 2組Survivin絨毛中的表達 例

表2 VEGF在RSA組與對照組的絨毛中的表達 例

表3 Stat3在RSA組與對照組的絨毛中的表達 例

表4 Survivin在RSA組與對照組的蛻膜中的表達 例

表5 VEGF在RSA組與對照組的蛻膜中的表達 例

表6 Stat3在RSA組與對照組的蛻膜中的表達 例

3 討論

在胚胎植入和胎盤形成的過程中，滋養(yǎng)細胞生長與浸潤、胎盤與子宮內(nèi)膜血管的構建以及胎盤浸潤蛻膜組織的行為與腫瘤組織的浸潤性生長過程相似。滋養(yǎng)細胞具有高度增殖和浸潤性生長的潛能;但在正常妊娠過程中，滋養(yǎng)細胞不發(fā)生過度增殖和遠處轉移，提示可能受到細胞直接或間接分子調(diào)控作用，使滋養(yǎng)細胞浸潤性生長的能力維持生理性動態(tài)平衡。母-胎界面滋養(yǎng)細胞浸潤能力在分子水平的調(diào)控可以影響胚泡正常的植入和生長。正常妊娠時胎盤形成后滋養(yǎng)細胞即停止侵入，如滋養(yǎng)細胞繼續(xù)浸潤則將形成滋養(yǎng)細胞腫瘤。滋養(yǎng)細胞通過其自身和子宮胎盤單位產(chǎn)生的生長因子、激素等進行著精確的調(diào)控，使其侵襲具有嚴格的時間性和空間性，限制于孕早期及子宮壁的1/3處。

Survivin在大多數(shù)腫瘤組織及多種具有分化潛能的細胞中表達。近來研究發(fā)現(xiàn)，人及其他哺乳類動物胚胎組織、造血干細胞、分泌期子宮內(nèi)膜、早期絨毛以及蛻膜等增殖活躍的組織均有Survivin表達［2］，其他的已分化組織一般不表達或弱表達。Survivin基因的表達對于生物體早期胚胎發(fā)育起著十分重要的作用，抑制處于胚胎發(fā)育早期的Survivin基因的表達，往往造成生物體畸形發(fā)育。Fest等［3］發(fā)現(xiàn)Survivin在促進滋養(yǎng)細胞生長、浸潤和胎盤形成的過程中起重要作用。馮苗等［4］發(fā)現(xiàn)，Survivin在正常早孕絨毛組、葡萄胎組、侵蝕性葡萄胎組、絨癌組的表達由弱至強。在早期妊娠絨毛及葡萄胎滋養(yǎng)層中，Survivin在細胞核中表達水平高于細胞漿;而在侵蝕性葡萄胎、絨癌滋養(yǎng)細胞中，Survivin在細胞漿及細胞核表達水平相同;說明Survivin的過度表達勢必產(chǎn)生異常的抗凋亡作用，從而增強滋養(yǎng)細胞的侵蝕性。隨著Survivin表達水平的增加，妊娠滋養(yǎng)細胞從正常發(fā)展為可控的良性腫瘤，再由良性向不可控的惡性腫瘤轉化。孟海云等［5］也發(fā)現(xiàn)Survivin在不同類型滋養(yǎng)細胞中均有表達，并隨著滋養(yǎng)細胞惡性程度的增加，染色程度顯著升高。

許多細胞因子均可誘導Survivin基因的表達。VEGF、血管生成素1可以通過激活Akt/PKB信號途徑，提高Survivin基因在細胞中的表達，從而在血管生成過程中抑制細胞凋亡，維持血管內(nèi)皮細胞的存活。近來大量實驗研究表明在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤和轉移的過程中VEGF與Survivin起著關鍵性的作用，二者的表達相關。VEGF在受精卵著床過程中發(fā)揮重要作用，并參與整個妊娠期間胎盤生長過程中的血管形成，妊娠后胎盤組織VEGFmRNA表達與外周血中VEGF水平均有明顯上升［6］。Ma ACh等［7］在研究斑馬魚胚胎發(fā)育時發(fā)現(xiàn)，注射人VEGF蛋白可使Survivin的表達增加，而應用VEGF受體抑制因子能明顯減少血管生成和抑制Survivin的表達。

但也有一些研究發(fā)現(xiàn)，Survivin基因的上游啟動片段中存在Stat3的反應元件，阻斷Stat3信號將會抑制Survivin的表達，誘導細胞凋亡。有研究表明白細胞介素-11(IL-11)可以通過激活轉錄信號轉導物及激活劑3(Stat3)來促進Survivin的表達，且其mRNA水平的提高與IL-11存在劑量依賴關系［8］。Kim等［1］研究推測Stat3可能從上位調(diào)節(jié)Survivin的表達，共同作用于抑制細胞的凋亡過程;Schlette等［9］也發(fā)現(xiàn)Survivin是Stat3傳導通路中的目的基因，Stat3基因的激活與Survivin基因的表達相關;Garcia等［10］檢測了同種基因的低流產(chǎn)鼠、流產(chǎn)鼠和壓力刺激流產(chǎn)鼠模型母-胎界面的Survivin和Stat3的表達，研究發(fā)現(xiàn)Survivin在流產(chǎn)鼠和壓力鼠模型孕7.5 d時均高表達，而在正常孕鼠則為低表達;認為小鼠植入窗期母-胎界面Survivin高表達而p-Stat3低表達與鼠流產(chǎn)相關。

23號非轉移性基因H1型(nm23-H1)是經(jīng)典的腫瘤細胞侵襲抑制基因。Nm23-H1在母-胎界面促進滋養(yǎng)細胞和蛻膜基質(zhì)細胞間交叉對話及滋養(yǎng)細胞侵襲行為的控制機制中起重要作用。侯曉帆等［11］從mRNA和蛋白水平分析絨毛與蛻膜組織的nm23-H1表達水平發(fā)現(xiàn)，自然流產(chǎn)患者絨毛及蛻膜nm23-H1表達水平明顯高于正常早孕期;認為人早孕期母-胎界面nm23-H1高表達可能導致妊娠失敗。

本研究顯示RSA患者絨毛滋養(yǎng)層細胞中Survivin、VEGF的表達水平高于正常對照組(P＜0.05)，二者在絨毛滋養(yǎng)層細胞中的表達呈正相關(P＜0.05);RSA組與正常對照組的絨毛中Stat3的表達差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，Survivin與Stat3的表達不存在相關關系(r=-0.006，P＞0.05)。研究發(fā)現(xiàn)，VEGF通過上調(diào)Survivin，參與胚胎著床、胎盤生長和浸潤;而Stat3與其無相關關系，孕早期絨毛滋養(yǎng)層細胞中Survivin的上調(diào)可能不通過 JAK-STAT3途徑。提示 Survivin和VEGF的過度表達打破了母-胎界面滋養(yǎng)細胞侵襲調(diào)控的動態(tài)平衡，可能導致了胚胎被機體免疫系統(tǒng)誤認為異常增生而啟動調(diào)節(jié)機制，增加腫瘤細胞侵襲抑制基因的表達，從而導致自然流產(chǎn)的發(fā)生，而Stat3在RSA絨毛中的正常表達，不會使滋養(yǎng)細胞持續(xù)過度增殖，發(fā)展為滋養(yǎng)細胞腫瘤。

1 Kim KW，Mutter RW，Cao C，et al.Inhibition of signal transducer and activator of transcription 3 activity results in down-regulation of Survivin following irradiation.Mol Cancer Ther，2006，5:2659-2665.

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3 Fest S，Brachwitz N，Schumacher A.Supporting the hypothesis of pregnancy as a tumor:survivin is upregulated in normal pregnant mice and participates in human trophoblast proliferation.Am J Reprod Immunol，2008，59:75-83.

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5 孟海云，李福琴，趙琳琳，等.MMP9、存活素在妊娠滋養(yǎng)細胞疾病中的表達及其臨床意義.哈爾濱醫(yī)科大學學報，2008，42:293-295.

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9 Schlette EJ，Medeiros LJ，Goy A，et al.Survivin expression predicts poorer prognosis in anaplastic large-cell lymphoma.J Clin Oncol，2004，22: 1682-1688.

10 Garcia MG，Tirado-Gonzalez I，Handjiski B，et al.High expression of survivin and down-regulation of Stat-3 characterize the feto-maternal interface in failing murine pregnancies during the implantation period. Placenta，2007，28:650-657.

11 侯曉帆，趙洪波，金莉萍，等.轉移抑制基因nm23-H1及在母胎界面的表達.國際生殖健康/計劃生育雜志，2009，28:41-43.