張艷梅，王佃亮，曾虹燕，王烈明，孫晉偉，張珍，東莎莎

1 中國(guó)人民解放軍第二炮兵總醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，北京 100088

2 湘潭大學(xué)生物技術(shù)研究所，湖南 湘潭 411105

胰島移植是一種有效治療糖尿病的方法，但目前用于移植的胰島主要是來(lái)源于尸體捐贈(zèng)者，來(lái)源緊缺和免疫排斥反應(yīng)嚴(yán)重阻礙了胰島移植的推廣應(yīng)用，因此尋找可替代β細(xì)胞移植的細(xì)胞資源成為移植研究的必然趨勢(shì)。干細(xì)胞因其具有自我復(fù)制和多向分化潛能成為替代細(xì)胞的最佳選擇。胚胎干細(xì)胞雖然可以誘導(dǎo)分化為胰島素分泌細(xì)胞，但因其倫理爭(zhēng)議和形成畸胎瘤的危險(xiǎn)而受到阻礙[1]。已有研究證明骨髓[2]、肝[3]、胰膽管[4]、臍帶血[5]和皮膚[6]等來(lái)源的成體干細(xì)胞在體外可以成功誘導(dǎo)分化為胰島樣細(xì)胞。相對(duì)于以上諸多干細(xì)胞，hAMSCs具有取材方便，免疫原性低，增殖能力強(qiáng)和向3個(gè)胚層來(lái)源的組織細(xì)胞分化的潛能等優(yōu)勢(shì)[7-8]，在細(xì)胞替代治療領(lǐng)域顯現(xiàn)出更為可觀的前景。大鼠胰腺部分切除后具有胰腺再生功能，并且胰腺部分切除后的再生胰腺提取物具有激發(fā)糖尿病大鼠胰島再生和血糖恢復(fù)的功能[9]，而這種激發(fā)再生機(jī)制是否和干細(xì)胞的誘導(dǎo)機(jī)制有關(guān)？本課題組利用大鼠胰腺再生提取物對(duì)hAMSCs進(jìn)行了誘導(dǎo)研究。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

達(dá)氏修正依氏培養(yǎng)基 (DMEM) (Sigma)；F12 (Sigma)，胎牛血清 (Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS) (Gibico)，胰蛋白酶 (Gibico)，膠原酶Ⅱ和DNaseⅠ (Roche)，重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子 (Recombinant human basic fibroblast growth factor，rhbFGF) (Sino)，雙硫腙 (Dithizone，DTZ) (Sigma)，小鼠抗人胰島素抗體 (Boster)，F(xiàn)ITC標(biāo)記的羊抗小鼠IgG (Boster)，凱基Super一步法RT-PCR試劑盒 (凱基生物)，人胰島素 (INS)試劑盒 (Invitrogen)，SD大鼠 (軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心)。

1.2 hAMSCs的分離培養(yǎng)

細(xì)胞分離參考 Huo等的方法[10]，并在此基礎(chǔ)上改進(jìn)：經(jīng)產(chǎn)婦知情同意后于無(wú)菌條件下，取足月剖宮產(chǎn)胎盤 (HIV、梅毒等檢測(cè)結(jié)果為陰性)，鈍性分離臍帶近端羊膜組織，剪成6 cm× 6 cm大小的羊膜片，用含雙抗的PBS緩沖液多次洗滌。本實(shí)驗(yàn)先將羊膜組織置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，細(xì)胞刮刀刮除未洗滌的血塊和初步刮除羊膜上皮細(xì)胞，PBS沖洗，而后才將羊膜盡量剪碎，采用體積比為 1∶1的 0.25%胰酶和 0.02% EDTA 37 ℃消化60 min，過(guò)100目細(xì)胞篩網(wǎng)，收集羊膜碎皮，1 g/L膠原酶Ⅱ和0.1 g/L DNaseⅠ(體積比1∶1) 37 ℃消化60 min，過(guò)300目細(xì)胞篩網(wǎng)，收集過(guò)濾細(xì)胞液，1 000 r/min離心5 min，苔盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，5×106個(gè)/mL接種細(xì)胞于25 cm2透氣培養(yǎng)瓶，含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基、37 ℃、0.5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，3 d首次換液，細(xì)胞90%鋪滿板底時(shí)，1∶2傳代培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)的分離方法通過(guò)細(xì)胞刮刀輔助去除血塊和羊膜上皮，利用EDTA輔助消化，節(jié)省了實(shí)驗(yàn)時(shí)間，提高了細(xì)胞的提取率和成活率，而且最后采用的細(xì)胞篩網(wǎng)是300目的可以充分去除未消化完全的細(xì)胞團(tuán)或羊膜碎片組織，提高細(xì)胞的純度，更方便細(xì)胞培養(yǎng)。

1.3 大鼠胰腺提取物的制備

生物誘導(dǎo)劑的提取是在Lee等[11]方法的基礎(chǔ)上略有修改：將6~8周齡的SD大鼠腹腔麻醉，從胰尾端開始行60%胰腺切除手術(shù)，而后縫合傷口，正常喂養(yǎng)3 d后，斷頸處死大鼠，提取剩余的胰腺組織，在加有1 μg/mL蛋白酶抑制劑的PBS緩沖液中研磨勻漿，以3 000 r/min和12 000 r/min，4 ℃分別離心10 min和20 min，收集上清液，0.22 μm針式過(guò)濾器過(guò)濾除菌，分裝后，?80 ℃低溫冰箱保存待用。

1.4 hAMSC的誘導(dǎo)分化

用12孔板培養(yǎng)第3代hAMSCs，當(dāng)細(xì)胞鋪滿板底 60%左右時(shí)，向其中加入最終濃度為20 mg/L的RPE，3 d換液，定期觀察誘導(dǎo)狀況。

1.5 雙硫腙染色

細(xì)胞培養(yǎng)15 d后，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞3次，而后，加入0.1 g/L的雙硫腙染色液，37 ℃孵育30 min，倒置顯微鏡下觀測(cè)染色結(jié)果。雙硫腙染色液的配置參照侯萍等的方法[12]。

1.6 免疫熒光檢測(cè)

PBS緩沖液洗滌誘導(dǎo)結(jié)束的細(xì)胞3次，用4%的多聚甲醛室溫固定細(xì)胞20 min，PBS洗滌5 min/次×2次；1%牛血清蛋白封閉液室溫封閉30 min，去除非特異性陽(yáng)性；滴加一抗鼠抗人胰島素抗體，4 ℃孵育過(guò)夜；移除一抗，PBS洗滌3次，5 min/次；滴加FITC熒光標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，PBS洗滌3次，5 min/次；熒光顯微鏡下觀測(cè)拍照。

1.7 RT-PCR檢測(cè)

取誘導(dǎo) 15 d后的細(xì)胞，用 Trizol提取總RNA。然后通過(guò)RT-PCR方法檢測(cè)以下基因的表達(dá)：insulin和Pdx1。該實(shí)驗(yàn)采用的是凱基Super一步法RT-PCR試劑盒，RT反應(yīng)條件：42 ℃保溫1 h。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃，5 min；94 ℃變性30 s，最適退火溫度退火45 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分析并紫外成像系統(tǒng)拍照。引物序列及退火溫度見表1。

1.8 誘導(dǎo)細(xì)胞的胰島素分泌檢測(cè)

將誘導(dǎo)成功的細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞 (未經(jīng)誘導(dǎo)的hAMSCs) PBS緩沖液洗滌3次，而后于加有 30 mmol/L的葡萄糖的 10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，于0 h、6 h、12 h、24 h、36 h、48 h各時(shí)間點(diǎn)取0.2 mL培養(yǎng)液上清，3 000 r/min低溫離心10 min后取上清，于?80 ℃低溫冰箱保存待一起測(cè)定胰島素含量。胰島素檢測(cè)按照胰島素檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書嚴(yán)格操作。

2 結(jié)果

2.1 hAMSC的生長(zhǎng)狀況與特性

本實(shí)驗(yàn)分離hAMSCs時(shí)，結(jié)合使用細(xì)胞刮刀刮除上皮，降低酶作用時(shí)間和提高細(xì)胞存活率，分離獲得的細(xì)胞量高達(dá)108個(gè)/mL。hAMSCs隔夜貼壁，5~7 d首次傳代，P1代細(xì)胞培養(yǎng)中可見兩種形態(tài)細(xì)胞的生長(zhǎng)，一種梭形的hAMSCs，生長(zhǎng)增殖迅速，一種鵝卵石狀 (圖1A單箭頭所示)或煎雞蛋狀 (圖 1A雙箭頭所示) 的羊膜上皮樣細(xì)胞，貼壁牢固，增殖緩慢，不易消化。傳至P3代，細(xì)胞形態(tài)均一，呈漩渦狀生長(zhǎng)，基本為純的hAMSCs (圖1B)。

2.2 誘導(dǎo)分化結(jié)果

RPE誘導(dǎo)的hAMSCs形態(tài)變化明顯，誘導(dǎo)8 d后就可見細(xì)胞呈簇集落生長(zhǎng)，誘導(dǎo)15 d后，細(xì)胞幾乎分化融合為一團(tuán)，呈小島狀生長(zhǎng) (圖2)。

圖1 hAMSC的形態(tài)Fig. 1 Morphology of hAMSCs. (A) Primary cells cultured for 7 d. Double-headed arrow showed the amniotic epithelial-like cells. Single-headed arrow indicated the egg-shaped elliptical cells. Round arrow showed the spindle cell. (B) The third passage hAMSC, uniform cell morphology, like some whirlpools.

圖2 hAMSC的誘導(dǎo)分化Fig. 2 Differentiation of hAMSCs. (A) Cells before RPE-treating. (B) Cells after RPE-treating for 8 days. (C) Cells after RPE-treating for 15 days, like some small islands.

2.3 雙硫腙染色結(jié)果

胰島β細(xì)胞含有高濃度鋅，雙硫腙是很強(qiáng)的螯合劑，能與β細(xì)胞中的鋅結(jié)合呈現(xiàn)猩紅色，故可以作為胰島的染色劑。實(shí)驗(yàn)通過(guò)雙硫腙來(lái)染色誘導(dǎo)后的細(xì)胞，在顯微鏡下觀測(cè)可見猩紅色團(tuán)狀細(xì)胞簇。對(duì)照組則無(wú)顏色顯示 (圖3)。

2.4 免疫熒光檢測(cè)結(jié)果

通過(guò)細(xì)胞的免疫熒光法檢測(cè)誘導(dǎo)干細(xì)胞是否如胰島細(xì)胞具有胰島素分泌功能，由圖4A可見，誘導(dǎo)細(xì)胞呈胰島素陽(yáng)性表達(dá)，而非 RPE誘導(dǎo)組的胰島素?zé)o表達(dá) (圖4B)。

2.5 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)通過(guò)RT-PCR檢測(cè)誘導(dǎo)細(xì)胞是否有胰島細(xì)胞的相關(guān)基因表達(dá)，圖5實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，誘導(dǎo)細(xì)胞不僅可以表達(dá)人胰島素、胰高血糖素等基因的激活因子Pdx1，同時(shí)也表達(dá)人insulin，而在對(duì)照組未經(jīng)誘導(dǎo)的hAMSCs中未見insulin和Pdx1的表達(dá)，這就從基因?qū)W角度證明了誘導(dǎo)后的細(xì)胞具有胰島細(xì)胞的部分生物學(xué)特性。

2.6 誘導(dǎo)細(xì)胞胰島素分泌情況

圖6是經(jīng)高糖刺激后，誘導(dǎo)細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)的胰島素分泌情況，可見誘導(dǎo)細(xì)胞不僅可以分泌胰島素，而且隨著高糖刺激的時(shí)間的延長(zhǎng)，分泌量增多，但增加到一定的程度，就會(huì)逐漸趨于穩(wěn)定，而對(duì)照組非誘導(dǎo) hAMSCs則無(wú)胰島素分泌，對(duì)照組的非零數(shù)據(jù)值屬于實(shí)驗(yàn)誤差范圍。

圖3 雙硫腙染色Fig. 3 Dithizone staining. (A) The induced hAMSCs were positive for dithizone staining. Cell clusters were stained scarlet. (B) Control cells without RPE induction.

圖4 胰島素免疫熒光結(jié)果Fig. 4 Insulin immumofluorescence. (A) Induced hAMSCs. (B) hAMSC control. Immunofluorescence analysis revealed islet-like clusters differentiated from hAMSC were insulin-positive cells.

圖5 誘導(dǎo)細(xì)胞的RT-PCR分析Fig. 5 RT-PCR analysis of induced cells. 1: Pdx 1; 2: control 1 (Pdx1 expression of hAMSCs without inducing); 3: insulin; 4: control 2 (insulin gene expression of hAMSCs without inducing); 5: β-action. Pdx1 and insulin were positive expression in induced cells, but negative in control hAMSC.

圖6 高糖刺激后誘導(dǎo)細(xì)胞的胰島素分泌情況Fig. 6 Insulin secretion of induced hAMSCs after high glucose stimulation. Induced hAMSCs had increased insulin secretion with the glucose-stimulating time. The control hAMSCs didn’t secret insulin.

3 討論

近年來(lái)國(guó)內(nèi)外對(duì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為胰島樣細(xì)胞的研究較多，采用的干細(xì)胞主要有胚胎干細(xì)胞[13-14]和成體干細(xì)胞 (臍血來(lái)源干細(xì)胞、骨髓來(lái)源干細(xì)胞、胰腺干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞、肝來(lái)源干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞)[15-18]，誘導(dǎo)方法總體上有一步誘導(dǎo)法、二步誘導(dǎo)法和三步誘導(dǎo)法，有的用到了五步法，使用的誘導(dǎo)劑也很多，包括角質(zhì)化細(xì)胞生長(zhǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、activin-A，GLP-1、煙酰胺和 ITS介質(zhì) (I-胰島素、T-轉(zhuǎn)鐵蛋白、s-硒) 等[19]，雖然實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)出胰島樣細(xì)胞，但成本高、耗時(shí)長(zhǎng)，誘導(dǎo)率低。

本實(shí)驗(yàn)采用的是胎盤來(lái)源的人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞，具有來(lái)源廣泛、增殖能力強(qiáng)、免疫原性低和造血支持等優(yōu)勢(shì)[8]，但目前尚未報(bào)道其體外向胰島樣細(xì)胞誘導(dǎo)的研究。采用的誘導(dǎo)劑是異種來(lái)源的再生胰腺提取物，屬于天然生物誘導(dǎo)劑，成分更接近于機(jī)體微環(huán)境中成分，而且制取方便，成本低且誘導(dǎo)步驟簡(jiǎn)便，誘導(dǎo)率較高。Lee等[11]和Choi等[20]都利用RPE分別將脂肪干細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成功誘導(dǎo)為具有胰島表型的細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)采取的是第3代hAMSCs細(xì)胞，誘導(dǎo)15 d后就明顯可見類胰島樣細(xì)胞團(tuán)，經(jīng)雙硫腙染色后初步斷定其具有胰島細(xì)胞的特性。Pdx1和 insulin的陽(yáng)性表達(dá)從基因?qū)W的角度證明了誘導(dǎo)的成功，而胰島素分泌檢測(cè)是從細(xì)胞功能的角度證明了hAMSCs的成功誘導(dǎo)?？梢娫偕认偬崛∥锊粌H具有促進(jìn)胰腺再生的功能，而且具有調(diào)控和促進(jìn)不同種屬的干細(xì)胞向胰島分泌細(xì)胞分化的功能。

本研究表明異種來(lái)源的胰腺再生提取物可以誘導(dǎo)hAMSCs分化為胰島素分泌細(xì)胞，為糖尿病細(xì)胞替代治療提供了新的細(xì)胞來(lái)源和新的干細(xì)胞誘導(dǎo)技術(shù)方案。至于誘導(dǎo)成功的胰島素分泌細(xì)胞是否在體內(nèi)發(fā)揮正常作用，及是否具有其他致畸等副作用，還有待進(jìn)一步研究。

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