裴振華，施生根，牛忠英，史 亮，湯楚華

(解放軍第306醫(yī)院全軍口腔疾病中心，北京100101)

菌斑微生物是引發(fā)牙周病的始動(dòng)因子［1－2］。牙周患部?jī)?yōu)勢(shì)菌的數(shù)量變化是評(píng)價(jià)牙周狀況的重要指標(biāo)，便捷、可靠的細(xì)菌檢測(cè)信息不僅能輔助診斷牙周炎的活動(dòng)性，還能提高牙周炎藥物輔助治療的針對(duì)性，對(duì)實(shí)現(xiàn)有效控制牙周病的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)而促進(jìn)全身健康具有重要意義。

但目前牙周細(xì)菌檢測(cè)仍未成為牙周常規(guī)檢查的一部分，其原因主要是目前的細(xì)菌檢測(cè)方法如:細(xì)菌培養(yǎng)不僅需要厭氧等特殊條件，并且檢測(cè)周期長(zhǎng)，過(guò)程較繁瑣;分子生物學(xué)技術(shù)如聚合酶鏈反應(yīng)雖靈敏度高、特異性強(qiáng)，但樣本檢測(cè)前后步驟較繁瑣，且需特殊而昂貴的試劑和設(shè)備等，從而限制了它們的臨床應(yīng)用［3－4］，使之不能滿足椅旁診斷的需求?；诖耍菊n題組在前期研究中，利用細(xì)菌胞膜和胞內(nèi)離子的帶電性，提出了基于液體電極微流芯片和電化學(xué)阻抗譜方法的電化學(xué)測(cè)菌法，通過(guò)細(xì)菌樣本的阻抗值推算出待檢樣品內(nèi)細(xì)菌的濃度，檢測(cè)迅速、所需設(shè)備簡(jiǎn)單，試劑需求量低，實(shí)驗(yàn)成本相對(duì)低廉，為牙周致病菌的快速量化提供了新的思路［5－6］。

目前電化學(xué)測(cè)菌法只是進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室原理驗(yàn)證，尚未涉及特異性分析。針對(duì)一種檢測(cè)方法，具備高度特異性是其能夠真正用于疾病過(guò)程中細(xì)菌監(jiān)測(cè)診斷的前提?？紤]到液體電極無(wú)法實(shí)現(xiàn)抗體的固定修飾，而免疫磁分離技術(shù)則能夠利用特異性抗體修飾的超順磁顆粒，在外加磁場(chǎng)的作用下，特異性捕獲分離并富集目的菌，與流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合能實(shí)現(xiàn)特定細(xì)菌的量化［7］。因此，本研究旨在選擇能夠賦予流體特異性的免疫磁分離技術(shù)，以期實(shí)現(xiàn)電化學(xué)測(cè)菌法的細(xì)菌特異檢測(cè)。

1 材料和方法

1.1 主要材料和儀器

牙齦卟啉單胞菌 ATCC33277、中間普氏菌ATCC25611(北京口腔醫(yī)院研究提供);胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母浸出物(Oxoid，英國(guó));Trypticase soy broth培養(yǎng)基(BD，美國(guó));細(xì)菌DNA提取試劑盒(O-mega，美國(guó));引物設(shè)計(jì)和合成由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司提供;蛋白A納米磁珠(直徑50 nm，Miltenyi Biotec，德國(guó));牙齦卟啉單胞菌ATCC33277牙齦素K抗血清(北京口腔醫(yī)院牙周科張鳳秋惠贈(zèng));阻抗分析儀(Agilent Technologies Inc，美國(guó)); Anoxomat MarkⅡ厭氧培養(yǎng)系統(tǒng)(Mart，荷蘭)。

1.2 細(xì)菌培養(yǎng)

取牙齦卟啉單胞菌ATCC33277和中間普氏菌ATCC25611分別用含5%羊血的CDC固體培養(yǎng)基復(fù)蘇，37℃厭氧培養(yǎng)(800 mL/L N2、100 mL/L CO2、100 mL/L H2)5 d。然后增菌 2 d，獲得109cells/mL濃度的菌液，再用TS液體培養(yǎng)基10倍稀釋，共獲得109～103cells/mL系列不同濃度的菌液。

1.3 牙齦卟啉單胞菌的免疫磁分離

①取1 mL牙齦卟啉單胞菌牙齦素K抗血清稀釋液與100 μL蛋白A納米磁珠混合均勻，4℃孵育30 min，應(yīng)用配套分選系統(tǒng)(美天旎公司)獲得抗體包被的納米磁珠，4℃保存?zhèn)溆?②取1 mL牙齦卟啉單胞菌懸液中加入50 μL抗體包被的納米磁珠，混合均勻后室溫孵育30 min，再用配套分選系統(tǒng)分離與抗體包被納米磁珠結(jié)合的牙齦卟啉單胞菌，0.1 mol/L甘露醇洗兩遍;③最后用去離子水洗脫收集與抗體包被納米磁珠結(jié)合的牙齦卟啉單胞菌，室溫平衡20 min待測(cè)。

1.4 牙齦卟啉單胞菌的阻抗測(cè)量

分別將不同初始濃度的牙齦卟啉單胞菌菌懸液和免疫磁分離后的免疫磁珠－細(xì)菌水溶液通入液體電極微流芯片，待細(xì)菌樣本、氯化鉀液體電極三層流動(dòng)穩(wěn)定后，設(shè)定頻率為1.2千赫，記錄阻抗分析儀的阻抗數(shù)據(jù)。芯片制作以及電阻抗測(cè)量設(shè)備和方法同前期研究［5－6］。

1.5 雜菌對(duì)牙齦卟啉單胞菌免疫磁分離的影響

以中間普氏菌ATCC25611作為雜菌，將其與牙齦卟啉單胞菌溶液混合后，調(diào)整兩菌終末濃度分別為2.13×108cells/mL(牙齦卟啉單胞菌)和1.96×108cells/mL(中間普氏菌)，然后用牙齦卟啉單胞菌牙齦素K抗血清包被納米磁珠進(jìn)行細(xì)菌免疫磁分離，獲得與抗體包被納米磁珠結(jié)合的細(xì)菌溶液，按1.4的方法分別對(duì)單一牙齦卟啉單胞菌免疫磁珠－細(xì)菌溶液和混合菌免疫磁珠－細(xì)菌溶液進(jìn)行電阻抗測(cè)量。同時(shí)，采用PCR進(jìn)一步驗(yàn)證免疫磁分離的特異性。具體步驟如下:

按DNA提取試劑盒說(shuō)明，提取免疫磁珠捕獲分離的細(xì)菌模板DNA，并根據(jù)兩種菌的16S rRNA設(shè)計(jì)并合成引物，引物序列分別為:P.gingivalis上游引物5’－CTG GCT CAG GAT GAA CGC GTA－3’，下游引物5’－TCG CCC GTT ATT CCC－3’;P.intermedia上游引物 5’－TTT GTT GGG GAG TAA AGC GGG－3’，下游引物5’－TCA ACA TCT CTG TAT CCT GCG T－3’。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為:1 μL DNA模板，1 μL引物(10 μmol/L)，1.6 μL dNTPs(2.5 mmol/L)，2.0 μL 10×PCR緩沖液，0.2 μL TaqDNA聚合酶(5 U/μL)，14.2 μL去離子水。PCR擴(kuò)增循環(huán)參數(shù):95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，55℃復(fù)性1 min，72℃延伸40 s，35個(gè)循環(huán)，72℃終延伸8 min。10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。牙齦卟啉單胞菌ATCC33277為陽(yáng)性對(duì)照，以不加任何模板的體系為空白對(duì)照，穩(wěn)壓120 V，凝膠成像儀采圖。

1.6 不同抗體濃度以及不同免疫反應(yīng)時(shí)間、溫度、pH對(duì)細(xì)菌電阻抗測(cè)量的影響

P.gingivalis濃度選擇2.13×108cells/mL。將牙齦素K抗血清用pH 7.2的0.1 mol/L PBS稀釋成不同濃度(1∶5、1∶10、1∶20、1∶100)，免疫反應(yīng)時(shí)間選擇10、20、30、40、50、60 min)，免疫反應(yīng)溫度選擇25～40℃，免疫反應(yīng)pH值選擇6.0～9.0，按上述方法進(jìn)行免疫磁分離和電阻抗值測(cè)量，以去離子水作對(duì)照，并按以下公式計(jì)算電阻抗值的相對(duì)變化(Normalized impedance change，NIC)。

NIC =(Zsample－ Zcontrol)/Zcontrol× 100

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較用秩和檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 免疫磁分離前后牙齦卟啉單胞菌的電化學(xué)阻抗譜

將免疫磁分離前、后的牙齦卟啉單胞菌液進(jìn)行阻抗測(cè)量，結(jié)果顯示兩者的電化學(xué)阻抗譜型一致，免疫磁分離后的細(xì)菌溶液阻抗值雖有所增加，但與分離前相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)(圖1)。

2.2 雜菌對(duì)牙齦卟啉單胞菌免疫磁分離的影響

對(duì)牙齦卟啉單胞菌和中間普氏菌混合菌液免疫磁分離后的樣本進(jìn)行阻抗測(cè)量，結(jié)果顯示與單一牙齦卟啉單胞菌磁分離后相比，阻抗值未見(jiàn)明顯改變(P＞0.05)(圖2a)。分別用兩種細(xì)菌的特異性引物對(duì)混合菌液免疫磁分離后的樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示牙齦卟啉單胞菌陽(yáng)性(圖2b)。

圖1 免疫磁分離前后牙齦卟啉單胞菌的電化學(xué)阻抗譜

圖2 雜菌對(duì)牙齦卟啉單胞菌免疫磁分離的影響結(jié)果

2.3 抗體濃度對(duì)牙齦卟啉單胞菌電阻抗測(cè)量的影響

設(shè)定在pH 7.2環(huán)境中，抗原抗體室溫反應(yīng)30 min，不同抗體濃度免疫磁分離后的細(xì)菌電阻抗測(cè)量結(jié)果顯示，當(dāng)抗血清稀釋1∶10時(shí)，系統(tǒng)電阻抗值相對(duì)變化值最大，與其他濃度相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(圖3)。

2.4 不同免疫反應(yīng)時(shí)間下牙齦卟啉單胞菌的電阻抗改變

設(shè)定在pH 7.2環(huán)境中，抗血清1∶10稀釋，室溫下免疫反應(yīng)不同時(shí)間，免疫磁分離后的細(xì)菌電阻抗測(cè)量結(jié)果顯示:當(dāng)免疫反應(yīng)10 min時(shí)，即可觀察到系統(tǒng)阻抗有變化，30 min時(shí)系統(tǒng)相對(duì)阻抗變化值達(dá)到最大，與10、20 min相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);延長(zhǎng)免疫反應(yīng)時(shí)間，系統(tǒng)阻抗變化未見(jiàn)增加，各時(shí)間點(diǎn)之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)(圖4)。

圖3 不同抗體濃度下牙齦卟啉單胞菌的電阻抗的改變(n=3)

圖4 不同免疫反應(yīng)時(shí)間下牙齦卟啉單胞菌的電阻抗改變(n=3)

2.5 不同免疫反應(yīng)溫度下牙齦卟啉單胞菌的電阻抗改變

設(shè)定在pH 7.2環(huán)境中，抗血清1∶10稀釋，不同環(huán)境溫度下抗原抗體反應(yīng)30 min，免疫磁分離后的細(xì)菌電阻抗測(cè)量結(jié)果顯示:環(huán)境溫度在25～37℃范圍內(nèi)，系統(tǒng)阻抗雖有變化但較平穩(wěn)，各溫度間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);超過(guò)37℃后，系統(tǒng)阻抗出現(xiàn)下降，且隨著溫度升高，下降越來(lái)越大，37～40℃各溫度之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(圖5)。

圖5 不同免疫反應(yīng)溫度下牙齦卟啉單胞菌的電阻抗改變(n=3)

2.6 環(huán)境pH對(duì)牙齦卟啉單胞菌電阻抗測(cè)量的影響

設(shè)定不同環(huán)境pH，抗血清1∶10稀釋，室溫下抗原抗體反應(yīng)30 min，免疫磁分離后的細(xì)菌電阻抗測(cè)量結(jié)果顯示，pH＜7.0時(shí)，系統(tǒng)阻抗值隨pH增加而增加;pH值＞7.5時(shí)，系統(tǒng)阻抗值則隨pH值增加而下降，各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(圖6)。

圖6 pH對(duì)牙齦卟啉單胞菌電阻抗測(cè)量的影響(n=3)

3 討論

免疫磁分離技術(shù)是通過(guò)特異性抗體修飾超順磁珠或者磁顆粒，利用抗體抗原反應(yīng)，在外加磁場(chǎng)的作用下，凝集分離靶細(xì)胞或生物活性物質(zhì)，實(shí)現(xiàn)對(duì)特定病原菌特異性捕獲分離與富集的新技術(shù)。國(guó)內(nèi)外已有學(xué)者利用免疫磁分離技術(shù)成功進(jìn)行細(xì)胞或細(xì)菌的分離和定量檢測(cè)［8－9］。

本研究應(yīng)用免疫磁分離技術(shù)賦予電化學(xué)測(cè)菌法特異性，結(jié)果顯示免疫磁分離前、后的系統(tǒng)電化學(xué)阻抗譜型一致，且免疫磁分離前、后阻抗變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明磁顆粒本身不會(huì)對(duì)阻抗測(cè)量系統(tǒng)產(chǎn)生明顯干擾。另外，對(duì)摻雜雜菌的混合菌液進(jìn)行磁分離后阻抗測(cè)量，結(jié)果顯示阻抗譜與磁分離后牙齦卟啉單胞菌純菌液基本一致，阻抗值無(wú)明顯差異;PCR特異性擴(kuò)增進(jìn)一步表明實(shí)驗(yàn)用免疫磁分離技術(shù)具有良好的特異性。但與初始菌液相比，免疫磁分離后的阻抗值有所增加，表明樣本導(dǎo)電性減小，樣本中細(xì)菌濃度降低，推測(cè)是由于磁分離過(guò)程中只有部分細(xì)菌被捕獲所致。該結(jié)果會(huì)導(dǎo)致最低檢測(cè)限升高，不易區(qū)分細(xì)菌初始濃度較低的不同樣本，降低電化學(xué)測(cè)菌法的檢測(cè)性能，需進(jìn)一步優(yōu)化抗體捕獲效率而加以改善。

由于抗體濃度、反應(yīng)時(shí)間等是公認(rèn)影響抗原抗體結(jié)合的重要因素，因此本研究中觀察了不同免疫因素對(duì)細(xì)菌電阻抗測(cè)量的影響。結(jié)果顯示當(dāng)牙齦卟啉單胞菌抗血清稀釋10倍時(shí)，系統(tǒng)阻抗變化值最大，表明抗原抗體比例比較合適，因此，我們認(rèn)為檢測(cè)用最適抗體濃度為抗體原液的10倍稀釋液。反應(yīng)時(shí)間的觀察結(jié)果顯示當(dāng)抗原抗體結(jié)合30 min時(shí)，系統(tǒng)相對(duì)阻抗變化值達(dá)到最大，進(jìn)一步延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，系統(tǒng)阻抗變化值未出現(xiàn)明顯改變，表明在30 min時(shí)抗原抗體結(jié)合基本達(dá)到穩(wěn)定，因此，我們認(rèn)為檢測(cè)用免疫反應(yīng)時(shí)間為30 min。

另外，環(huán)境溫度和pH值同樣可以顯著影響抗原抗體的結(jié)合。本研究在設(shè)定抗體濃度和反應(yīng)時(shí)間的基礎(chǔ)上，觀察不同環(huán)境溫度時(shí)系統(tǒng)相對(duì)阻抗值變化，結(jié)果顯示當(dāng)免疫反應(yīng)溫度在25～37℃范圍內(nèi)，系統(tǒng)阻抗變化較明顯，但此溫度范圍內(nèi)阻抗無(wú)明顯增加或者減少，進(jìn)一步升高溫度，系統(tǒng)阻抗變化反而減少，因此，為便于操作，我們認(rèn)為檢測(cè)用免疫反應(yīng)溫度以室溫為好。

本研究pH值范圍的設(shè)定參照文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，如健康齦溝中的pH值接近中性，為6.90，而牙周病變部位pH值常升高，有的部位可高達(dá)8.66［10］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示pH值在7.0～7.5之間時(shí)，可獲得較好的抗原抗體結(jié)合，這一結(jié)果也為臨床實(shí)際樣本檢測(cè)時(shí)的樣本處理方法提供了實(shí)驗(yàn)參考。

通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以證實(shí)免疫磁分離技術(shù)能夠與電化學(xué)測(cè)菌法整合，實(shí)現(xiàn)牙齦卟啉單胞菌的特異性檢測(cè)，但細(xì)菌捕獲率影響免疫磁分離結(jié)果，進(jìn)而影響電化學(xué)測(cè)菌法的實(shí)用價(jià)值，如何提高免疫磁分離效率，降低最低檢測(cè)限仍是進(jìn)一步需要解決的重要問(wèn)題。

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