劉 俊 王乾華，2 周 麗，3 汪 琳＊

（1武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室 武漢430071；2華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院婦產(chǎn)科 武漢430022；3河南省信陽市中心醫(yī)院輸血科 信陽464000）

胚胎植入，又稱著床，是囊胚經(jīng)過定位、黏著后埋入子宮內(nèi)膜的過程。胚胎植入的過程涉及一系列細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制，促進囊胚與子宮內(nèi)膜之間的相互作用，最終使胚胎成功植入［1］。一直以來，國內(nèi)外相關(guān)研究從不同的角度探討參與胚胎植入的關(guān)鍵分子如黏附分子、細胞因子、植入相關(guān)基因、激素［2－6］等及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細胞侵襲、子宮內(nèi)膜蛻膜化過程中的重要作用。細胞膜是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的物質(zhì)基礎(chǔ)，Caveolae（胞膜窖）是細胞膜上直徑為50－100nm的燒瓶狀微內(nèi)陷的膜性結(jié)構(gòu)，富含有膽固醇和鞘磷脂，多見于血管內(nèi)皮細胞、血管平滑肌細胞、心肌細胞、巨噬細胞等。caveolae中富含多種與信號傳導(dǎo)有關(guān)的受體、激酶及連接蛋白。Caveolins為21kDa～25kDa完整的膜蛋白，Caveolin-1（微囊蛋白-1）是Caveolins家族成員之一，是Caveolae的標(biāo)志性結(jié)構(gòu)蛋白。Caveolin-1具有異常拓撲結(jié)構(gòu)，共有178個氨基酸殘基構(gòu)成。其中央102～134氨基酸殘基形成疏水區(qū)，在caveolae膜結(jié)構(gòu)上構(gòu)成肝素樣結(jié)構(gòu)；N－末端1～101殘基及C-末端的135～178氨基酸殘基游離并伸入胞質(zhì)內(nèi)；而N－末端的殘基82～101構(gòu)成骨架區(qū)域（scaffolding-domain），是其功能域，能結(jié)合并失活caveolae膜內(nèi)的多種信號分子，如 Ras、Raf、ERK、EGFR、eNOS［7－9］等，故caveolin-1被認為是“廣譜”激酶抑制劑，處于各條信號通路交聯(lián)的中心。本研究通過檢測caveolin-1在圍植入期小鼠子宮內(nèi)膜組織中的表達，探討caveolin-1與胚胎植入的相關(guān)性。

材料和方法

1.實 驗動物

選取健康成年雌性昆明小白鼠42只，體重23±3g，有規(guī)則的動情周期，飼養(yǎng)于明暗周期為12h的通風(fēng)房間內(nèi)，水食自取.采用隨機分組方法將小鼠分為7組，每組按妊娠時間分為未孕組，妊娠3.5d，4.5d.5.5d，6.5d，7.5d和9d組（每組6只）.通過陰道脫落細胞圖片法確定小鼠的動情期。后將處動情期的雌性小鼠下午16時-17時與雄性小鼠按1∶1的比例合籠，次日早上7時-8時檢查陰道分泌物涂片，有精子者記為妊娠1d。

2.試 劑和儀器

兔抗人多克隆抗caveolin-1抗體（SantaCruze公司），S-P超敏免疫組織化學(xué)試劑盒和DAB酶底物顯色試劑盒（中山公司），Total RNA Extraction Miniprep System 試劑盒（VIOGENE公司），RevertAidTM First Strand cDNA 合成試劑盒（Fermentas公司），引物合成（上海生工公司），PCR儀（BD公司）。

3.標(biāo) 本處理

將各組達到指定妊娠天數(shù)的小鼠處死，取出子宮組織，然后生理鹽水內(nèi)清洗，修剪結(jié)締組織，剪取一部分置于4%的多聚甲醛固定，石蠟切片免疫組化備用，另一部分解剖顯微鏡下分離出子宮內(nèi)膜，立即置于液氮中以備做RT-PCR。

4.免 疫組織化學(xué)步驟

標(biāo)本于4%的多聚甲醛固定24h，常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋后切成4μm厚的切片，經(jīng)脫蠟入水后蒸餾水洗3min×3次，PBS洗3min×3次，用枸櫞酸緩沖液進行微波修復(fù)10min，恢復(fù)至室溫后滴加3%過氧化氫溶液室溫放置10min封閉內(nèi)源性過氧化物酶，蒸餾水洗3min×3次，PBS洗3min×3次；用正常山羊血清室溫15min，封閉非特異性反應(yīng)；甩掉多余血清，滴加按1∶100比例稀釋的caveolin-1多克隆抗體（兔抗人，大鼠，小鼠），4℃過夜，PBS沖洗3min×3次；生物素標(biāo)記的二抗羊抗兔IgG 37℃孵育20min，PBS洗3min×3次；滴加鏈霉抗生物素蛋白－過氧化物酶復(fù)合物37℃孵育20min，PBS沖洗3min×3次后進行DAB顯色5～10min；沖洗后蘇木素復(fù)染1～2min；常規(guī)脫水、透明、封片。陰性對照用PBS代替抗caveolin-1多克隆抗體孵育切片。采用HPIAS－2000高清晰度彩色病理圖文報告管理系統(tǒng)（同濟千屏影像公司）對caveolin-1的表達進行定量分析，測定平均光密度值。

5.R T-PCR步驟

待每組每個時間點的6只小鼠取材完以后，提取妊娠子宮組織的總RNA，通過260nm／280nm吸光度比值測定提取RNA的純度及含量。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA一鏈，PCR擴增caveolin-1的基因片斷（引物序列參見表1）。反應(yīng)體系為50μl：10×buffer 5μl（Fermentas），10mmol／l dNTP 1μl，cDNA 5μl，Taq酶2U，引物2μl，雙蒸水補足反應(yīng)體積。反應(yīng)溫度：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，退火溫度55℃30s，72℃延伸30s，循環(huán)30次。反應(yīng)產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，采用BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)及半定量分析軟件，以β-actin的表達量作為內(nèi)參進行掃描分析mRNA條帶的平均光密度，計算caveolin-1的mRNA相對量。

表1 caveolin-1的引物序列和PCR產(chǎn)物大小Table 1 The primer order and product size of caveolin-1

6.統(tǒng) 計學(xué)分析

平均光密度和灰度掃描的結(jié)果均以均值±標(biāo)準差（ˉx±s）表示，所有結(jié)果應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件作單因素方差分析和檢驗，檢驗水準α為0.05。

結(jié) 果

1.免 疫組織化學(xué)檢測結(jié)果

Caveolin-1陽性反應(yīng)為棕黃色，顆粒清晰，定位細胞膜和細胞漿。在圍植入期子宮內(nèi)膜（蛻膜）上皮、腺體上皮、蛻膜細胞中均有陽性表達，但表達的強度有差異：胚泡植入時（4.5d，5.5d，6.5d），Caveolin-1陽性產(chǎn)物表達最弱，而植入前（0d，3.5d），植入后（7.5d，9.5d），Caveolin-1陽性產(chǎn)物表達增強。將0d、3.5d陽性產(chǎn)物平均光密度值計為植入前期Caveolin-1蛋白的表達水平，4.5d，5.5d，6.5d計為植入期，7.5d，9d計為植入后期，各期計算平均值，植入期組與植入前期組、植入后期組比較，差異具有顯著性（P＜0.05）；而植入前期組與植入后期組之間表達產(chǎn)物的陽性強度差異無顯著性（P＞0.05）（見圖1-7，表2）。

表2 早期妊娠小鼠子宮內(nèi)膜組織中caveolin-1平均光密度的動態(tài)表達Table 2 The average optical density of the caveolin-1protein in the mice endometria

2.子 宮內(nèi)膜組織中caveolin-1的mRNA水平的變化

通過分析caveolin-1與內(nèi)參β-actin的 mRNA條帶平均光密度比值，胚泡植入時（4.5d，5.5d，6.5d），子宮內(nèi)膜組織中Caveolin-1的mRNA水平較低；而植入前（0d，3.5d），植入后（7.5d，9.5d），子宮內(nèi)膜組織中Caveolin-1的mRNA水平較高。將0d、3.5d 計為植入 前期 Caveolin-1mRNA 表達水平，4.5d，5.5d，6.5d計為植入期，7.5d，9d計為植入后期，各期計算平均值，植入期組與植入前期組、植入后期組比較，mRNA表達水平差異具有顯著性差異（P＜0.05）；而植入前期組與植入后期組之間mRNA表達水平無顯著性差異（P＞0.05）。（見圖8，表3）。

表3 早期妊娠小鼠子宮內(nèi)膜組織中caveolin-1mRNA的相對表達量的變化Table 3 The relative expression of caveolin-1mRNA in the mice endomentria

討 論

哺乳動物的胚胎植入是生殖過程的一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)，是妊娠的關(guān)鍵。包括受精卵定向地向子宮內(nèi)遷移，與接受態(tài)的子宮內(nèi)膜細胞進行對話，進而啟動粘附、遷移、基質(zhì)降解、侵蝕母體血管及新生血管生成等信號級聯(lián)反應(yīng)，生理性侵襲（physiological invasion）子宮內(nèi)膜并增殖分化形成胎兒及其附屬物。正常情況下，胚胎植入是胚胎與子宮之間時空上相互協(xié)調(diào)的過程，植入的成功必須具備許多條件，涉及一系列在囊胚與子宮內(nèi)膜之間的最終使胚胎成功植入的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制，這一過程的調(diào)控機制十分復(fù)雜。

近年來關(guān)于caveolin-1的功能研究發(fā)現(xiàn)其與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，體外實驗證實caveolin-1能通過抑制凋亡，促進腫瘤細胞增殖；通過刺激腫瘤細胞的絲狀偽足形成而促進侵襲轉(zhuǎn)移；促進多藥耐受形成等［10－11］。值得注意的是，自1829年 Lobstein等提出腫瘤的胚胎性起源概念以來，早期胚胎細胞與惡性腫瘤細胞生物學(xué)行為的相似性研究日益受到重視。Tera等［12－14］研究證實，早期胚胎細胞與惡性腫瘤細胞以及胚胎植入與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的生物學(xué)行為在病理生理過程、細胞增殖分裂、細胞凋亡、新生血管形成、免疫逃逸和侵襲性等諸多方面具有驚人的相似性。因此，本實驗以caveolin-1為檢測對象，檢測其在圍植入期子宮內(nèi)膜組織中的動態(tài)表達變化，從而探討胚胎植入的分子機制，期許可以有助于為腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移的分子機理提供有意義的資料和信息。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)：caveolin-1在圍植入期小鼠子宮內(nèi)膜（蛻膜）上皮、腺上皮、蛻膜血管內(nèi)皮組織中有陽性表達，并且在植入前，植入期和植入后的表達量在蛋白水平和mRNA水平均有差異，提示子宮內(nèi)膜組織caveolin-1表達與胚胎在宮腔內(nèi)的發(fā)育相關(guān)。植入可以認為是一種“同種異體移植的半抗原－胚胎”侵入子宮內(nèi)膜的過程，是一個受到嚴格時空調(diào)控的精密的連續(xù)性過程，因此，caveolae／caveolin-1在胚胎圍植入期不同階段可能通過表達的上升和下降以調(diào)控不同的信號通路，并進而精確調(diào)控滋養(yǎng)層細胞對子宮內(nèi)膜的有序侵襲。本實驗結(jié)果表明：在植入前，子宮內(nèi)膜組織高水平表達caveolin-1，其意義可能在于通過對細胞信號通路相關(guān)激酶的抑制作用，阻斷早胚植入；在植入期，子宮粘膜上皮及基質(zhì)細胞caveolin-1表達下降可能使細胞膜表面的激酶（如PTK、PKC、eNOS等）的活性部位釋放，外源信號轉(zhuǎn)導(dǎo)入胞內(nèi)促進內(nèi)膜上皮細胞的增殖、基質(zhì)細胞的蛻膜化轉(zhuǎn)變、基質(zhì)內(nèi)新生血管形成等，適應(yīng)植入期滋養(yǎng)層細胞的侵襲及快速生長的需要。而在植入的后期，caveolin-1表達的上升可以抑制如PTK、PKC等通路的激活以保護作為“同種異體移植的半抗原－胚胎”細胞免受外界的影響，如機體免疫系統(tǒng)的攻擊等，并有利于調(diào)控胚泡的適度植入。

本研究結(jié)果為尋找和確認控制“植入窗口”形成的關(guān)鍵分子提供新思路，同時可能為臨床不孕、避孕、異位妊娠的防治和計劃生育中抗植入提供重要理論基礎(chǔ)。

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圖 版 說 明

圖1 妊娠0d組小鼠子宮內(nèi)膜組織中caveolin-1的表達（↑示子宮內(nèi)膜）免疫組化SP法 ×200

圖2 妊娠3.5d組小鼠子宮內(nèi)膜組織中caveolin-1的表達（↑示子宮內(nèi)膜）免疫組化SP法 ×200

圖3 妊娠4.5d組小鼠子宮內(nèi)膜組織中caveolin-1的表達（↑示子宮內(nèi)膜）免疫組化SP法 ×200

圖4 妊娠5.5d組小鼠子宮內(nèi)膜組織中caveolin-1的表達（↑示蛻膜）免疫組化SP法 ×200

圖5 妊娠6.5d組小鼠子宮內(nèi)膜組織中caveolin-1的表達（↑示蛻膜）免疫組化SP法 ×200

圖6 妊娠7.5d組小鼠子宮內(nèi)膜組織中caveolin-1的表達（↑示蛻膜）免疫組化SP法 ×200

圖7 妊娠9d組小鼠子宮內(nèi)膜組織中caveolin-1的表達（↑示蛻膜）免疫組化SP法 ×200

圖8 子宮內(nèi)膜組織caveolin-1mRNA表達水平

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1The expression of caveolin-1in mouse endometria on 0 day of pregnancy（↑endometria）Immunohistochemical stainning（SP）×200

Fig.2The expression of caveolin-1in mouse endometria on 3.5day of pregnancy（↑endometria）Immunohistochemical stainning（SP）×200

Fig.3The expression of caveolin-1in mouse endometria on 4.5day of pregnancy（↑endometria）Immunohistochemical stainning（SP）×200

Fig.4The expression of caveolin-1in mouse endometria on 5.5day of pregnancy（↑decidua）Immunohistochemical stainning（SP）×200

Fig.5The expression of caveolin-1in mouse endometria on 6.5day of pregnancy（↑decidua）Immunohistochemical stainning（SP）×200

Fig.6The expression of caveolin-1in mouse endometria on 7.5day of pregnancy（↑decidua）Immunohistochemical stainning（SP）×200

Fig.7The expression of caveolin-1in mouse endometria on 9 day of pregnancy.（↑decidua）Immunohistochemical stainning（SP）×200

Fig.8The expression of caveolin-1mRNA in the mice endometria