張明珠，稅艷青，呂罕鮮，任曉斌，黃松靖，王小潔

(云南昆明:1.昆明醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院口腔內(nèi)科，650031;2.省第一人民醫(yī)院口腔預(yù)防科，650032)

口腔色素沉積是一種常見(jiàn)的影響口腔健康和美觀的因素之一。正常牙為淡黃半透明的象牙色，其顏色的改變常由兩種原因造成:一種是由于外來(lái)色素在牙齒表面沉積，稱外源性著色;另一種是由于牙齒本身的原因或全身性病造成的色澤改變，稱為牙齒變色或內(nèi)源性著色。外源性著色常見(jiàn)原因有:食用含色素的物質(zhì)、特殊工種從業(yè)人員長(zhǎng)期接觸的無(wú)機(jī)鹽和化學(xué)物質(zhì)、口腔中的產(chǎn)色素細(xì)菌感染等。

大量研究表明口腔產(chǎn)黑菌有產(chǎn)生黑色素的功能［1-3］，其中產(chǎn)黑色素類厭氧桿菌(Black-Pigmented Anarobic Bod，BPB)是一組從口腔分離的G-厭氧桿菌，包括牙齦卟啉單胞菌(Pg)、牙髓卟啉單胞菌(Pe)、中間普氏菌(Pi)和變黑普氏菌(Pn)等［4］。臨床研究發(fā)現(xiàn):BPB能夠通過(guò)吸附裝置粘附于黏膜、齦溝上皮細(xì)胞表面，與宿主相互作用，影響口腔衛(wèi)生健康。

雖然BPB能夠產(chǎn)生黑色素，但目前關(guān)于BPB與口腔內(nèi)色素沉積之間的關(guān)系報(bào)道甚少，本研究將對(duì)此進(jìn)行初步研究，為臨床制定控制色素的對(duì)策提供參考。

1 材料和方法

1.1 受試對(duì)象選擇

從昆明醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔綜合科選擇18～40歲牙面有色素沉積的志愿者30人(均為非吸煙和非食用含色素物質(zhì)者，色素沉積面積超過(guò)牙頸1/3，達(dá)冠中1/3以上);同時(shí)選擇18～40歲牙面無(wú)色素沉積的志愿者30人作為對(duì)照。所有受試者均排除齲病、非齲性病和牙齦炎，3個(gè)月內(nèi)未使用過(guò)抗生素，知情同意。

1.2 牙菌斑標(biāo)本采集

分別用探針采集每個(gè)受試者混合牙菌斑1 mg，立即放入含1 mL硫乙醇酸鹽傳輸液的離心管內(nèi)，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 菌斑內(nèi)4種產(chǎn)黑色素類桿菌的檢測(cè)

1.3.1 DNA抽提

分別取上述凍存的所有菌斑樣本，經(jīng)凍融后10 000 g離心3 min棄上清，使用QIAGEN DNA Mini kit試劑盒提取菌斑DNA(抽提過(guò)程按廠商說(shuō)明)(表1)。

表1 引物序列和產(chǎn)物［5］

1.3.2 PCR擴(kuò)增反應(yīng)

采用二步PCR法對(duì)樣本進(jìn)行擴(kuò)增:①首先利用細(xì)菌通用引物［5］，產(chǎn)生全長(zhǎng)的16S-rDNA產(chǎn)物，再以該產(chǎn)物為模板，采用細(xì)菌特異引物擴(kuò)增相對(duì)應(yīng)的目標(biāo)細(xì)菌DNA(引物序列和退火溫度參見(jiàn)表1);②PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系 50 μL:3 μL dNTP (dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2.5 mmol/L)，5 μL 10 ×bufferⅡ，0.5 μL DNA Polymerase(5 U/μL)，特異引物各0.5 μL(25 mmol/L)，模板1 μL，去離子水加至50 μL;③PCR反應(yīng)條件為:一步擴(kuò)增條件: 97℃變性1 min，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán);二步擴(kuò)增條件:95℃變性1 min，退火30 s，72℃延伸30 s，26個(gè)循環(huán)。最后72℃優(yōu)化7 min;④擴(kuò)增產(chǎn)物使用含0.5 μg/mL溴化乙錠液的10 g/L瓊脂糖凝膠電泳40 min(恒壓6V/cm)，紫外燈觀察目標(biāo)片段大小是否符合理論值的PCR產(chǎn)物。并計(jì)算各組各種細(xì)菌的檢出率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組各菌檢出率比較用χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果(表2，圖1)

表2 各組4種細(xì)菌的檢出率比較 (%)

圖1 Pg、Pe、Pi、Pn PCR檢測(cè)電泳圖

全部樣本至少有一種目標(biāo)細(xì)菌被檢出，大多數(shù)樣本以細(xì)菌混合感染為主，無(wú)色素沉積的標(biāo)本中Pg、Pe、Pi、Pn檢出率分別為27%、40%、30%、87%;有色素沉積樣本中檢出率分別為 60%、80%、73.3%、80%。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示:有色素沉積者Pg、Pe、Pi的檢出率明顯高于無(wú)色素沉積者(P＜0.05)，Pn二組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。

3 討論

大量研究表明:BPB與牙髓感染、牙周炎都相關(guān)［6］，Pg、Pe、Pi、Pn在髓腔未暴露的慢性根尖周炎中的檢出率分別為36.67%、50%、16.67%、43.33%;在髓腔未暴露的牙髓炎檢出率分別為20%、36.67%、10%、20%［7］。本研究中上述4種細(xì)菌在色素沉積組的檢出率分別為60%、80%、73.3%、80%，明顯高于感染根管內(nèi)的檢出率，表明開(kāi)放口腔內(nèi)的細(xì)菌量和細(xì)菌種類多于封閉的根管，牙面色素沉積可能與這幾類產(chǎn)黑菌定植有關(guān)。

目前，雖然對(duì)BPB在牙面色素沉積方面的研究甚少，但有些間接研究表明:外源性著色，特別是與血紅素相關(guān)的色素沉積與產(chǎn)黑菌有關(guān)，Smalley［1］研究表明，Pg的牙齦素成分與高鐵血紅蛋白形成有關(guān)，高鐵血紅蛋白則與二聚血紅色素形成有關(guān);高鐵血紅蛋白可以有效阻礙血紅素溶解，防止血紅蛋白消退，所以牙齦素可促進(jìn)血紅素的形成。此后Smalley［8］(1998)研究又發(fā)現(xiàn):Pg精氨酸和賴氨酸特異性牙齦蛋白酶與血紅蛋白的降解有關(guān)，氧化血紅蛋白與Pg精氨酸特異牙齦蛋白酶-R結(jié)合可導(dǎo)致高鐵血紅蛋白的形成，高鐵血紅蛋白被特異牙齦蛋白酶K降解，最終導(dǎo)致原卟啉鐵的釋放，從而促進(jìn)色素形成。Pi和Pn在低pH值環(huán)境中，可形成高鐵血紅蛋白并降解產(chǎn)生卟啉鐵，低pH值又可導(dǎo)致不溶性卟啉鐵的沉積，從而促進(jìn)色素沉積［3，8］。本研究在排除主要通過(guò)食物性色素來(lái)源的情況下，分別對(duì)30例有色素和無(wú)色素沉積者的菌斑樣本進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)有色素沉積者菌斑樣本中Pg 18(60%)、Pe 24(80%)、Pi 22(73.3%)的檢出率明顯高于無(wú)色素沉積者，提示這幾類產(chǎn)黑菌可能與非食物性牙面色素沉積有密切關(guān)系。

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