茍冬梅，梁麗亞，劉嶸明，張常青，吳明科，馬江鋒，陳可泉，朱建國,2，姜岷

1南京工業(yè)大學生物與制藥工程學院 材料化學工程國家重點實驗室，江蘇 南京 211816

2常茂生物化學工程股份有限公司博士后科研工作站，江蘇 常州 213034

工業(yè)生物技術(shù)

過量表達煙酸單核苷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶對大腸桿菌NZN111產(chǎn)丁二酸的影響

茍冬梅1，梁麗亞1，劉嶸明1，張常青1，吳明科1，馬江鋒1，陳可泉1，朱建國1,2，姜岷1

1南京工業(yè)大學生物與制藥工程學院 材料化學工程國家重點實驗室，江蘇 南京 211816

2常茂生物化學工程股份有限公司博士后科研工作站，江蘇 常州 213034

大腸桿菌 NZN111是敲除了乳酸脫氫酶的編碼基因 (ldhA) 和丙酮酸-甲酸裂解酶的編碼基因 (pflB)的發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的潛力菌株。厭氧條件下NADH不能及時再生為NAD+，引起胞內(nèi)輔酶NAD(H) 的不平衡，最終導致厭氧條件下菌株不能利用葡萄糖生長代謝。nadD為催化NAD(H) 合成途徑中煙酸單核苷酸 (NaMN)生成煙酸腺嘌呤二核苷酸 (NaAD) 的煙酸單核苷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶 (Nicotinic acid mononucleotide adenylyltransferase，NAMNAT) 的編碼基因，通過過量表達nadD基因能夠提高 NAD(H) 總量與維持合適的NADH/NAD+比例。文中構(gòu)建了重組菌E. coliNZN111/pTrc99a-nadD，在厭氧搖瓶發(fā)酵過程中通過添加終濃度為1.0 mmol/L的IPTG誘導表達，重組菌E. coliNZN111/pTrc99a-nadD中NAD+和NADH的濃度分別比宿主菌E. coliNZN111提高了3.21倍和1.67倍，NAD(H)總量提高了2.63倍，NADH/NAD+從0.64降低為0.41，使重組菌株恢復了厭氧條件下生長和代謝葡萄糖的能力。重組菌與對照菌相比，72 h內(nèi)可以消耗14.0 g/L的葡萄糖產(chǎn)6.23 g/L的丁二酸，丁二酸產(chǎn)量增加了19倍。

丁二酸，煙酸單核苷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶，厭氧發(fā)酵，大腸桿菌NZN111，NADH/NAD+

Abstract:Escherichia coliNZN111 is a promising strain withldhAandpflBgenes inactivated for the production of succinic acid. However, with these mutations, NAD+could not be regenerated from NADH, and an unbalanced NADH/NAD+ratio eliminated cell growth and glucose utilization under anaerobic conditions. Nicotinic acid mononucleotide adenylyltransferase (NAMNAT), encoded by thenadDgene, catalyzes the reaction from nicotinic acid mononucleotide (NaMN) to nicotinic acid adenine dinucleotide (NaAD) during the synthetic pathway of NAD(H).Overexpression of thenadDgene could enhance the concentration of NAD(H) and maintain a suitable NADH/NAD+ratio.In this study, we constructed a recombinant strainE. coliNZN111/pTrc99a-nadD, and overexpressed NAMNAT with 1.0 mmol/L of IPTG under anaerobic conditions in sealed bottles. Compared toE. coliNZN111, the concentrations of NAD+and NADH in the recombinant strain increased by 3.21-fold and 1.67-fold, respectively. The total concentration of NAD(H)was increased by 2.63-fold, and the ratio of NADH/NAD+decreased from 0.64 to 0.42. The recombinant strain restored the cell growth and glucose utilization under anaerobic conditions. After 72 h, the recombinant strain could consume 14.0 g/L of glucose to produce 6.23 g/L of succinic acid, and the concentration of succinic acid was 19-fold higher than inE. coliNZN111.

Keywords:succinic acid, nicotinic acid mononucleotide adenylyltransferase, anaerobic fermentation,Escherichia coliNZN111, NADH/NAD+

丁二酸 (又稱琥珀酸) 作為一種 C4平臺化合物，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)藥、染料、香料、油漆、食品、塑料、合成有機化學品以及聚丁二酸丁二醇酯 (PBS) 類生物可降解材料等行業(yè)，被美國能源部認為是未來 12種最有價值的生物煉制產(chǎn)品之一[1-4]。利用微生物發(fā)酵法轉(zhuǎn)化可再生資源生產(chǎn)丁二酸，價格低廉、污染小、且在發(fā)酵過程中可吸收固定CO2，開辟了溫室氣體利用的新途徑，工藝過程具有綠色、能耗低、原子經(jīng)濟性高的優(yōu)點，成為近年來的研究熱點[5-9]。

大腸桿菌NZN111由于缺乏了乳酸脫氫酶的編碼基因 (ldhA) 和丙酮酸-甲酸裂解酶的編碼基因 (pflB) 而使副產(chǎn)物乳酸和甲酸的生產(chǎn)途徑阻斷，具有潛在生產(chǎn)丁二酸的能力。但同時由于NADH依賴的乳酸脫氫酶 (LDH) 無法合成而限制了糖酵解過程中形成的 NADH再生為 NAD+的過程，造成輔酶不平衡,導致該菌株厭氧條件下不能利用葡萄糖進行生長[10-13]。Hong和 Lee[14]選擇還原性糖山梨醇作為碳源，當以CO2為氣相時，20 g/L山梨醇發(fā)酵產(chǎn)生10 g/L丁二酸，轉(zhuǎn)化率達到50%。Boernke等[15]在E. coliNZN111中克隆表達蘋果酸脫氫酶基因 (mdh) 后，能使其在厭氧條件下生長。同時，Stols等[16-17]將豬蛔蟲Ascaris suum中的蘋果酸酶基因轉(zhuǎn)入到E. coliNZN111后，丁二酸的產(chǎn)率和生產(chǎn)強度分別為0.39 g/g 和 0.29 g/(L·h)。Goldberg 等[18]和 Wang等[19]都曾研究過在E. coli中過量表達富馬酸還原酶基因 (frd) 直接轉(zhuǎn)化富馬酸生成丁二酸，獲得較好的結(jié)果，富馬酸轉(zhuǎn)化率可達93%。以上3種酶都是丁二酸生成途徑中的關(guān)鍵酶，并且在反應(yīng)時都能使 NADH被氧化為 NAD+，緩解NZN111中輔酶系統(tǒng)的不平衡，使其能在厭氧的條件下生長并能產(chǎn)生一定量的丁二酸。由此可知，在構(gòu)建高產(chǎn)丁二酸大腸桿菌菌株過程中，確保還原力的供給和胞內(nèi)輔酶 NAD(H) 的平衡是重組大腸桿菌高產(chǎn)丁二酸的關(guān)鍵因素。圖1顯示了大腸桿菌的厭氧混合酸發(fā)酵途徑[20]。

大腸桿菌中 NAD(H) 的生物合成途經(jīng)如圖2所示。San等[21-22]通過在大腸桿菌中過量表達鼠傷寒沙門氏菌Salmonella typhimurium中的煙酸轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶基因 (pncB)，使NAD的總量增加，NADH/NAD+的比例降低，從而使其代謝流發(fā)生改變。Heuser等[23]通過在大腸桿菌中過量表達煙酸轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶基因 (pncB) 和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸合成酶基因 (nadE) 后，均使細胞中NAD(H)的總量增加了兩倍多，通過將這兩個基因共表達后，使胞內(nèi)的 NAD(H) 的總量增加了7倍多。

圖1 大腸桿菌厭氧混合酸發(fā)酵途徑[20]Fig.1 Pathways of anaerobic mixed acid fermentation forEscherichia coli[20].

圖2 NAD(H) 在大腸桿菌中的生物合成途經(jīng)[23]Fig.2 NAD(H) metabolism inEscherichia coli[23]. NaMN: nicotinic acid mononucleotide; NaAD: nicotinic acid adenine dinucleotide; NAD: nicotinamide adenine dinucleotide; PRPP: Phosphoribosyl pyrophosphate; NMN:nicotinamide mononucleotide.

本研究通過過量表達 NAD(H) 生物合成途經(jīng)中的煙酸單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶，構(gòu)建了重組菌E. coliNZN111/pTrc99a-nadD，增加NAD(H) 的總量，降低NADH/NAD+比例，從而維持該菌株胞內(nèi)的輔酶平衡，恢復了其在厭氧條件下的生長及耗糖能力，減少了副產(chǎn)物丙酮酸的積累并促進了丁二酸的合成。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌 DH5α由本實驗室保藏；質(zhì)粒pTrc99a由南京師范大學邵蔚藍教授惠贈；E. coliNZN111 (ldhA::KanpflB::Cam) 由南伊利諾伊卡本代爾大學Clark教授惠贈，作為宿主菌和對照菌。

1.1.2 主要試劑

氨芐青霉素、氯霉素、硫酸卡那霉素，購自上海生工生物工程有限公司；基因組提取試劑盒和瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；質(zhì)粒小量快速提取試劑盒為上海申能博彩生物科技有限公司產(chǎn)品；DNA片段回收試劑盒、限制性內(nèi)切酶、Pyrobest DNA聚合酶和 T4 DNA連接酶為大連寶生物有限公司產(chǎn)品；酵母提取物和胰蛋白胨為Oxoid公司產(chǎn)品；CO2氣體購自南京上元工業(yè)氣體廠。

表1 研究中所用到的引物Table 1 Primers used in this study

1.2 方法

1.2.1nadD基因的克隆

引物設(shè)計：參照nadD基因序列 (來源于E. coliK12基因組，GenBank Accession No. 0009435) 設(shè)計，由上海申能博彩生物科技有限公司合成。分別在上下游引物的 5￠端引入了NcoI和HindⅢ酶切位點 (下劃線標示)，引物序列如表1所示。

PCR 反應(yīng)體系：ddH2O 37.5 μL，10×pyrobest bufferⅡ5 μL，dNTPs (10 mmol/L) 4 μL，模板DNA (100 μg/ L) 0.5 μL，上下游引物(50 μmol/L)各 1 μL，Pyrobest DNA Polymerase (2.5 U/μL)1 μL?？傮w積 50 μL。

PCR 反應(yīng)條件：94 ℃預變性 5 min；94 ℃45 s，55 ℃45 s，72 ℃72 s，35 個循環(huán)；72 ℃10 min。

1.2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

將純化后的nadD基因片段以及質(zhì)粒pTrc99a進行NcoⅠ和Hind Ⅲ雙酶切，把雙酶切后得到的片段在T4 DNA連接酶的作用下16 ℃連接過夜，構(gòu)建得到重組質(zhì)粒 pTrc99a-nadD并轉(zhuǎn)化于E. coliNZN111感受態(tài)。涂布于含氯霉素、硫酸卡那霉素和氨芐青霉素的 LB平板上 37 ℃培養(yǎng) 12 h后挑選抗性克隆，提取質(zhì)粒后進行Hind Ⅲ單酶切及NcoⅠ和Hind Ⅲ的雙酶切鑒定。菌體轉(zhuǎn)化采用CaCl2法[24]。

1.2.3 重組煙酸單核苷酸先苷轉(zhuǎn)移酶的誘導表達

有氧誘導：37 ℃、200 r/min培養(yǎng)菌體到OD600約0.6左右，IPTG至終濃度為1.0 mmol/L，30 ℃、170 r/min誘導8 h。

樣品處理：采取超3 s停5 s的策略共超聲破碎3 min，于4 ℃、12 000 r/min 離心15 min，取上清即粗酶液，進行SDS-PAGE分析。

1.2.4 輔酶NADH與NAD+濃度的測定[25]

反應(yīng)時依次添加150 μL上述的細胞提取液、0.9 mL的純水、1.8 mL的混合反應(yīng)液 (等體積的1.0 mol/L甘氨酸二肽/煙酸緩沖液、純乙醇、40 mmol/L EDTA、4.2 mmol/L噻吩蘭和雙倍體積的16.6 mmol/L PES混合，30 ℃水浴10 min) 和150 μL的乙醇脫氫酶 (500 U/mL)，迅速混勻后，測定波長570 nm處的吸光度值A(chǔ)570，做出測定得到的吸光度值A(chǔ)570隨時間變化曲線，并將所得到曲線的斜率帶到標準曲線中去，得到待測樣品中NADH與NAD+的濃度。

1.2.5 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

有氧搖瓶培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基：酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉5 g/L，pH 7.0，氯霉素、硫酸卡那霉素和氨芐青霉素的終濃度分別為25 μg/mL、30 μg/mL 和 100 μg/mL。

純厭氧血清瓶發(fā)酵及兩階段發(fā)酵用培養(yǎng)基：30 mL LB液體培養(yǎng)基，添加0.48 g堿式碳酸鎂，20 g/L葡萄糖，抗生素添加同有氧培養(yǎng)，添加終濃度為1.0 mmol/L的誘導劑IPTG (異丙基-β-D-硫代半乳糖苷) 以誘導表達NAMNAT。

1.2.6 培養(yǎng)方法

某項目建設(shè)規(guī)模全長70.4km，占地約6800畝（約4.53km2），設(shè)互通立交7個，特大型橋梁1座，橋長1578m，特長隧道1座，長4.88km。全線各類橋梁共計46座，總長約11.2km；全線隧道共計11座，全長約12.6km，項目全線橋隧比達33.8%，特別是項目南段（傅家至東勝）橋隧比高達67%，施工難度較大。項目總投資8.21×109元，為BOT+EPC總承包項目。工期始終處于受控狀態(tài)，本項目工程已近尾聲，本文通過對本項目的進度管理分析淺談工期的影響因素和采取的應(yīng)對措施，以供高速公路管理人員參考。

有氧搖瓶培養(yǎng)：將保存于-80 ℃的菌種在加有相應(yīng)抗生素的平板上活化，挑單菌落到 5 mL LB試管，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)10 h，1%接種量接種到好氧培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)5 h。

純厭氧血清瓶發(fā)酵：轉(zhuǎn)接10%的菌液到血清瓶中，通入過濾除菌后的CO2氣體2 min，保證血清瓶中為厭氧環(huán)境，加入終濃度 1.0 mmol/L的IPTG，30 ℃、170 r/min發(fā)酵72 h。

兩階段發(fā)酵：將100 mL有氧搖瓶培養(yǎng)至對數(shù)期末期的菌液，8 000 r/min離心10 min，倒掉上清，加入3～4 mL培養(yǎng)液，進行混勻，然后加入含有30 mL LB加碳酸鎂的血清瓶中，通入過濾除菌后的CO2氣體2 min，保證血清瓶中為厭氧環(huán)境，加入終濃度1.0 mmol/L的IPTG，30 ℃、170 r/min發(fā)酵24 h。

1.2.7 最佳生長條件的確定

1) IPTG誘導最佳濃度的確定：厭氧血清瓶發(fā)酵時，在初始OD600值為 0.7的培養(yǎng)液中加入 IPTG終濃度分別為 0.1、0.3、0.5、0.7、1.0、1.2、1.5 mmol/L，30 ℃、170 r/min厭氧發(fā)酵，發(fā)酵周期72 h，留樣測定OD600，殘?zhí)呛投《岷?。不同IPTG濃度的搖瓶分別有3個平行樣。

2) 煙酸最佳濃度的確定：厭氧血清瓶發(fā)酵時，在初始OD600值為0.7的培養(yǎng)液中加入終濃度分別為0、0.1、0.3 mmol/L的煙酸和1.0 mmol/L的IPTG，厭氧發(fā)酵30 ℃、170 r/min，發(fā)酵周期72 h，留樣測定OD600，殘?zhí)呛投《岷?。不同煙酸濃度的搖瓶分別有3個平行樣。

1.2.8 發(fā)酵及代謝物分析

2 結(jié)果與分析

2.1 煙酸單核苷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶基因的克隆與表達

用限制性內(nèi)切酶NcoⅠ和Hind Ⅲ雙酶切PCR擴增后的目的基因片段nadD和載體pTrc99a，酶切產(chǎn)物純化后用T4 DNA連接酶進行連接，構(gòu)建表達載體pTrc99a-nadD，構(gòu)建流程如圖3所示。

圖3 pTrc99a-nadD表達載體的構(gòu)建圖譜Fig.3 Map of construction of pTrc99a-nadDexpression vector.

重組質(zhì)粒 pTrc99a-nadD經(jīng)限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ酶切的條帶大小為4 925 bp，經(jīng)限制性內(nèi)切酶NcoI和Hind Ⅲ酶切的條帶大小分別為805 bp和4 120 bp。重組質(zhì)粒經(jīng)單、雙酶切鑒定(圖 4)，結(jié)果與預期一致，并經(jīng)測序后目的基因序列與公布的序列100%匹配。

圖 4 重組質(zhì)粒 pTrc99a-nadD的單酶切和雙酶切鑒定Fig.4 Identification of pTrc99a-nadDbyrestriction endonuclease digestion. M: λ-EcoT 14 I digest marker;1: pTrc99a-nadDdigested withHind Ⅲ; 2: pTrc99anadDdigested withNcoI andHind Ⅲ.

2.2 NAMNAT酶活的誘導表達

37 ℃、200 r/min培養(yǎng)菌體到OD600為0.7左右，加入IPTG至終濃度分別為1.0 mmol/L，30 ℃、170 r/min誘導8 h后，對E. coliNZN111/pTrc99a和構(gòu)建的重組菌株進行粗酶液的 SDS-PAGE電泳以及NADH和NAD+測定，結(jié)果如圖5和表2所示。

由圖5全菌體蛋白電泳可見25 kDa左右的目的條帶，這與預期的大腸桿菌24 kDa的nadD基因表達蛋白的相對分子量一致。表明在 IPTG的誘導下，NAMNAT得到了表達。

圖 5 過量表達nadD基因后細胞提取物的SDS-PAGE圖Fig.5 SDS-PAGE analysis of pTrc99a-nadDexpression. M: protein molecular weight marker; 1:E.coliNZN111/pTrc99a; 2:E. coliNZN111/pTrc99anadD.

由表2可知：重組菌中的煙酸單核苷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶基因得到了過量表達，NADH的濃度提高了 0.49倍，NAD+的濃度提高了 2.33倍，NAD(H) 的總量提高了 2.02倍，可見煙酸單核苷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶的過量表達可以使 NAD(H)總量得到很大的提高。

2.3 最佳生長條件的優(yōu)化

2.3.1 IPTG濃度的優(yōu)化

圖6表明，當IPTG添加終濃度為1.0 mmol/L時，生物量、耗糖和丁二酸的值最高。實驗結(jié)果顯示，在一定范圍內(nèi)，IPTG濃度越高，生物量和丁二酸的值越高，當超過1.0 mmol/L以后，生物量和丁二酸的值不僅沒有提高，反而減少，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是IPTG本身具有細胞毒性，濃度過高，不利于菌體的生長代謝；另外，過高濃度的IPTG也可能會誘導外源基因的高表達，過高的酶活會加重菌體生長和基礎(chǔ)代謝負擔，不利于目標代謝物的生產(chǎn)。

表2 對照菌與重組菌的NADH、NAD+以及NAD(H) 的濃度Table 2 The concentration of NADH, NAD+and NAD(H) in the control strain and in the recombinant strain

2.3.2 煙酸濃度的優(yōu)化

煙酸作為NAD(H) 補給合成途徑中的底物，在優(yōu)化IPTG濃度之后，分別考察添加不同煙酸濃度對重組菌生長、耗糖及產(chǎn)酸的影響。實驗結(jié)果表明 (圖7)，添加不同的煙酸濃度后，對菌體的生長、耗糖和產(chǎn)酸都有一定的影響，當煙酸添加終濃度為0 mmol/L時，丁二酸的產(chǎn)量為最高，當煙酸的添加終濃度超過0 mmol/L時，丁二酸的濃度都有所降低。

2.4 厭氧血清瓶發(fā)酵

有氧培養(yǎng)結(jié)束后，按10%的接種量轉(zhuǎn)接到厭氧血清瓶，使初始OD600值約為0.7左右，添加終濃度為1.0 mmol/L的IPTG，發(fā)酵72 h后測定細胞干重、輔酶NAD+和NADH的量，并測定殘?zhí)羌岸《岬暮?。結(jié)果見表3。

圖6 加入不同濃度IPTG進行誘導對重組菌株生長、耗糖及產(chǎn)丁二酸的影響Fig.6 Effect of different concentrations of IPTG on the cell mass, glucose consumed and succinic acid concentration at the end of the fermentation in NZN111/pTrc99a-nadD.Note:A-G: NZN111/pTrc99anadDinducedwith different IPTG. A: 0.1 mmol/L; B:0.3 mmol/L; C: 0.5 mmol/L; D: 0.7 mmol/L; E:1.0 mmol/L; F: 1.2 mmol/L; G: 1.5 mmol/L.

圖 7 加入不同濃度煙酸進行誘導對重組菌株生長、耗糖及產(chǎn)丁二酸的影響Fig.7 Effect of different concentrations of nicotinic acid on the cell mass, glucose consumed and succinic acid concentration at the end of the fermentation in NZN111/pTrc99a-nadD.Note:A-D: NZN111/pTrc99anadDwith different NA. A: 0 mmol/L; B: 0.1 mmol/L;C: 0.3 mmol/L; D: 0.5 mmol/L.

表3 厭氧血清瓶培養(yǎng)后各種參數(shù)的測定結(jié)果Table 3 Results of these parameters on anaerobic fermentation in sealed bottles

由表3可知，重組菌與對照菌相比，72 h內(nèi)可以消耗14.0 g/L的葡萄糖產(chǎn)6.23 g/L的丁二酸，而對照菌幾乎沒有丁二酸生成，重組菌細胞干重是對照菌的5.5倍，NAD+增加了3.21倍，NADH增加了1.67倍，表明過量表達煙酸單核苷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶基因后，在一定程度上，恢復了大腸桿菌NZN111在厭氧條件下的生長和耗糖能力。NAD(H) 的總量增加了2.63倍，NADH/NAD+的比例由0.64降到0.41，該現(xiàn)象說明增加 NAD(H) 的總量和維持合適的NADH/NAD+的比例對于 NZN111產(chǎn)生還原性末端產(chǎn)物丁二酸是有利的。若能將二者結(jié)合起來，可改變代謝流的方向，減少其他副產(chǎn)物的產(chǎn)生，從而很大程度地提高丁二酸的產(chǎn)率和生產(chǎn)強度。

2.5 兩階段發(fā)酵

有氧培養(yǎng) 6 h后，將 100 mL的菌液8 000 r/min離心10 min，將菌泥接入血清瓶，添加終濃度為1.0 mmol/L的IPTG，發(fā)酵24 h后，測其OD600、殘?zhí)?、丁二酸、丙酮酸、乙酸等不同產(chǎn)物的含量。結(jié)果見表4。

表4 兩階段血清瓶培養(yǎng)后各種參數(shù)的測定Table 4 Results of these parameters on dual-phase fermentation in sealed bottles

由表4可知，重組菌發(fā)酵24 h后，消耗20 g/L的葡萄糖，產(chǎn)生17.06 g/L的丁二酸，丁二酸產(chǎn)量是對照菌的1.63倍，其得率和生產(chǎn)強度分別為0.85 g/g和0.71 g/(L·h)，而對照菌的得率和生產(chǎn)強度分別為0.58 g/g和0.44 g/(L·h)，進一步說明過量表達煙酸單核苷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶，有利于厭氧條件下丁二酸的生成。

3 結(jié)論

文中構(gòu)建重組大腸桿菌 NZN111/pTrc99anadD，過量表達了煙酸單核苷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶，與對照菌NZN111相比，有氧條件下NAD+的濃度提高了2.33倍，NADH的濃度提高了0.49倍，NAD(H) 的總量增加了 2.02倍，這表明過量表達煙酸單核苷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶，能提高胞內(nèi)的NAD(H) 的總量，有利于丁二酸的生產(chǎn)。進一步在厭氧血清瓶中進行發(fā)酵，通過對其誘導條件進行優(yōu)化，提供菌體生長代謝的良好條件和合適的表達基因的酶活，使其耗糖和丁二酸產(chǎn)量都有很大的提高。通過加入終濃度為 1.0 mmol/L的IPTG，使煙酸單核苷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶得到了過量表達，輔酶 NAD(H) 的總量增加了 2.63倍，NADH/NAD+的比例由 0.64降到 0.41，特別是NAD+的濃度增加了3.21倍，提供了充足的NAD+來進行葡萄糖的氧化，在厭氧條件下，使菌株能夠利用葡萄糖代謝生長，重組菌細胞干重是對照菌的5.5倍，使丁二酸的產(chǎn)量大大提高。Liu等[26]報道了在大腸桿菌 NZN111過量表達 NAD(H)合成途徑中的煙酸轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶，使NAD(H)恢復平衡，也恢復了NZN111厭氧條件下生長和產(chǎn)酸能力。文中通過在NZN111中過量表達煙酸單核苷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶，再次證實增加NAD(H)的總量和維持合適的 NADH/NAD+的比例是重組大腸桿菌生產(chǎn)還原性末端產(chǎn)物的關(guān)鍵因素，這為提高丁二酸的產(chǎn)量及確定基于 NAD(H) 調(diào)控丁二酸高收率、高生產(chǎn)強度的生物合成策略提供了依據(jù)。

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Effect of overexpression of nicotinic acid mononucleotide adenylyltransferase on succinic acid production inEscherichia coliNZN111

Dongmei Gou1, Liya Liang1, Rongming Liu1, Changqing Zhang1, Mingke Wu1,Jiangfeng Ma1, Kequan Chen1, Jianguo Zhu1,2, and Min Jiang1

1State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering,College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering,Nanjing University of Technology,Nanjing211816,Jiangsu,China
2Post-Doctoral Research Working Station,Changmao Biochemical Engineering Company Limited,Changzhou213034,Jiangsu,China

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Received:March 5, 2012;Accepted:May 11, 2012

Supported by:National Natural Science Foundation of China (No. 21076105), National Basic Research Program of China (973 Program) (No.2009CB724701), Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions.

Corresponding author:Min Jiang. Tel: +86-25-83172078; Fax: +86-25-84172062; E-mail: bioengine@njut.edu.cn

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