曹亞從 張正海 王立浩 毛勝利 張寶璽

（農(nóng)業(yè)部園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)蔬菜花卉研究所，北京 100081）

辣椒（Capsicum annuumL．）屬于茄科（Solanaceae），是一種重要的蔬菜作物，與番茄、馬鈴薯等其他茄科蔬菜作物相比，其組織培養(yǎng)的再生率很低（Liu et al.，1990），屬于頑拗型再生植物。辣椒不同基因型的外植體，其內(nèi)源激素水平有很大差異，而且不同組織器官內(nèi)源激素分布有差異（李浚明，2002），所以不同基因型、不同組織器官很難建立一個(gè)通用的組織培養(yǎng)再生體系。辣椒再生困難主要表現(xiàn)為芽誘導(dǎo)率以及伸長率低。在辣椒芽誘導(dǎo)培養(yǎng)中，通常在培養(yǎng)基中添加植物生長物質(zhì)，以提高芽誘導(dǎo)率，使用較多的是IAA 和6-BA 組合（Agrawal et al.，1989；Sanatombi ＆ Sharma，2008），以及TDZ（Manoharan et al.，1998；Dabauza ＆ Pena，2001；Ahmad et al.，2006）、ZT（Binzel et al.，1996）等，也有報(bào)道稱通過調(diào)整培養(yǎng)基中的有機(jī)成分可以促進(jìn)芽的分化（Hyde ＆ Phillips，1996；Husain et al.，1999；羅齊軍，2005），無機(jī)物AgNO3也常被用來促進(jìn)芽的分化（Hyde ＆ Phillips，1996）。細(xì)胞分裂素能促進(jìn)細(xì)胞的分裂，對于伸長有一定的抑制作用，在辣椒再生培養(yǎng)的伸長培養(yǎng)基中通常降低細(xì)胞分裂素的含量，并加入GA3來促進(jìn)再生芽的伸長（Berljak，1999；Steinitz et al.，1999；Arouset al.，2001；Joshi ＆ Kothari，2007）。

外植體的類型對于辣椒的組織培養(yǎng)再生有很大影響，Valadez-Bustos 等（2009）的研究表明，以子葉為外植體時(shí)，再生芽難以形成正常植株，多為叢生的畸形芽或葉狀體，而以下胚軸為外植體誘導(dǎo)出的芽容易生成再生植株。張宗江等（1994）研究認(rèn)為由子葉誘導(dǎo)出的葉狀體實(shí)際上是外植體組織的延伸，所以并不能形成正常的芽。筆者曾以本試驗(yàn)中的5 個(gè)品系為試材，以子葉作為外植體進(jìn)行辣椒的組培再生，發(fā)現(xiàn)了相似的現(xiàn)象，只得到了較少的再生植株（待發(fā)表）。

組織培養(yǎng)再生是遺傳轉(zhuǎn)化的必要前提，本試驗(yàn)以5 個(gè)基因型的辣椒為試材，采用不同處理方法的外植體，在添加或不添加植物生長物質(zhì)的MS 培養(yǎng)基上進(jìn)行再生培養(yǎng)，以期建立良好的再生體系，旨在為辣椒的遺傳轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)材料 3 個(gè)甜椒自交系（0510、0516、77013）和2 個(gè)辣椒自交系（0818、0819）均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所辣椒課題組選育。

1.1.2 培養(yǎng)基成分 M0，MS+蔗糖30.0 g·L-1+瓊脂8.0 g·L-1（pH 6.0）；M1，MS + IAA（0.2、0.4 mg·L-1）+ 6-BA（4.0、5.0、6.0 mg·L-1）+ 蔗糖30.0 g·L-1+ 瓊脂8.0 g·L-1（pH 6.0）；M2，MS + IAA（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg·L-1）+ 6-BA（4.0、5.0、6.0 mg·L-1）+ AgNO3（0、5.0、10.0 mg·L-1）+ 蔗糖30.0 g·L-1+ 瓊脂8.0 g·L-1（pH 6.0）；M3，MS + ZT 或TZT（2.0 mg·L-1）+蔗糖30.0 g·L-1+ 瓊脂8.0 g·L-1（pH 6.0）。

1.2 無菌苗的獲得

種子在75%酒精中浸泡處理1 min，再用有效氯9%的次氯酸鈉溶液浸泡10 min，然后用無菌水以流水的方式?jīng)_洗20 s，獲得無菌種子。將無菌種子播于M0和M1培養(yǎng)基，置于27 ℃、每天光照16 h 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，獲得無菌苗。

1.3 不同處理方法外植體的再生

1.3.1 下胚軸切段的再生 采用M0培養(yǎng)基上生長的無菌苗，當(dāng)無菌苗的下胚軸剛伸直時(shí)（播種后10～12 d），切去子葉、生長點(diǎn)和根，將下胚軸截為1 cm 左右的小段作為外植體，置于M0和M2培養(yǎng)基（Agrawal et al.，1989；Arroyo ＆ Revilla，1991；Christopher ＆ Rajam，1996；Sanatombi ＆ Sharma，2008），20 d 更換一次培養(yǎng)基。

1.3.2 直接斬首后下胚軸的再生 采用M0和M1培養(yǎng)基上生長的無菌苗，分3 個(gè)時(shí)段進(jìn)行處理，分別是：無菌苗還未脫掉種皮時(shí)（播種后約7 d），緊挨萌發(fā)孔處切去子葉及生長點(diǎn)；無菌苗長至彎鉤狀時(shí)（播種后約9 d），從彎鉤處剪去子葉及生長點(diǎn)；無菌苗的下胚軸剛伸直時(shí)（播種后10～12 d），從子葉下方約5 mm 處剪去子葉和生長點(diǎn)。去除子葉和生長點(diǎn)的帶根下胚軸繼續(xù)置于原培養(yǎng)基中培養(yǎng)，20 d 更換一次培養(yǎng)基。

1.3.3 針刺斬首后下胚軸的再生 采用M0培養(yǎng)基上生長的無菌苗，分2 個(gè)時(shí)段進(jìn)行處理，分別是：當(dāng)無菌苗長至彎鉤狀時(shí)，用無菌針刺破下胚軸彎鉤處，繼續(xù)在原培養(yǎng)基上培養(yǎng)12 d 后，從子葉以下1～2 mm 處剪去子葉及生長點(diǎn)（Ramirez-Malagón ＆ Ochoa-Alejo，1996）；當(dāng)無菌苗的下胚軸剛伸直時(shí)，從子葉下方約5 mm 處刺破下胚軸，繼續(xù)在原培養(yǎng)基上培養(yǎng)12 d 后，從子葉以下1～2 mm 處剪去子葉及生長點(diǎn)。20 d 更換一次培養(yǎng)基。

1.3.4 半粒種子的再生 處理方法參照Ezura等（1993）的方法，將無菌濾紙放于已滅菌的培養(yǎng)皿中，用無菌水將濾紙浸潤后，將無菌種子置于濾紙上預(yù)培養(yǎng)3 d，培養(yǎng)條件同無菌苗的培養(yǎng)。預(yù)培養(yǎng)3 d 的無菌種子從萌發(fā)孔處橫切為兩部分（圖1），將帶有子葉、胚芽和部分下胚軸的半粒種子（圖1 中B 部分）置于M0培養(yǎng)基，將帶有部分下胚軸及胚根的半粒種子（圖1 中A 部分）置于M0和M3培養(yǎng)基（Binzel et al.1996），20 d 更換一次培養(yǎng)基。

圖1 種子切割示意圖（用于半粒種子培養(yǎng)）

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

外植體培養(yǎng)90 d 后，對外植體數(shù)、出芽外植體數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理方法外植體對辣椒組織培養(yǎng)再生的影響

不同處理方法外植體對辣椒的組織培養(yǎng)再生有明顯的影響，表2 中比較了幾種處理方法外植體再生率的差異。在添加植物生長物質(zhì)的培養(yǎng)基中外植體未誘導(dǎo)形成再生芽（表1），此處僅討論未添加植物生長物質(zhì)培養(yǎng)基中外植體的再生情況。

表1 不同處理方法、不同基因型的外植體再生狀況

5 份材料的下胚軸切段均能形成愈傷組織（圖2-a），但均未誘導(dǎo)出再生芽。

當(dāng)無菌苗還未露出子葉、長至彎鉤狀或下胚軸剛伸直時(shí)切去子葉及生長點(diǎn)，在傷口處會形成大量愈傷組織。90 d 后統(tǒng)計(jì)再生狀況，只有0516 還未露出子葉時(shí)直接斬首后的帶根下胚軸（圖2-b），以及0819 長至彎鉤狀態(tài)時(shí)直接斬首后的帶根下胚軸（圖2-c）各長出一個(gè)伸長的再生芽。

針刺下胚軸的傷口處會形成白色愈傷組織，剪去子葉及生長點(diǎn)7～10 d 后，部分針刺傷口處會分化出葉片，約30 d 后有明顯伸長的再生芽形成（圖2-d），斬首的傷口處不分化形成葉片及再生芽。90 d 后統(tǒng)計(jì)再生狀況，0510 下胚軸剛伸直時(shí)針刺后斬首的帶根下胚軸，以及0516下胚軸彎鉤狀時(shí)針刺后斬首的帶根下胚軸未形成再生植株。

帶有子葉、胚芽以及部分下胚軸的半粒種子會在傷口處形成根（圖2-e）；帶有胚根及部分下胚軸的半粒種子播于MS 固體培養(yǎng)基上后，長出正常的根，有的外植體傷口處只形成大量白色愈傷組織（圖2-f），有的外植體傷口處形成少量白色愈傷組織，也有外植體在傷口處形成綠色不定芽，并形成葉片（圖2-g），大約播種30 d 后，部分外植體有再生芽出現(xiàn)（圖2-h）。外植體形成明顯再生芽的誘導(dǎo)時(shí)間存在差異，播種后30～90 d 期間均有伸長的再生芽形成。大部分外植體只形成一個(gè)伸長的再生芽，只有極少數(shù)形成兩個(gè)以上伸長的再生芽（圖2-i）。

不同處理方法的外植體，形成再生芽的時(shí)間也存在差異。當(dāng)以帶有胚根和部分下胚軸的半粒種子作為外植體時(shí)，從播種開始大約30 d 有再生芽形成；直接斬首后的外植體，從播種開始約40 d 有再生芽形成；針刺后斬首的外植體，從播種開始大約45 d 有再生芽形成。

以帶有胚根和部分下胚軸的半粒種子作為外植體時(shí)，再生率最高，而且再生速度快，再生芽能正常伸長，在本試驗(yàn)中此種處理方法的外植體最有利于辣椒的組培再生。

圖2 不同處理方法外植體對辣椒組織培養(yǎng)再生的影響

2.2 植物生長物質(zhì)對辣椒幼苗及外植體組織培養(yǎng)再生的影響

在不添加植物生長物質(zhì)的培養(yǎng)基中，辣椒幼苗及外植體的根部生長狀態(tài)正常（圖3-a），在添加植物生長物質(zhì)的培養(yǎng)基中生長的幼苗及外植體根部變粗，生長狀態(tài)異常（圖3-b）。

圖3 植物生長物質(zhì)對辣椒根部生長的影響

在添加植物生長物質(zhì)的培養(yǎng)基中生長的下胚軸切段、直接斬首后帶有根的下胚軸和半粒種子均未誘導(dǎo)出再生芽（表1）。

2.3 基因型對辣椒組織培養(yǎng)再生的影響

本試驗(yàn)中，不同基因型的辣椒再生率存在差異（表2）。在不添加植物生長物質(zhì)的培養(yǎng)基中，2 個(gè)辣椒品系的平均再生率（9.00%）明顯高于3 個(gè)甜椒品系的平均再生率（0.77%）。

表2 不同處理方法、不同基因型的外植體在未添加植物生長物質(zhì)的培養(yǎng)基上的再生率 %

辣椒品系、甜椒品系內(nèi)部再生率也存在差異。甜椒品系0516 的平均再生率（1.07%）明顯高于0510（0.42%）和77013（0.82%），辣椒品系0818 的平均再生率（9.85%）明顯高于0819（8.16%）。

2.4 AgNO3對外植體的影響

在下胚軸切段進(jìn)行再生的過程中，添加 AgNO3的培養(yǎng)基中外植體的顏色較深，在不添加AgNO3的培養(yǎng)基中外植體的顏色較淺，而且呈現(xiàn)出玻璃化的狀態(tài)。添加AgNO3可能對減少外植體的玻璃化狀態(tài)有一定的作用，但對于外植體的再生并無明顯的促進(jìn)作用。

3 結(jié)論與討論

根部和幼嫩葉片能夠合成生長素和細(xì)胞分裂素（武維華，2008），Ramirez-Malagón 和Ochoa-Alejo（1996）以及Pozueta-Romero等（2001）認(rèn)為子葉在生長過程中形成的植物激素對于形成伸長的再生芽有重要作用，切除子葉和生長點(diǎn)后，只帶有胚根和下胚軸的外植體并不能形成伸長的再生芽。然而，與其結(jié)果不同的是，在本試驗(yàn)中帶有胚根和部分下胚軸的外植體能夠在不添加植物生長物質(zhì)的培養(yǎng)基中形成再生芽，此結(jié)果說明根在再生芽形成過程中有重要作用，可能是根部合成的生長素和細(xì)胞分裂素促進(jìn)了下胚軸的再生。針刺后斬首的帶根下胚軸（下胚軸形成傷口后一段時(shí)期內(nèi)仍保留子葉，并有真葉形成）的再生率高于直接斬首的帶根下胚軸（下胚軸形成傷口后不保留子葉），說明葉片對再生芽的形成有促進(jìn)作用，可能是葉片合成的激素在一定程度上促進(jìn)了再生芽的分化。

在辣椒的組織培養(yǎng)再生中，常使用生長素（IAA）和細(xì)胞分裂素類（6-BA、TDZ、ZT）這兩類植物生長物質(zhì)來促進(jìn)再生芽的分化（Agrawal et al.，1989；Binzel et al.，1996；Ahmad et al.，2006）。然而，在本試驗(yàn)中不帶子葉、胚芽及胚根的下胚軸切段，即使在添加了生長素和細(xì)胞分裂素的培養(yǎng)基中，也未分化出再生芽?？赡茉蚴潜驹囼?yàn)中采用的植物生長物質(zhì)濃度、配比沒有滿足所采用外植體再生的需求。

基因型對辣椒的離體再生有很大影響，這也是對辣椒再生研究最多的一個(gè)影響因素。對于特定的培養(yǎng)方法，選擇合適的基因型是建立高效、穩(wěn)定再生體系的前提。本試驗(yàn)中采用的2 個(gè)辣椒品系（0818、0819）的再生率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于3 個(gè)甜椒品系（0510、0516、77013），這與前人的報(bào)道相吻合（陳靜嫻和聶凡，1990；Dabauza & Pena，2001；羅齊軍和曾富華，2007），辣椒品系比甜椒品系易形成再生植株。

辣椒的組培再生芽可以由外植體傷口處直接誘導(dǎo)形成，也可以由傷口處形成的愈傷組織再分化形成，但是在辣椒的組培再生中，由愈傷組織再分化出芽的比率很低（沈火林 等，1993），再生芽往往是由傷口處直接形成（別之龍和劉佩英，1996）。本試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)類似的現(xiàn)象，再生芽往往在傷口邊緣的表皮處形成，當(dāng)傷口處形成大量白色愈傷組織，并將傷口覆蓋后，往往不能形成再生芽。將帶有胚根和部分下胚軸的半粒種子形成的白色愈傷組織剝除后，可以看到在傷口周圍有一些很小的綠色芽點(diǎn)，可能是大量的白色愈傷組織阻礙了這些綠色芽點(diǎn)的繼續(xù)發(fā)育；然而，針刺后斬首的帶根下胚軸，在其針刺傷口處，可形成大量白色愈傷組織，再生芽與大量白色愈傷組織同時(shí)存在，但是，再生芽往往在傷口邊緣形成，并不是由愈傷組織再分化形成，這些現(xiàn)象表明，不經(jīng)愈傷組織或胚狀體結(jié)構(gòu)而形成的再生芽，可能與亞麻下胚軸再生培養(yǎng)中觀察結(jié)果相似（李浚明，2002），再生芽可能是由下胚軸的表皮細(xì)胞形成。

辣椒的組培再生研究中，可以利用的外植體類型很多，Ebida 和Hu（1993）研究發(fā)現(xiàn)，子葉、莖尖和下胚軸均能形成再生植株，子葉的再生能力最強(qiáng)。但是由于基因型、培養(yǎng)基等因素的互作，不同研究中會出現(xiàn)相異的結(jié)果。本試驗(yàn)中，當(dāng)以帶有胚根和部分下胚軸的半粒種子為外植體，2 個(gè)辣椒品系有良好的再生效果，而且再生芽通常能伸長，形成正常再生植株，但在此方法操作過程中要注意剔除假再生植株，再生芽通常由表皮細(xì)胞處形成，由下胚軸橫切面中心部位形成的芽通常是由原生長點(diǎn)形成，不是再生芽，需要剔除。

組織培養(yǎng)再生過程中，培養(yǎng)基的成分對于誘導(dǎo)形成再生植株有重要影響，在辣椒的組培再生中，通常采用MS 培養(yǎng)基，Szász 等（1995）、Ebida 和Hu（1993）、Arroy 和Revilla（1991）均以MS 培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，進(jìn)行辣椒的組織培養(yǎng)再生，誘導(dǎo)出了完整的再生植株，但是在培養(yǎng)基中添加了不同的植物生長物質(zhì)。而在本試驗(yàn)中，在不添加植物生長物質(zhì)的MS 培養(yǎng)基中，以帶有胚根和部分下胚軸的半粒種子為外植體，獲得到了良好的再生效果，避免了因添加植物生長物質(zhì)而造成植株變異的情況。而且這種方法不需要進(jìn)行再生根的誘導(dǎo)，在一定程度上提高了再生率。

以帶有胚根和部分下胚軸的半粒種子為外植體，再生率較高，無植物生長物質(zhì)的不良影響，操作比較方便，可以嘗試用于辣椒的遺傳轉(zhuǎn)化研究。

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