范海延*

（1 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，遼寧沈陽 110866；2 武警遼寧總隊后勤部農(nóng)副業(yè)生產(chǎn)基地，遼寧沈陽 110866）

瓜類枯萎病是由尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporium）寄生引起的一種土傳病害，全國各菜區(qū)都有分布，危害多種瓜類作物，其中以黃瓜、西瓜、甜瓜等受害較重，病田一般減產(chǎn)20%～30%，嚴(yán)重田塊可達(dá)50%～60%，甚至絕產(chǎn)。一直以來，化學(xué)防治是控制土傳病害的主要手段，但隨著化學(xué)農(nóng)藥的大量使用，產(chǎn)生了環(huán)境污染、農(nóng)藥抗性及農(nóng)藥殘留等令人擔(dān)憂的問題。因此，使用對生態(tài)環(huán)境無害的生防殺菌劑替代化學(xué)農(nóng)藥已經(jīng)成為一種趨勢。

植物是生物活性化合物的巨大天然寶庫，其產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物超過400 000 種，國內(nèi)外研究已發(fā)現(xiàn)許多植物提取物中含有抑菌活性成分，在植物源殺菌劑開發(fā)和應(yīng)用方面也取得了一定的成果（孟昭禮 等，1995，2002；于平儒 等，2001；李瑞 等，2006；喬康和姬小雪，2009；趙成愛 等，2010）。但從總體來看，國內(nèi)外針對作物病害的植物源殺菌劑的應(yīng)用開發(fā)研究還是比較落后，真正投入到市場上的植物源殺菌劑品種不多，還有待于加大植物源抗菌活性物質(zhì)的基礎(chǔ)研究，以開發(fā)出更多具有市場競爭力的植物源殺菌劑品種。本試驗利用超聲波輔助提取法從27 種植物中提取活性物質(zhì)，采用生長速率法進(jìn)行離體抑菌試驗確定其對3 種瓜類枯萎病菌的抑菌活性，并對狼毒大戟、藿香、肉桂、黃檗等植物提取物進(jìn)行預(yù)防性、治療性和誘導(dǎo)抗病性的室內(nèi)盆栽效果評價，旨為今后深入研究提供參考。

表1 供試植物

1 材料與方法

1.1 供試植物

老鸛草、茴茴蒜、白頭翁、毛茛和白屈菜采于沈陽市東陵天柱山，狼毒大戟采自吉林省遼源市，其余藥用植物購自沈陽同仁堂，詳見表1。

1.2 供試菌種

供試菌種為黃瓜枯萎病病菌（Fusarium oxysporiumf.sp.cucumberinumOwen）、西瓜枯萎病病菌（Fusarium oxysporumf.sp.niveum），由沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方農(nóng)作物病害免疫實(shí)驗室提供；甜瓜枯萎病病菌（Fusarium oxysporumf.sp.melonis）由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所植保室園藝作物病害診斷與控制研究組提供。

1.3 試驗方法

試驗于2008年11月～2009年11月在沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院創(chuàng)新實(shí)驗室進(jìn)行。

1.3.1 植物提取物的制備 取粉碎的干燥植物材料5 g，按料液比1︰20 加入到80%乙醇溶液中，于60 ℃、700 W 功率下進(jìn)行超聲提取兩次，每次超聲時間為30 min，合并濾液并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，再將濃縮液置于冷凍干燥機(jī)中干燥12 h，制成提取物干粉。

用5%乙醇溶液溶解干粉，配制成1.0 g·mL-1的植物粗提物母液，0～4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 植物粗提物對病原菌菌絲生長的抑制作用 在無菌條件下，取上述植物提取物1.0 mL，加入9.0 mL 熱培養(yǎng)基，搖勻，對照組中加入等量的無菌水，倒入融化的PDA 培養(yǎng)基至10.0 mL，搖勻、制成平板。接種生長一致的供試菌菌餅（φ＝6.0 mm），使菌餅帶菌絲的一面貼在培養(yǎng)基表面，25 ℃下培養(yǎng)，于接種后第4 天用十字交叉法測定供試菌菌落的生長直徑。抑菌試驗共2個處理（培養(yǎng)基加植物提取液和培養(yǎng)基加0.5%乙醇的對照），每處理3 次重復(fù)。

菌落生長直徑=菌落直徑平均值-6.0 mm

菌絲生長抑制率（%）=（對照菌落生長直徑-處理菌落生長直徑）/對照菌落生長直徑×100%

1.3.3 活體盆栽試驗 在PDA 培養(yǎng)基中活化黃瓜枯萎病菌，25 ℃下培養(yǎng)3 d，再轉(zhuǎn)入PDA 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)4～5 d，菌液過濾，除去菌絲，將濾液經(jīng)5 000 r·min-1離心10 min，取沉淀加蒸餾水稀釋成孢子濃度為5×105個·mL-1的懸浮液，備用。將黃瓜種子放入無菌水中催發(fā)24 h，選取健康的萌發(fā)種子栽種于新育苗缽內(nèi)，基質(zhì)為草炭和蛭石，溫室中正常管理，待黃瓜長至兩葉一心時進(jìn)行試驗處理。

預(yù)防效果測定：在黃瓜幼苗植株根部分別灌入一定濃度的植物提取物5 mL，對照灌入5 mL 無菌水，2 h 后每株幼苗定量灌注5 mL 黃瓜枯萎病菌懸浮液，并于夜間進(jìn)行保濕培養(yǎng)。每處理30 株，3 次重復(fù)，待空白對照充分發(fā)病后進(jìn)行病情分級調(diào)查，并計算病情指數(shù)和防治效果。

治療效果測定：在每株黃瓜幼苗植株根部定量灌注5 mL 黃瓜枯萎病菌懸浮液，發(fā)病后再于黃瓜幼苗植株根部分別灌入一定濃度的植物提取物5 mL，以清水處理為對照。每處理30 株，3次重復(fù)，7 d 后進(jìn)行病情調(diào)查。

誘導(dǎo)抗病效果測定：在黃瓜幼苗葉面均勻噴施一定濃度的植物提取物，對照噴施清水，24 h后每株幼苗定量灌注5 mL 黃瓜枯萎病菌懸浮液。每處理30 株，3 次重復(fù)，待空白對照充分發(fā)病后進(jìn)行病情調(diào)查。

黃瓜枯萎病分級標(biāo)準(zhǔn)（馬麗娟 等，2008）如下。

0 級，全株無??；1 級，發(fā)病輕微，全株有1/4 以下的葉片出現(xiàn)萎蔫狀；2 級，發(fā)病較重，全株有1/4～1/2 的葉片出現(xiàn)萎蔫狀；3 級，發(fā)病重，全株有1/2 以上的葉片出現(xiàn)萎蔫狀；4 級，因病枯死或接近死亡。

病情指數(shù)=Σ（各級發(fā)病數(shù)×代表級數(shù)）/（總調(diào)查株數(shù)×4）×100

防治效果（%）=（對照平均病情指數(shù)-處理平均病情指數(shù)）/對照平均病情指數(shù)×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 植物提取物對3 種枯萎病菌菌絲生長的抑制作用

27 種植物提取物對3 種枯萎病菌菌絲生長抑制作用見表2，當(dāng)提取物濃度為0.1 g·mL-1時，供試植物樣品對3 種枯萎病菌的菌絲生長均有一定的抑制作用。其中，白屈菜、藿香、肉桂、黃檗、龍葵、狼毒大戟提取物對3 種供試枯萎病菌的抑制率均可達(dá)70%以上；威靈仙、蒼耳、旋覆花、防風(fēng)提取物對黃瓜枯萎病菌和甜瓜枯萎病菌的抑制效果較好，抑制率達(dá)50%以上，但對西瓜枯萎病菌的抑制效果較差（除威靈仙外）；毛茛提取物對黃瓜枯萎病菌的抑制率為50.40%，白頭翁和萹蓄提取物對西瓜枯萎病菌的抑制率分別為55.70%、50.00%。其他植物提取物抑菌活性較差，抑制率均在50%以下。

2.2 室內(nèi)盆栽預(yù)防效果評價

狼毒大戟、藿香、肉桂和黃檗等4 種植物的提取物對室內(nèi)盆栽黃瓜幼苗枯萎病菌的預(yù)防效果見表3。

由表3 可以看出，供試的4 種植物提取物對黃瓜枯萎病菌均有一定的預(yù)防效果。其中，狼毒大戟和黃檗提取物對黃瓜幼苗枯萎病菌的預(yù)防效果最好，0.20 g·mL-1的黃檗提取物和0.015 g·mL-1的狼毒大戟提取物的防治效果分別高達(dá)83.33%和70.54%；肉桂提取物的預(yù)防效果也較好，當(dāng)提取物濃度為0.25 g·mL-1時，防治效果達(dá)58.14%；而0.20 g·mL-1藿香提取物的預(yù)防效果較差。

另外，試驗中還發(fā)現(xiàn)當(dāng)提取物施用濃度過高時會出現(xiàn)燒苗現(xiàn)象。

2.3 室內(nèi)盆栽治療效果評價

狼毒大戟、藿香、肉桂和黃檗等4 種植物提取物對室內(nèi)盆栽黃瓜幼苗枯萎病菌的治療效果見表4。

由表4 可以看出，供試的4 種植物提取物對黃瓜枯萎病菌均有一定的治療效果。其中，狼毒大戟和肉桂提取物對黃瓜幼苗枯萎病菌的治療效果較好，0.015 g·mL-1的狼毒大戟提取物和0.25 g·mL-1的肉桂提取物的防治效果分別達(dá)57.89%和51.62%；而0.20 g·mL-1黃檗提取物和藿香提取物對黃瓜幼苗枯萎病菌的治療效果不明顯，防治效果分別為27.78%和21.04%。

2.4 室內(nèi)盆栽誘導(dǎo)抗病效果評價

藿香、肉桂、黃檗提取物對黃瓜幼苗的誘導(dǎo)抗病作用效果見表5?？紤]到狼毒大戟毒性較大，不宜直接葉面噴施，故未進(jìn)行誘導(dǎo)抗病試驗。

由表5 可以看出，一定濃度的藿香、肉桂、黃檗提取物均具有較好的誘導(dǎo)抗病作用。其中，0.40 g·mL-1藿香提取物的誘導(dǎo)抗病防治效果最好，高達(dá)75.60%；0.25 g·mL-1肉桂提取物和0.20 g·mL-1黃檗提取物的誘導(dǎo)抗病防治效果可達(dá)50%以上。

表2 植物提取物對3 種瓜類枯萎病菌菌絲生長的抑制作用

表3 植物提取物對黃瓜枯萎病菌的預(yù)防效果

表4 植物提取物對黃瓜枯萎病菌的治療效果

3 結(jié)論與討論

表5 植物提取物對黃瓜幼苗的誘導(dǎo)抗病效果

植物體內(nèi)的次生代謝物質(zhì)在長期的進(jìn)化過程中已經(jīng)形成了固定的參與能量和物質(zhì)循環(huán)的代謝途徑，在實(shí)際使用當(dāng)中，不易產(chǎn)生殘留及生物富集現(xiàn)象。目前國內(nèi)外的研究都普遍認(rèn)為，植物源農(nóng)藥對非靶標(biāo)生物相對安全，比如印楝素對家兔、野鴨、七星瓢蟲、蜜蜂、鳥類等都僅具有很低的毒性（趙善歡，2000；吳鉅文和陳建峰，2002），因此開發(fā)利用植物源農(nóng)藥用于生物防治的前景十分廣闊。

本試驗結(jié)果表明，供試27 種植物乙醇提取物對3 種瓜類枯萎病菌均有不同程度的抑制作用，其中狼毒大戟、白屈菜、藿香、肉桂、黃檗、龍葵等對3 種供試枯萎病菌的菌絲生長具有明顯的抑制效果，抑制率均在70%以上，值得作為植物源殺菌劑進(jìn)一步研究。同時，本試驗對狼毒大戟、藿香、肉桂、黃檗4 種植物的提取物進(jìn)行了預(yù)防性、治療性和誘導(dǎo)抗病性的活體盆栽試驗。結(jié)果表明，0.015 g·mL-1的狼毒大戟提取物對黃瓜幼苗抗枯萎病菌的預(yù)防效果和治療效果均較好，分別可達(dá)70.54%和57.89%；0.25 g·mL-1的肉桂提取物對黃瓜幼苗抗枯萎病菌的預(yù)防作用、誘導(dǎo)抗病作用、治療作用的效果均可達(dá)50%以上；而對于藿香提取物來說，誘導(dǎo)抗病效果最佳，而預(yù)防作用和治療作用效果不明顯；0.20 g·mL-1黃檗提取物的預(yù)防效果高達(dá)83.33%，誘導(dǎo)抗病防治效果也可達(dá)55.55%，但治療作用效果不明顯。另外，試驗中也發(fā)現(xiàn)當(dāng)植物提取物施用濃度過高時會出現(xiàn)燒苗現(xiàn)象。

由于植物源抑菌活性成分為植物的一類或幾類次生代謝物質(zhì)，活性物質(zhì)化學(xué)成分復(fù)雜、絕大多數(shù)沒有明確；活性物質(zhì)的種類、含量受自身遺傳因子、外界環(huán)境條件的影響，會有地域性和季節(jié)性變化，并且活性成分在植物不同部位含量亦不同，使活性成分的含量和活性強(qiáng)度不穩(wěn)定（邵云東 等，2003；石志紅 等，2004）。因此，今后應(yīng)重點(diǎn)針對目標(biāo)病害進(jìn)行植物源高抗菌活性化合物的深入篩選，發(fā)掘具有殺菌或抑菌活性的植物資源；根據(jù)生物防治原理，從植物中分離天然抑菌活性物質(zhì)，應(yīng)用活性跟蹤法確定高效提取抑菌活性物質(zhì)的關(guān)鍵技術(shù)與工藝路線；并在活性追蹤指導(dǎo)下對重要植物的抑菌活性成分進(jìn)行分離、結(jié)構(gòu)闡明以及構(gòu)效關(guān)系的研究，發(fā)現(xiàn)生理活性先導(dǎo)化合物或活性成分，為新型植物源殺菌劑開發(fā)提供先導(dǎo)化合物。

李瑞，周立剛，王敬國，李曉林，唐靜，謝敏．2006．苦豆子提取物對黃瓜和番茄病原菌的抑制作用．西北植物學(xué)報，26（3）：558-563．

馬麗娟，周寶利，張淑紅，付亞文．2008．蛇床子提取物對黃瓜枯萎病菌抑制效果的研究．植物保護(hù)，34（4）：36-39．

孟昭禮，吳獻(xiàn)忠，高慶霄，魏華．1995．銀杏提取液對四種植物病原菌的抑制作用．植物病理學(xué)報，25（4）：357-360．

孟昭禮，羅蘭，袁忠林，李建強(qiáng)，曲寶涵，姜學(xué)東，劉西莉．2002．人工模擬的植物源殺菌劑銀泰防止番茄3 種病害研究．中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，35（7）：863-866．

喬康，姬小雪．2009．植物源殺菌劑研究進(jìn)展．農(nóng)藥研究與應(yīng)用，13（4）：15-19．

邵云東，高文遠(yuǎn)，劉丹，賈偉，段宏泉，張鐵軍．2003．植物提取物的質(zhì)量控制．中國中藥雜志，28（10）：899-903．

石志紅，何建濤，常文保．2004．中藥指紋圖譜技術(shù)．大學(xué)化學(xué)，19（1）：33-39．

吳鉅文，陳建峰．2002．植物源農(nóng)藥及其安全性．植物保護(hù)，28（4）：40．

于平儒，邵軍紅，馮俊濤，祝木金，張興．2001．62 種植物樣品對菌絲活性的測定．西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，29（6）：65-69．

趙成愛，孫輝，王呈玉，周正輝．2010．6 種中草藥水提物對黃瓜黑星病菌抑制活性的室內(nèi)篩選．農(nóng)藥，49（6）：453-455．

趙善歡．2000．植物化學(xué)保護(hù)．3 版．北京：中國農(nóng)業(yè)出版社：303．