王旭暉 張雪艷，2 高麗紅*

（1 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，北京 100193；2 寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川 750021）

設(shè)施農(nóng)業(yè)已成為農(nóng)業(yè)增效和農(nóng)民增收最直接和最有效的途徑。但生產(chǎn)上盲目性投入和單一重復(fù)性種植模式，是生產(chǎn)實踐上的主要問題（van Bruggen & Semenov，1999）。隨著連作年限的增加，土壤環(huán)境不斷惡化，進而造成蔬菜病蟲害嚴(yán)重、產(chǎn)量降低、品質(zhì)下降等現(xiàn)象（孫光聞 等，2004），嚴(yán)重制約設(shè)施農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。輪作是克服連作障礙的有效技術(shù)措施，研究表明輪作可以改善土壤理化性質(zhì)（姚靜 等，2003）和微生態(tài)環(huán)境以及提高酶活性（于立芝 等，2002；李海燕 等，2006；張雪艷 等，2009），進而提高作物產(chǎn)量。由于微生物廣泛參與土壤養(yǎng)分循環(huán)、殘體分解等過程，被稱為土壤環(huán)境的內(nèi)部操縱者（Doran ＆ Zeiss，2000）。一般來說，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)越豐富，物種越均勻，多樣性越高，抗病的綜合能力就越強（焦曉丹和吳鳳芝，2004）。黃瓜（Cucumis sativusL.）作為設(shè)施重要栽培蔬菜，連作障礙問題不容忽視，運用PCR-DGGE 方法研究表明：輪作對修復(fù)黃瓜連作土壤微生物群落結(jié)構(gòu)有一定的影響（于高波等，2011）。

本試驗選擇連作8 a 的土壤，以黃瓜為主栽作物，在溫室夏季休閑種植普通白菜（小白菜）、茼蒿、青蒜等葉菜類蔬菜，同時設(shè)計了番茄輪作與青蒜間作等栽培模式，連續(xù)進行5 a，評價長期采用不同栽培制度對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性的影響，擬從土壤微生態(tài)這一角度尋找有利于溫室土壤保持健康的栽培模式，為設(shè)施土壤可持續(xù)利用栽培制度的制定提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

試驗于2009年1～12月在中國農(nóng)業(yè)大學(xué)科學(xué)園日光溫室內(nèi)進行，供試土壤為連作8 a、進行試驗設(shè)計栽培制度5 a，本試驗為不同栽培制度第6年的土壤。供試種植盆直徑25 cm，盆深28 cm，為防止試驗過程中塑料盆受外界環(huán)境的影響，將塑料盆埋于地下，盆口稍高于地面。試驗設(shè)計4 個處理（表1），栽培茬口分為早春茬、夏茬和秋冬茬，以連續(xù)兩茬種植黃瓜、夏茬休閑處理為對照。每個處理3 次重復(fù)，隨機區(qū)組排列，每個處理為1 個小區(qū)，種植15 盆，小區(qū)間隨機區(qū)組排列。供試黃瓜品種為津育5 號，大蒜（Allium sativumL.）品種為成都二水早，番茄（Lycopersicon esculentumMill.）品種為中雜9 號，茼蒿（Chrysanthemumsp.）為臺灣虎耳大葉茼蒿，普通白菜〔Brassica campestrisL.ssp.chinensis（L.）Makino var.communisTsen et Lee〕為耐熱型品種京冠1 號。

夏季休閑期間所有處理均不施肥，僅根據(jù)栽培作物對水分的需求進行統(tǒng)一水分管理。秋冬茬和早春茬黃瓜定植前，每盆施入膨化雞糞肥500 g，將盆中土徹底混勻，為保證試驗期間各處理養(yǎng)分投入量相同，在黃瓜生長期間各處理補充相同量的山崎黃瓜營養(yǎng)液（郭世榮，2003）。

表1 試驗設(shè)計

1.2 樣品采集與處理

每一茬口結(jié)束時取每盆0～20 cm 的表層土壤，以小區(qū)為單位將土樣混勻后過2 mm 篩。一部分于4 ℃冰箱保存，用于群落水平碳源利用（Biolog）分析，另一部分于-20 ℃冰箱保存，用于變性梯度凝膠電泳（DGGE）分析。

1.3 試驗方法

1.3.1 土壤微生物群落功能多樣性測定 采用Biolog-ECO 測定方法。根據(jù)土壤含水量稱取相當(dāng)于10 g 干土質(zhì)量的濕潤土壤于250 mL 三角瓶中，加90 mL 去離子水，4 ℃下置200 r·min-1震蕩1 h，靜置3 min 后吸取2 mL 置50 mL 試管中，加18 mL 去離子水，充分混合后吸取2 mL 于另一個試管中，再加18 mL 去離子水，得到土壤稀釋液。吸取稀釋液150 μL 加至ECO 板微孔中，之后將ECO 板于25 ℃黑暗培養(yǎng)，每24 h 在590 nm 波長下讀取光密度值，直至讀值穩(wěn)定，上述操作均在無菌條件下完成（Classen et al.，2003）。根據(jù)反應(yīng)的進程選擇第72 小時的數(shù)據(jù)計算Shannon-weaver 指數(shù)、Shannon 均勻度指數(shù)，進行主成分分析（Principal component analysis，PCA）。

1.3.2 土壤細菌結(jié)構(gòu)多樣性的測定

1.3.2.1 土壤微生物DNA 的提取 本試驗采用天澤基因工程有限公司DNA 提取試劑盒Soil DNA out 提取土壤微生物DNA。

1.3.2.2 PCR 擴增反應(yīng)條件 選擇5 對引物對細菌16S rDNA 序列V3 區(qū)擴增進行比較試驗，結(jié)果得到F338GC（5′-cgcccgccgcgcgcggcgggcggggcgggggcacggggggactcctacgggaggcagcag-3′）和R518（5′-attaccgcggctgctgg-3′）擴增結(jié)果較好（吳鳳芝 等，2008；魏利 等，2008）。引物由北京三博遠志生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。PCR 為50 μL 體系：10×PCR Buffer（含Mg2+）5 μL；10 mmol·L-1dNTPmix（每種2.5 mmol·L-1）1 μL；正反向引物（5 pmol·μL-1）各1.5 μL；Taq酶（2.5 U·μL-1）0.2 μL；DNA 模板（10 ng·μL-1）1 μL；加滅菌雙蒸水補足至50 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min 預(yù)熱；93 ℃解鏈30 s，65 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，10 個循環(huán)；93 ℃解鏈30 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，10 個循環(huán)；93 ℃解鏈30 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，9 個循環(huán)；最后93 ℃解鏈30 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸5 min 結(jié)束（王小芬 等，2006）。

1.3.2.3 DGGE 試驗條件 本試驗采用雙梯度法，聚丙烯酰胺凝膠的濃度范圍是6%～12%；變性劑濃度范圍是30%～60%，在1×TAE 緩沖液（DGGE 專用）中100 V 電壓電泳10 h，溫度60 ℃。電泳結(jié)束后取出凝膠，用10 000 倍的SYBR GreenⅠ染色。在凝膠成像系統(tǒng)上觀察試驗結(jié)果。

1.4 數(shù)據(jù)分析

Biolog 原始數(shù)據(jù)采用Excel 2003 整理完成，進一步處理采用SPSS 統(tǒng)計分析軟件進行單因素方差分析（One-Way ANOVA）、主成分分析。

DGGE 圖譜采用凝胺定量軟件Quantity One 進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同栽培制度對土壤微生物功能多樣性的影響

2.1.1 不同栽培制度下土壤微生物群落功能多樣性和均勻度指數(shù) 由表2 可以看出，2009年早春茬D1 和D3 處理土壤微生物的Shannon-weaver 指數(shù)顯著低于其他處理，D2 和D4高于CK，但差異不顯著；夏茬各處理間沒有顯著差異；秋冬茬各處理均顯著高于對照。Shannon 均勻度指數(shù)具有與Shannon-weaver 指數(shù)相同趨勢。

2.1.2 主成分分析 如圖1所示，早春茬在PC2 上，D4 處理與CK 明顯分開，而其他處理之間沒有明顯分開，說明夏季填閑青蒜處理D4 相對于CK 顯著改變了土壤微生物群落組成；夏茬有填閑作物的處理D2、D3、D4 與休閑處理CK、D1 在PC1 和PC2 上都顯著分開，表明夏季填閑作物后，土壤微生物碳源利用情況發(fā)生改變；秋冬茬CK 處理與其他處理明顯分開，說明夏季填閑作物后對土壤微生物群落的影響延續(xù)到秋冬茬，并且秋冬茬黃瓜與青蒜間作D1 處理與CK 相比土壤微生物群落組成發(fā)生改變。

表2 不同栽培制度下土壤微生物群落功能多樣性和均勻度指數(shù)

圖1 不同栽培制度下土壤微生物群落碳源利用的主成分分析

2.2 不同栽培制度對土壤細菌群落結(jié)構(gòu)的影響

2.2.1 不同栽培制度下土壤細菌群落 DGGE圖譜分析 從圖2 可以看出，試驗中各處理呈現(xiàn)的帶型有差別；應(yīng)用 Quantity one 軟件對DGGE 圖譜進行初步分析，得到泳道—條帶識別圖。根據(jù)其統(tǒng)計條帶（表3）可以看出，秋冬茬黃瓜收獲后土壤細菌群落結(jié)構(gòu)在圖譜中顯示的條帶亮度情況都與前兩茬不同（圖2），說明秋冬茬具有更多的優(yōu)勢種群。夏茬填閑茼蒿D2 處理和填閑普通白菜D3 處理，泳道條帶數(shù)相同，均為16 條，沒有填閑作物的CK 休閑處理為12 條，間作青蒜D1 處理為13 條，說明夏茬填閑速生葉菜可以改善土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，增加土壤細菌種類。

2.2.2 聚類分析 在D=0.42 時，所有處理分為兩大類（圖3），早春茬除去D4 青蒜處理外，其余都聚在一起。在D=0.48 時，夏茬D4 青蒜處理與其他處理分開。在D= 0.52 時，早春茬D4 青蒜處理、秋冬茬D3 普通白菜處理和秋冬茬D4 青蒜處理聚在一起，與其他處理分開。夏茬D2 茼蒿處理和D3 普通白菜處理相似系數(shù)最高，達到74%；夏茬和秋冬兩茬的CK 休閑處理相似系數(shù)達到72%。

圖2 16S rDNA V3 片段PCR 產(chǎn)物的DGGE 圖譜

表3 16S rDNA V3 片段PCR 產(chǎn)物的DGGE 圖譜條帶

圖3 DGGE 圖譜UPGMA 聚類分析

3 結(jié)論與討論

Biolog-ECO 板技術(shù)能鑒定土壤中微生物群落功能多樣性，但是由于該技術(shù)進行的時間較短（一般為7 d 左右），所以只能鑒定出能快速生長的可培養(yǎng)微生物（Li et al.，2006），并且ECO中的31 種碳源不能囊括自然土壤生態(tài)系統(tǒng)的所有碳源，因此Biolog-ECO 的試驗結(jié)果只能評價部分微生物群落功能多樣性。PCR-DGGE 利用分子手段顯示了土壤中可培養(yǎng)和不可培養(yǎng)的細菌成分。但是當(dāng)某一種細菌DNA 在總DNA 中的量少于1%時，用PCR-DGGE 方法不能檢測（Muyzer＆ Smalla，1998）。雖然Biolog 和PCR-DGGE 存在一定缺陷，較傳統(tǒng)方法而言卻不失為兩種敏銳、快捷的檢測方法。

對Biolog 試驗得到的數(shù)據(jù)進行多樣性分析，早春茬D1 間作青蒜處理與D3 輪作處理顯著低于其他處理，這與本試驗第3年和第5年研究結(jié)果不同：第3年各處理均高于對照，第5年填閑茼蒿和青蒜處理低于對照，而間作青蒜和輪作處理顯著高于對照；夏茬收獲填閑作物后，各處理間沒有出現(xiàn)顯著差異，但填閑作物的處理土壤微生物功能多樣性和均勻度高于對照，這與第5年試驗結(jié)果一致，與第3年試驗結(jié)果有顯著差異；秋冬茬種植黃瓜后，各個處理均高于休閑對照，這與本試驗第3年和第5年的研究結(jié)果一致（張雪艷 等，2009）。而主成分分析從Biolog試驗得到的大量數(shù)據(jù)中提煉出更具有代表性的指標(biāo)，更加清晰的描繪了各個栽培制度下土壤微生物碳源利用的情況，與直觀多樣性分析相互補充來描繪土壤微生物碳源利用情況。本試驗為連續(xù)性盆栽試驗的第6年，試驗開始前土壤速效氮含量在30～40 mg·kg-1之間，水平偏低。由于夏茬生長過程中不施用肥料，導(dǎo)致夏茬作物根系生長不旺盛，且夏茬填閑作物本身為淺根系，根系分泌物只作用于表層土壤。取樣過程中被非根際土稀釋，而作物生長對非根際土中的微生物群落沒有明顯影響（胡元森 等，2007）。同樣由于養(yǎng)分相對不足，本試驗早春茬結(jié)果與第5年試驗結(jié)果相比呈現(xiàn)出“大小年”的波動?？傮w來說，夏季填閑葉菜以及秋冬茬間作青蒜這兩種栽培制度在連續(xù)6 a 的試驗中均對土壤微生物碳源利用起到改善作用，其中填閑青蒜效果最為明顯。這與吳鳳芝和王學(xué)征（2007）研究小麥和大豆與黃瓜輪作能顯著提高土壤微生物群落的Shannon-weaver 多樣性和均勻度結(jié)果一致。

DGGE 圖譜檢測中的條帶數(shù)量可以近似表現(xiàn)細菌種群數(shù)量，其亮度則表現(xiàn)了該種群數(shù)量的多少，亮度越大，數(shù)量越多（Hu et al.，2004）。DGGE 圖譜中，兩年試驗均顯示出秋冬茬各個處理亮度明顯高于其他茬口，優(yōu)勢種群數(shù)量增多，這可能和秋季氣候變化等因素有關(guān)。DGGE圖譜中非多態(tài)性條帶占全部條帶的63.38%，這一數(shù)據(jù)在3 個茬口分別為 77.59%、57.14%和88.24%，說明夏茬填閑不同作物與休閑處理相比，改變了土壤細菌群落多態(tài)性。早春茬除去普通白菜處理，這一非多態(tài)性指標(biāo)為93.61%，這說明番茄茬口與黃瓜茬口細菌群落有所不同。

綜合來看，夏季填閑茼蒿、普通白菜、青蒜都可以改善土壤微生物群落碳源利用的情況；主成分分析表明，填閑青蒜修復(fù)效果最明顯；填閑茼蒿和普通白菜對碳源利用影響相似。秋冬茬間作青蒜在本茬口有改善土壤微生物群落功能的作用，但在翌年早春茬由于養(yǎng)分相對不足，可能會出現(xiàn)負面影響。

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