楊冬，田靖斐，陳晟，吳敬

1 江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122

2 江南大學(xué)生物工程學(xué)院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122

環(huán)糊精是由6個以上葡萄糖連結(jié)而成的環(huán)狀低聚化合物，根據(jù)葡萄糖單元數(shù)目的不同，環(huán)糊精可以分為 α-、β-、γ-、d-環(huán)糊精等，其中最常見的是聚合度為6、7、8的α-、β-、γ-環(huán)糊精。由于環(huán)糊精分子具有獨特的疏水空腔結(jié)構(gòu)，能包合疏水性客體分子，從而改變客體分子的溶解度、穩(wěn)定性等物理化學(xué)性質(zhì)，因此在食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用[1]。

環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶 (CGT酶，EC 2. 4. 1. 19) 通過分子內(nèi)的環(huán)化反應(yīng)能利用淀粉生產(chǎn)環(huán)糊精，這是其工業(yè)應(yīng)用的基礎(chǔ)[2]。用CGT酶生產(chǎn)環(huán)糊精一個主要的不利條件是所有已知的野生型CGT酶生產(chǎn)的是α-、β-、γ-環(huán)糊精的混合物，這給產(chǎn)物的分離純化帶來很大不便。因為要從混合物中分離得到一種純的環(huán)糊精需要通過有機溶劑絡(luò)合沉淀等一系列的附加步驟，這不僅會大幅度增加生產(chǎn)成本，而且由于有機溶劑的毒性會限制環(huán)糊精在食品、醫(yī)藥、化妝品等工業(yè)中的使用[3]，因此研究CGT酶的產(chǎn)物特異性的作用機理使其更好地適應(yīng)環(huán)糊精工業(yè)化生產(chǎn)的要求具有重要的意義[2,4]。

到目前為止，研究者對不同來源的 CGT酶進行了大量的定點突變，以期獲得具有理想產(chǎn)物特異性的突變體。絕大多數(shù)的突變是針對于CGT酶活性中心底物結(jié)合凹槽附近的氨基酸殘基[5-6]。X-射線衍射研究表明[7-10]，CGT酶活性中心凹槽至少包括 9個糖結(jié)合位點，標(biāo)記為+2~?7，每個亞位點能結(jié)合一個葡萄糖殘基。CGT酶的產(chǎn)物特異性取決于底物結(jié)合凹槽處亞位點數(shù)目和位置，在亞位點?1和+1之間的鍵斷裂之前底物的非還原末端到達(dá)亞位點?6、?7或?8分別對應(yīng)地生成產(chǎn)物α-、β-、γ-環(huán)糊精。研究表明，對底物結(jié)合凹槽周圍亞位點處的一個或多個重要的氨基酸殘基進行取代、插入或者刪除等突變會改變CGT酶產(chǎn)物中α∶β∶γ比例[11-14]，暗示了CGT酶的一級結(jié)構(gòu)是決定其產(chǎn)物特異性的主要內(nèi)在因素。許多研究者對CGT酶產(chǎn)物特異性與其一級結(jié)構(gòu)的相關(guān)性進行了大量研究。一些研究證實，亞位點?3和?7附近的氨基酸殘基是影響CGT酶產(chǎn)物特異性的關(guān)鍵位點[11,15-18]。

目前，國內(nèi)外已對α和β-CGT酶進行了大量深入的研究，但對γ-CGT酶的研究則比較少，目前只發(fā)現(xiàn)來源于Bacillus firmus 290-3，Bacillus sp. G-825-6，alkalophilic Bacillus clarkii 7364的CGT酶為γ-CGT酶，其中來源于B. clarkii 7 364的 γ-CGT酶由日本科學(xué)家首次發(fā)現(xiàn)[19]，其通過環(huán)化反應(yīng)轉(zhuǎn)化淀粉的產(chǎn)物主要為γ-環(huán)糊精，它的這種性質(zhì)使其成為理想的研究CGT酶產(chǎn)物特異性的對象。

本實驗以 B. clarkii 7364 CGT酶為研究對象，通過對不同來源的CGT酶蛋白質(zhì)序列進行多重序列比對發(fā)現(xiàn)，在亞位點?7處，從 141位氨基酸開始，γ-CGT酶缺失了存在于α及β-CGT酶中的6個氨基酸，相應(yīng)的位置只有142位的天冬氨酸，基于以上分析，本研究試圖通過重疊PCR的方法將γ-CGT酶142位天冬氨酸用β-CGT酶中保守的6個氨基酸替換，以探討該6個氨基酸是否是導(dǎo)致CGT酶產(chǎn)物特異性產(chǎn)生差異的原因，從而為通過分子改造得到理想產(chǎn)物特異性的CGT酶提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

重組質(zhì)粒 pET-20b+/cgt由本實驗室構(gòu)建并保藏。克隆宿主菌E. coli JM109和表達(dá)宿主菌E. coli BL21 (DE3) 由本實驗室保藏?？寺≠|(zhì)粒pMD18T-simple和表達(dá)質(zhì)粒pET-20b (+) 購自大連寶生物工程有限公司。

1.1.2 酶和試劑

質(zhì)粒小量提取試劑盒購自上海生工生物工程公司，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、Taq酶、primerStarDNA聚合酶購自TaKaRa公司，氨芐青霉素、CIAP 購自華美生物工程公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

培養(yǎng)基LB、TB、SOB均按Invitrogen公司操作手冊方法配制。

1.2 方法

1.2.1 突變體的克隆

根據(jù)B. clarkii 7364 γ-CGT酶基因序列為模板，設(shè)計如下4條引物 (表1)，F(xiàn)和R為基因上下游引物，在引物的末端分別引入酶切位點NcoⅠ (CCATGG) 和 EcoRⅠ (GAATCC)，F(xiàn)m和Rm為突變位點的上下游引物。下劃線部分為突變位點核酸序列。

表1 突變引物Table 1 Mutant primers used in PCR reactions

分別以F/Fm以及Rm/R為引物，擴增出含有突變位點的片段A和B。

PCR擴增條件：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2.5 min，共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

PCR產(chǎn)物純化后，作為第2次重疊PCR的模板。向PCR反應(yīng)體系中加入等摩爾的片段A和B，不加入引物F和R，交錯延伸5個循環(huán)，PCR擴增條件為：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，55℃1 min，72 ℃ 2.5 min；72 ℃延伸10 min。然后加入引物F和R，擴增30個循環(huán)，PCR擴增條件為：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 1 min，72 ℃2.5 min，共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

PCR產(chǎn)物純化后，16 ℃連接 pMD18T-simple，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli JM109，挑取陽性克隆，雙酶切鑒定后，送上海生物工程有限公司測序。

測序正確的突變體基因雙酶切后，膠回收得到目的基因片段，16 ℃連接表達(dá)載體 pET-20b (+)，轉(zhuǎn)化E. coli JM109，提取質(zhì)粒，雙酶切鑒定陽性克隆。

鑒定正確的表達(dá)質(zhì)粒熱激轉(zhuǎn)化E. coli BL21 (DE3)，挑取單菌落接種LB培養(yǎng)基，保存菌種。

1.2.2 突變體的胞外表達(dá)

種子培養(yǎng)：將保藏的菌種接入裝有50 mL LB培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，接種量為0.1%，回旋式搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，培養(yǎng)溫度為37 ℃，培養(yǎng)8 h。

發(fā)酵培養(yǎng)：將培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)液按 5% (V/V) 的接種量，接種至裝有100 mL TB培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中進行發(fā)酵培養(yǎng)，開始培養(yǎng)溫度為37 ℃，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，當(dāng)菌體培養(yǎng)至OD600為0.6時，添加IPTG至0.01 mmol/L，迅速轉(zhuǎn)至25 ℃搖床，繼續(xù)誘導(dǎo)72 h。

各培養(yǎng)基中使用前添加100 mg/L氨芐青霉素。

1.2.3 突變體的純化

含有突變質(zhì)粒的基因工程菌培養(yǎng) 72 h后的發(fā)酵液在12 000 r/min下離心20 min除去菌體，獲得上清液。上清液經(jīng)過70% (W/V) 硫酸銨沉淀過夜后，沉淀物用適量緩沖液 A (50 mmol/L NaCl，pH 10.0) 溶解，并在緩沖液A中透析過夜，得到Ni柱親和層析的上樣樣品。Ni親和柱用緩沖液A平衡后上樣，然后分別用緩沖液A、含0~480 mmol/L咪唑的緩沖液A、含480 mmol/L咪唑的緩沖液A洗脫，分步收集。含CGT酶的組分在50 mmol/L NaCl (pH 10.0) 中透析過夜，純化的重組CGT酶在?80 ℃保存。

1.2.4 酶活測定

甲基橙法測定α-環(huán)化活力的方法如下[20]：取適當(dāng)稀釋的酶液0.1 mL，加入裝有0.9 mL預(yù)先用50 mmol/L的甘氨酸-NaOH緩沖液 (pH 10.0)配制的3% (W/V) 可溶性淀粉溶液的試管中，在40 ℃下反應(yīng)10 min后，加入1.0 mL 1.0 mol/L 的鹽酸停止反應(yīng)，再加入1.0 mL用50 mmol/L的甘氨酸-NaOH緩沖液配制的 0.1 mmol/L 甲基橙，在20 ℃下保溫20 min，在505 nm下測定吸光度。對應(yīng) α-環(huán)糊精標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出環(huán)糊精濃度，一個酶活單位 (U) 定義為在上述條件下每分鐘生成1 μmol的α-環(huán)糊精所需的酶量。

酚酞法測定b-環(huán)化活力的方法如下[21]：取適當(dāng)稀釋的酶液0.1 mL，加入裝有0.9 mL預(yù)先用50 mmol/L的甘氨酸-NaOH緩沖液 (pH 10.0) 配制的 3% (W/V) 可溶性淀粉溶液的試管中，在40 ℃下反應(yīng)10 min后，加入3.5 mL 30 mmol/L NaOH和0.5 mL由5 mmol/L Na2CO3溶液配制的0.02% (W/V) 酚酞停止反應(yīng)，在室溫下保溫20 min，在550 nm下測定吸光度。一個酶活單位定義為在上述條件下每分鐘生成1 μmol b-環(huán)糊精所需的酶量。

溴甲酚氯法測定g-環(huán)化活力的方法如下[22]：取適當(dāng)稀釋的酶液0.1 mL，加入裝有0.9 mL預(yù)先用50 mmol/L的甘氨酸-NaOH緩沖液 (pH 10.0) 配制的 3% (W/V) 可溶性淀粉溶液的試管中，在40 ℃下反應(yīng)10 min后，加入50 mL 1.0 mol/L的鹽酸停止反應(yīng)，再加入2 mL 0.2 mol/L檸檬酸緩沖液 (pH 4.2) 和100 μL 5 mmol/L 溴甲酚氯溶液，在室溫下保溫20 min，在630 nm下測定吸光度。一個酶活單位定義為在上述條件下每分鐘生成1 μmol g-環(huán)糊精所需的酶量。

1.2.5 蛋白質(zhì)濃度測定

蛋白質(zhì)濃度測定使用Bradford法，使用牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品[23]。

1.2.6 突變體的結(jié)構(gòu)模擬

野生和突變 CGT酶的理論結(jié)構(gòu)通過SWISS-MODEL蛋白模擬在線服務(wù)器 (http:// www.expasy.ch/swissmod/SWISS-MODEL.html)進行同源模擬獲得[24-26]。

1.2.7 產(chǎn)物特異性分析

采用高效液相色譜法 (HPLC) 測定。配制5% (W/V) 可溶性淀粉溶液作為底物，5 g淀粉溶解在90 mL 50 mmol/L的甘氨酸-NaOH緩沖液(野生型pH為10.0，突變體pH為9.0) 中，定容至100 mL，在沸水中煮沸30 min。加入一定量的野生型和突變體CGT酶使反應(yīng)體系中酶活為0.2 U/mL，置于50 ℃、200 r/min搖床中反應(yīng)12 h，隔時間取樣600 μL，12 000 r/min離心10 min，取上清500 μL，加5 μL糖化酶 (70 U/mL)，在30 ℃糖化1 h，10 min煮沸滅活，12 000 r/min離心30 min，取上清0.45 μm超濾膜過濾后取20 μL上機分析。采用HPLC進行產(chǎn)物分析的色譜條件是：Waters 600HPLC色譜儀，Waters自動進樣器，色譜柱 Lichrosorb NH2(4.6 mm× 150 mm)，Waters2410示差檢測器；流動相 (V/V)為70%乙腈水溶液，流速0.8 mL/min；柱溫30 ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 γ-CGT酶產(chǎn)物特異性位點分析

來源于B. circulans 251的β-CGT酶與麥芽九糖抑制劑的復(fù)合結(jié)構(gòu)表明，在 β-CGT酶中，亞位點?7處氨基酸與作為中間產(chǎn)物還原末端的第9個葡萄糖通過氫鍵相互作用 (圖1)，對其進行空間定位，其后這個葡萄糖會在其他氨基酸的作用下發(fā)生空間偏移，與亞位點?1處的葡萄糖相互作用形成α-1,4糖苷鍵，環(huán)化產(chǎn)物形成，因此亞位點?7處的相關(guān)氨基酸對CGT酶的產(chǎn)物特異性起著非常關(guān)鍵的作用[7-9]。

利用EBI (www.ebi.ac.uk) 的在線clustalw2工具，對不同來源 CGT酶氨基酸序列進行多重序列比對。其中來源于 Thermoanaerobacter sp. ATCC53、 T. thermosulfurigenes EM1、 B. stearothermophylus strain NO2的CGT酶主要產(chǎn)物為α-環(huán)糊精，而來源于B. firmus 290-3、Bacillus sp. G-825-6、B. clarkii 7364的CGT酶主要產(chǎn)生γ-環(huán)糊精，其余均以產(chǎn)生β-環(huán)糊精為主 (圖2)[2,5]。

多重序列比對結(jié)果表明，γ-CGT酶在亞位點?7處只有 142位天冬氨酸的存在，缺失另外 6個存在于α及β-CGT酶中的氨基酸。

通過SWISS-MODEL蛋白模擬在線服務(wù)器，以來自Geobacillus stearothermophilus CGT酶的結(jié)構(gòu)為模板 (PDB編號：1CYG)，成功模擬得到野生型γ-CGT酶的結(jié)構(gòu)，與已經(jīng)解析出的CGT酶晶體結(jié)構(gòu)相比，γ-CGT酶的整體結(jié)構(gòu)并沒有大的變化，整個酶分子同β-CGT酶一樣由5個結(jié)構(gòu)域組成，主鏈的空間走向也基本一致，但在亞位點?7處，局部結(jié)構(gòu)發(fā)生了比較明顯的變化 (圖3)，由于亞位點?7處6個氨基酸的缺失，使得此位置的氨基酸鏈變短，而該結(jié)構(gòu)構(gòu)象的變化有可能是導(dǎo)致 γ-CGT酶具有較高的產(chǎn)物特異性的原因。因此，本研究擬在γ-CGT酶亞位點?7處通過突變將142位天冬氨酸用來源于β-CGT酶的保守氨基酸SSDDPFF替換，來探討這種插入突變對其產(chǎn)物特異性的影響。

圖1 來源于堿性芽胞桿菌251的CGT酶與麥芽九糖抑制劑在活性位點上相互作用示意圖[8]Fig. 1 Schematic representation of the interactions of B. circulans strain 251 CGTase with a maltononaose substrate at the active site[8].

圖2 不同來源CGT酶的多重序列比對結(jié)果Fig. 2 Multiple alignment of amino acid sequences of CGTase.

圖3 β-CGT酶晶體結(jié)構(gòu)與模擬γ-CGT酶結(jié)構(gòu)對比Fig. 3 Alignment of γ-CGTase model structure with β-CGTase crystal structure.

2.2 突變體的克隆表達(dá)

通過 overlapPCR擴增出突變基因。突變基因連接pMD-18T后進行測序，突變位點正確突變。將突變基因克隆至 pET-20b (+)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21 (DE3)，挑取陽性克隆進行培養(yǎng)，SDS-PAGE鑒定發(fā)現(xiàn)，突變體成功表達(dá) (圖4)。粗酶液經(jīng) Ni-柱純化，得到電泳純蛋白 (圖5)。檢測純化后突變酶和野生酶的環(huán)糊精形成活力，結(jié)果表明，相對于野生酶，突變酶的γ-環(huán)糊精形成活力從14.1 U/mg降至1.3 U/mg，α和β-環(huán)糊精形成活力均有小幅度提高，其中，α-環(huán)糊精形成活力從0.4 U/mg升高至2.4 U/mg，而β-環(huán)糊精形成活力從2.5 U/mg升高至3.1 U/mg，但6個氨基酸的插入突變導(dǎo)致總的環(huán)化活力降低(表2)。

圖4 野生型和突變體CGT酶的SDS-PAGE分析Fig. 4 SDS-PAGE analysis of the wild type and mutant CGTase. M: protein marker; 1: wild type supernatant fractionation; 2: wild type periplasmic fractionation; 3: wild type inclusion body; 4: mutant supernatant fractionation; 5: mutant periplasmic fractionation; 6: mutant inclusion body.

圖5 純化后野生型和突變CGT酶的SDS-PAGE分析Fig. 5 SDS-PAGE analysis of the purification of wild type and mutant CGTase. M: protein marker; 1: wild type; 2: mutant.

2.3 突變體的最適溫度和最適pH

為了確定酶轉(zhuǎn)化的最佳反應(yīng)條件，考察了突變體的最適溫度和pH。如圖6所示，野生型和突變體的最適溫度均為 50 ℃，當(dāng)溫度升高至60 ℃時，突變體酶活下降較快，70 ℃時野生型酶活下降至原來的50%，突變體已基本失活。

與野生型相比，pH對突變體的影響不是很大 (圖7)，在酸性條件下，突變體和野生型酶活都較低，堿性條件下，二者的酶活開始隨pH的升高而增大，但突變體的最適pH為9，而野生型為10，pH為11時，野生型和突變體的活性都有所下降，但都可保持80%的活力。

表2 來源于B.clarkii 7364的野生和突變CGT酶的環(huán)糊精形成比活力Table 2 Cyclodextrin forming specific activities of the wild-type and mutant CGTases from B. clarkii 7364

圖6 溫度對野生型和突變體活力的影響Fig.6 Effect of temperature on the wild type and mutant γ-CGTase.

圖7 pH對野生型和突變體活力的影響Fig.7 Effect of pH on the wild type and mutant γ-CGTase.

2.4 突變體的產(chǎn)物特異性

在野生酶和突變酶各自的最適溫度和 pH下進行酶轉(zhuǎn)化淀粉生產(chǎn)環(huán)糊精實驗，從圖 8可知，野生酶轉(zhuǎn)化淀粉生產(chǎn)環(huán)糊精中α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精和γ-環(huán)糊精之比為1.2∶2.1∶10.5，其中γ-環(huán)糊精占 76%，α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精分別占8.7%和 15.2%。突變酶轉(zhuǎn)化淀粉生產(chǎn)環(huán)糊精中α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精和 γ-環(huán)糊精之比為1.5∶2∶0.5，其中 γ-環(huán)糊精所占比例縮減為12.5%，α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精分別提高至37.5%和50%。突變酶γ-環(huán)糊精的產(chǎn)量降低，而α-環(huán)糊精和 β-環(huán)糊精的產(chǎn)量有所升高，與預(yù)期結(jié)果一致。但相對于野生酶，突變酶的總轉(zhuǎn)化率從13.7 g/L降至4 g/L。

2.5 作用機理分析

在β-CGT酶中，γ-CGT酶所缺失的6個氨基酸位于底物結(jié)合溝槽的末端，與其他一些氨基酸殘基共同構(gòu)成了亞位點?7，與葡萄鏈末端的第9個葡萄糖殘基結(jié)合相互作用，對其進行空間定位。在γ-CGT酶中添加這6個氨基酸，造成插入突變后，酶轉(zhuǎn)化淀粉生成的環(huán)糊精中γ-環(huán)糊精所占比例明顯降低。對比 β-CGT酶以及模擬的突變前后γ-CGT酶的晶體結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn) (圖9)，在亞位點?7處，β-CGT酶的環(huán)狀結(jié)構(gòu)較大，未突變前γ-CGT酶的環(huán)狀結(jié)構(gòu)較小，而添加6個氨基酸后，γ-CGT酶原來較小的環(huán)狀結(jié)構(gòu)變大，其空間走向與 β-CGT酶基本一致。進一步分析這種亞位點?7處環(huán)狀結(jié)構(gòu)的變化發(fā)現(xiàn)，突變前，γ-CGT酶較小的環(huán)狀結(jié)構(gòu)使得底物結(jié)合凹槽空間變大，從而為較長葡萄糖鏈的結(jié)合提供了足夠的空間，因此這種構(gòu)象更適合于大的γ-環(huán)糊精的生成。突變后，這6個氨基酸會與相應(yīng)的葡萄糖殘基相互作用，從而限制了葡萄糖鏈的結(jié)合，使得葡萄糖鏈結(jié)合的空間位阻變大，其所能結(jié)合的空間變小，從而限制了較長葡萄糖鏈的結(jié)合，因此這種構(gòu)象不利于大的γ-環(huán)糊精的生成。

圖8 野生型 (A) 和突變 (B) CGT酶分別作用于5% (W/V) 可溶性淀粉的環(huán)糊精形成過程Fig. 8 Courses of formation of CDs from 5% (W/V) soluble starch by wild-type and mutant CGTase, respectively. (A) Wild-type CGTase. (B) Mutant CGTase.

圖9 β-CGT酶晶體結(jié)構(gòu) (紅色) 與野生 γ-CGT酶(綠色) 和突變γ-CGT酶 (黃色) 模擬結(jié)構(gòu)對比Fig. 9 Alignment of wild type (green) and mutant γ-CGTase (yellow) model structure with β-CGTase (red) crystal structure.

3 結(jié)論

本實驗初步探討了亞位點?7處的氨基酸殘基對γ-CGTase酶產(chǎn)物特異性產(chǎn)生影響的規(guī)律和機理。在γ-CGT酶亞位點?7處中添加6個在α-、β-CGT酶中保守的氨基酸，造成突變酶轉(zhuǎn)化淀粉生成的環(huán)糊精中 γ-環(huán)糊精所占的比例下降了63.5%，而 α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精分別提高了28.8%和 34.8%。由此確定 γ-CGT酶亞位點?7處氨基酸的缺失是其γ-環(huán)糊精形成的關(guān)鍵構(gòu)象，并從其蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)進行了一定的理論解釋。這為進一步確定CGT酶的產(chǎn)物特異性與其結(jié)構(gòu)的相關(guān)性，為進一步闡明CGT酶的催促反應(yīng)機理奠定了基礎(chǔ)，同時也為構(gòu)建具有理想產(chǎn)物特異性的CGT酶突變體提供了依據(jù)。

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