戴麗軍，黃月玲，周敏儀，安勝利，任 韻，勞淑貞，高蔚櫻，樸金松，譚小軍，侯 敏

(1.廣州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，廣州 510182；3.南方醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與熱帶醫(yī)學(xué)學(xué)院生物統(tǒng)計(jì)學(xué)系，廣州 510515；

2.廣州醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院、腫瘤研究所，4.病理科，廣州 510095)

SPF級(jí)C57BL/6J(B6)和BALB/c(B/c)是較早培育出的實(shí)驗(yàn)小鼠近交品系，被廣泛應(yīng)用于生理學(xué)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)和腫瘤學(xué)等領(lǐng)域的研究中，是目前國(guó)際上用量最大的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之一［1］。在廣州醫(yī)學(xué)院2011年開(kāi)展的科研類小鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，B6和B/c的使用量占95%以上，這其中又有50%是用于生殖或以生殖為基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)研究(內(nèi)部統(tǒng)計(jì)資料)，由此可見(jiàn)，繁殖育種是實(shí)驗(yàn)過(guò)程中經(jīng)常會(huì)涉及到的問(wèn)題，提高雌性受孕率、準(zhǔn)確判斷孕齡、掌握動(dòng)物生長(zhǎng)規(guī)律是提高實(shí)驗(yàn)效率和保證實(shí)驗(yàn)效果的重要手段。

我們?cè)趯?shí)驗(yàn)性小鼠肺腺癌的科研工作中不僅使用了SPF級(jí)B6和B/c小鼠，而且實(shí)施了限時(shí)交配、判斷受孕、定時(shí)妊娠、妊娠晚期腹腔注射等實(shí)驗(yàn)方法(部分工作已發(fā)表［2］)，對(duì)這兩個(gè)品系的小鼠在交配方式與受孕率的關(guān)系以及陰栓陽(yáng)性、陰性的受孕作了仔細(xì)的記錄；同時(shí)，還對(duì)母鼠在妊娠晚期接受腹腔注射緩沖液后的孕期、離乳的子鼠數(shù)量以及子鼠早期生長(zhǎng)發(fā)育情況等方面進(jìn)行了觀察，并就妊娠晚期腹腔注射緩沖液對(duì)兩個(gè)品系小鼠繁育生理的影響做了進(jìn)一步的分析。本文總結(jié)了實(shí)驗(yàn)對(duì)照組的有關(guān)數(shù)據(jù)，比較分析腹腔注射對(duì)兩個(gè)品系小鼠繁育生理影響的差異，為在實(shí)驗(yàn)研究中合理使用這兩個(gè)品系的小鼠提供更多的背景資料。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)環(huán)境

4～6周齡的SPF級(jí)B6和B/c小鼠(雄性各20只，雌性各60只)購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【生產(chǎn)許可證：SCXK(粵)2008-0002】，在檢疫室生活1周后，進(jìn)入廣州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室【使用許可證：SYXK(粵)2010-0104】飼養(yǎng)并進(jìn)行交配實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)室條件為：室內(nèi)溫度為20℃ ～26℃，相對(duì)濕度為40% ～70%，明暗交替為12h∶12h。動(dòng)物自由飲用無(wú)菌酸化水(pH 2.5～3.0)和食用60Co滅菌的全價(jià)營(yíng)養(yǎng)飼料(廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，飲水每周更換1～2次，墊料視每盒小鼠的數(shù)量每周更換1～2次，所用物品均通過(guò)高溫高壓滅菌(121℃，30m in)，飼養(yǎng)流程嚴(yán)格按照 SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施 SOP操作。有關(guān)實(shí)驗(yàn)程序由廣州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，符合中國(guó)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的福利倫理準(zhǔn)則；所有實(shí)驗(yàn)人員經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物相關(guān)知識(shí)培訓(xùn)，取得合格證。

1.2 儀器與試劑

JJ100電子天平(精確到0.01g，常熟雙杰測(cè)試儀器廠制造)，用于體重測(cè)定。

磷酸氫二鈉(Na2HPO4)、檸檬酸(citric acid)分別購(gòu)自廣州化學(xué)試劑廠及天津市大茂化學(xué)試劑廠，腹腔注射用緩沖液為0.2M Na2HPO4/0.1M citric acid(pH 6.0)，0.22mm濾器過(guò)濾除菌；組織標(biāo)本由乙醇、多元醇、冰乙酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉等多種成分組成的復(fù)合固定液(上海璽華科貿(mào)有限公司)固定。

1.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

B6和B/c小鼠鼠齡滿10周、雌雄體重分別達(dá)到19 g～20g和21g～22g開(kāi)始交配。交配前48h將雄鼠單獨(dú)分到一個(gè)盒內(nèi)，交配當(dāng)天下午17點(diǎn)將雌鼠放入雄鼠盒內(nèi)，次日上午8點(diǎn)將雄鼠移出交配的盒子，并檢查雌鼠陰栓的情況。交配的當(dāng)天記為妊娠0d，交配后的10d～14d間根據(jù)雌鼠增大的腹部和∕或體重確定其是否受孕；雄鼠休息 3d～7 d后，以同樣的方式再次用于交配。交配的第1、3次，采取2：1(♀/♂)全同胞兄妹近親交配方法，其余的采取1：1的方法，交配的方式方法、交配的時(shí)間和地點(diǎn)在兩個(gè)品系均完全匹配。

表1 交配方式與受孕率的關(guān)系Tab.1 The correlation between mating method and pregnancy rate

妊娠雌鼠單獨(dú)飼養(yǎng)，在交配的第17天下午3～4點(diǎn)之間接受腹腔注射緩沖液，劑量為10m L/kg體重，記錄生產(chǎn)日期(即：孕期)；子鼠25日齡離乳，測(cè)量其體重，記錄雌雄子鼠數(shù)量(即：存活子鼠數(shù)量)，自離乳之日起到滿8周齡，每周稱子鼠體重1次。離乳之后的母鼠不再用于交配實(shí)驗(yàn)，因此，所有子鼠均為母鼠第1胎產(chǎn)生。

1.4 短期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及病理觀察

交配的方法如上所述，母鼠在接受腹腔注射緩沖液后24h被處死，立即取出子宮，觀察胚胎的存活情況和數(shù)量，并將母鼠的肝、右腎、脾和肺臟以及每一只胚胎去頭尾后固定，進(jìn)行常規(guī)病理石蠟標(biāo)本的處理，4μm切片，HE染色，鏡下觀察。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 不同交配方式下B6和B/c小鼠受孕率的比較

我們首先觀察到不同交配方式下兩個(gè)品系小鼠的受孕率有所不同(表1)，總的情況是B6較B/c為高，特別是在2雌1雄的交配方式下，B6每次都有1只雄鼠同時(shí)使2只雌性受孕，而B(niǎo)/c一次都沒(méi)有；兩組受孕率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這主要是由于數(shù)據(jù)的變異度較大、樣本量不夠所致檢驗(yàn)效能較低而引起(power＜0.146)。此外，B/c每次的受孕率相對(duì)穩(wěn)定(標(biāo)準(zhǔn)差較小)，而B(niǎo)6的受孕率變異較大，表明B6的交配和受孕可能容易受到種種外在和內(nèi)在因素的干擾。

2.2 陰栓與受孕的關(guān)系

觀察結(jié)果顯示，陰栓陽(yáng)性的受孕率在B6和B/c不同(表2)，分別為37.3%和63.6%，具有顯著差異(P=0.010)，由此可見(jiàn)，即使在僅15h的限時(shí)交配條件下，用陰栓來(lái)判斷小鼠是否發(fā)生交配和受孕不是很好的指標(biāo)，特別是在不同的品系中應(yīng)用，差別可能會(huì)較大。

表2 陰栓與受孕有關(guān)系Tab.2 The correlation between vaginal plug and pregnancy

2.3 腹腔注射對(duì)孕期及子鼠數(shù)量的影響

自注射緩沖液之日起，每天上午11點(diǎn)和下午4點(diǎn)觀察B6和B/c孕鼠的生產(chǎn)情況，并規(guī)定11點(diǎn)之前生產(chǎn)的記為整天，11點(diǎn)之后、4點(diǎn)之前生產(chǎn)的加0.5d，如此記錄孕期，同時(shí)還盡可能記錄產(chǎn)仔數(shù)量。我們觀察到，B6的孕期稍長(zhǎng)于B/c的，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表3，P=0.036)；離乳的較出生的子鼠數(shù)量為少，B/c較B6存活的子鼠量為多，差異之處在于B6所失去的主要為雄性子鼠，但品系間的差別均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3)。

表3 腹腔注射對(duì)B6和B/c受孕鼠孕期及離乳子鼠數(shù)量的影響Tab.3 Impact of intraperitoneal injection on the duration of pregnancy of B6and B/c dams and number of weaned offsprings

表4 C57B6/6J和BALB/c第一胎E18.5天胚胎的數(shù)量及體重Tab.4 The number and body weight of E18.5d fetuses from primigravid of C57BL/6J and BALB/c

2.4 腹腔注射對(duì)孕鼠主要器官及胚胎的影響

由于離乳子鼠數(shù)量的減少，我們補(bǔ)充了短期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，以明確腹腔注射緩沖液對(duì)孕鼠和子鼠所產(chǎn)生的影響，小鼠來(lái)源和鼠齡以及交配的環(huán)境、方式完全相同，腹腔注射后24h(也就是孕期達(dá)到18.5d、母鼠生產(chǎn)前)處死母鼠，對(duì)母鼠腹腔和其主要器官及胚胎進(jìn)行病理觀察。結(jié)果顯示，母鼠腹膜光滑，腹腔內(nèi)無(wú)滲出，所觀察的器官和胚胎中沒(méi)有明顯的急性病變(結(jié)果未顯示)；每只受孕鼠的胚胎數(shù)3～11只不等，平均為7.8個(gè)(表4)；一窩胚胎的體重相近，數(shù)量少的體重可能會(huì)大一點(diǎn)，B6平均的胚胎體重較B/c的為大，差異具有顯著性(表4，P= 0.000)；此外，38只B/c胚胎中有一只為死胎，而31只B6胚胎均為活的。這些結(jié)果說(shuō)明，腹腔注射對(duì)母鼠及胚胎的直接影響均比較小。

2.5 子鼠早期生長(zhǎng)發(fā)育狀況的比較

從離乳到第8周的體重所體現(xiàn)的子鼠早期生長(zhǎng)發(fā)育情況(圖1)表明，除了第5周之外，無(wú)論是雄性還是雌性，每一觀察點(diǎn)的體重B6的均顯著低于B/c的(P均＜0.05)，顯然，B/c子鼠的生長(zhǎng)在8周時(shí)達(dá)到了平臺(tái)，而B(niǎo)6子鼠的體重卻還在緩慢地增長(zhǎng)(圖1)，二者早期的生長(zhǎng)趨勢(shì)確實(shí)不同(重復(fù)測(cè)量方差分析的交互效應(yīng)顯示P=0.000)。

3 討論

用定時(shí)交配(timed-mating)的方法來(lái)產(chǎn)生定時(shí)妊娠(timed-pregnancy)小鼠是許多研究所必需的，如作者的實(shí)驗(yàn)要在妊娠的第17天腹腔注射致癌劑就是一個(gè)例子，因此，產(chǎn)生受孕鼠成為提高實(shí)驗(yàn)效率的前提條件，包括兩個(gè)方面：一是使更多的雌鼠受孕，二是能夠準(zhǔn)確判斷雌鼠受孕。使雌鼠受孕的方法基本為1雄1雌或1雄2(多)雌的交配方式，從我們的結(jié)果來(lái)看，1雄1雌的方式較好，品系間存在的差異(表1)即使沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，由于每一只受孕鼠都能產(chǎn)生一定量的子鼠，因而客觀實(shí)際效果明顯；1雄2(多)雌并不能提高受孕率，原因恐怕有許多，其中一個(gè)重要的原因可能是雄鼠再次發(fā)情需要一定的時(shí)間，而定時(shí)交配在時(shí)間上要求嚴(yán)格，對(duì)于費(fèi)時(shí)、費(fèi)錢(qián)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，選準(zhǔn)交配方式可以節(jié)省很多。

圖1 C57BL/6J和BALB/c子鼠生長(zhǎng)曲線注：利用“重復(fù)測(cè)量方差分析”的方法比較兩品系、同性別小鼠在各觀察點(diǎn)的體重及其增長(zhǎng)趨勢(shì)，結(jié)果為：雌性：周主效應(yīng)F=904.464，P=0.000，品系主效應(yīng)F=11794.651，P=0.000，交互效應(yīng)F=27.768，P=0.000；雄性：周主效應(yīng)F=2016.379，P=0.000，品系主效應(yīng)F=18211.617，P=0.000，交互效應(yīng)F=11.248，P=0.000；單純效應(yīng)：除了第5周之外，所有其他觀察點(diǎn)組間比較均有顯著性差異，P＜0.05。Fig.1 The growth curve of C57BL/6J and BALB/c offspringsNote：Repeated measurement analysis was employed to analyze the body weight at each observation time point and the trend of body weight gain with time.The results were as follows：Female：Week F=904.464，P=0.000，strain F=11794.651，P=0.000，interactive effect F=27.768，P=0.000；Male：Week F=2016.379，P=0.000，strain F=18211.617，P=0.000，interactive effectF=11.248，P=0.000；Simple effect：P＜0.05at all time points except Week 5.

判斷受孕的方法有：陰栓判斷法［3］、陰道涂片法［4］、體重檢測(cè)法［5，6］、腹部增大觀察法［7］及技術(shù)要求較高的血清檢測(cè)、監(jiān)測(cè)法［5］和超聲檢測(cè)法［8］等。這些方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，陰道涂片法雖簡(jiǎn)單，但需連續(xù)觀察數(shù)天才能確切判斷，有一定的工作量，并對(duì)母鼠的操作較多；陰栓判斷法因簡(jiǎn)單易行而被廣泛采用，而我們的研究發(fā)現(xiàn)陰栓陽(yáng)性的受孕率實(shí)際上并不高，品系間的差異也較大(表1)，效率有限；比較而言，體重檢測(cè)法和腹部增大觀察法判斷受孕的準(zhǔn)確率較高，但對(duì)只有2、3只胚胎的妊娠可能會(huì)漏判，且需10～14d左右，對(duì)需要在妊娠早期進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)不適用，而在此基礎(chǔ)上改良的體重增加百分率或交配后1周體重與交配時(shí)基礎(chǔ)體重的差別可能是判斷受孕最易、最省、最準(zhǔn)、又能較為早期判斷受孕的方法［5，6］。無(wú)論選擇怎樣的方法，關(guān)鍵在于結(jié)合具體的實(shí)驗(yàn)要求和符合花費(fèi)-效果(cost-effect)的原則。

我們的結(jié)果顯示，妊娠晚期腹腔注射酸性緩沖液對(duì)母鼠和胚胎的直接影響都比較小，但是，實(shí)際離乳的子鼠數(shù)量卻在兩個(gè)品系都有減少，以B6減少更為明顯(從預(yù)期的7.8個(gè)到實(shí)際的4.7個(gè)，表3、4)，這一減少似乎與孕期沒(méi)有直接的聯(lián)系，因?yàn)樵衅谑怯苫驔Q定的［9］，而 B6的孕期又較 B/c的顯著延長(zhǎng)(表3，P=0.036)，并且我們觀察到子鼠多是在出生后3d之內(nèi)被母鼠食掉的。因此，我們認(rèn)為，腹腔注射對(duì)母鼠繁育生理的影響可能是多方面的：操作和酸性緩沖液對(duì)腹膜的刺激所產(chǎn)生的疼痛對(duì)繼而發(fā)生的生產(chǎn)有負(fù)性作用，盡管這些疼痛可能不強(qiáng)，也比較短暫，不足以導(dǎo)致早產(chǎn)的發(fā)生，卻足以激惹母鼠，導(dǎo)致母鼠母性較差，發(fā)生食仔現(xiàn)象；還有，操作和疼痛可能客觀上對(duì)初期乳汁的產(chǎn)生有負(fù)性作用，從而導(dǎo)致乳汁量不夠，少數(shù)新生鼠發(fā)生死亡，然后被母鼠清除，所不同的是，B/c可能要比B6小鼠的耐受性好些，受到的影響小些。有關(guān)妊娠期間操作對(duì)母鼠及子鼠的影響文獻(xiàn)中有報(bào)道，慢性的、重復(fù)的操作可以與同時(shí)給予的藥物產(chǎn)生疊加作用，導(dǎo)致永久的損傷［10］，我們目前還不能很好解釋為什么B6品系失去更多的為雄性子鼠，樣本量不足可能是一個(gè)原因。

由體重監(jiān)測(cè)的子鼠早期生長(zhǎng)發(fā)育的狀況進(jìn)一步闡明了腹腔注射和酸性緩沖液對(duì)母鼠繁育生理的影響，B6小鼠18.5d的胚胎平均體重要比 B/c的為大(表4)，離乳時(shí)的體重反而較 B/c的為小(圖1)，二者均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P =0.000)，說(shuō)明腹腔注射可能對(duì) B6的哺乳過(guò)程影響較大，因?yàn)樵谄涿扛C新生鼠平均數(shù)量少的情況下，似乎這些新生鼠沒(méi)有茁壯成長(zhǎng)；從整體上看，B6子鼠離乳后，短期內(nèi)快速生長(zhǎng)(thrive)，到第5周時(shí)達(dá)到了他們應(yīng)有的體重(catch-up)，而5周之后的生長(zhǎng)曲線可能才是真正反映B6品系的生長(zhǎng)發(fā)育趨勢(shì)。我們比較了文獻(xiàn)報(bào)道的B6小鼠從離奶(21d)到10周的體重［11］，5～8周的數(shù)據(jù)與本實(shí)驗(yàn)的十分接近，所存在的微小差異可能來(lái)自飼料，我們用的是60Co滅菌的全營(yíng)養(yǎng)維持飼料，而文獻(xiàn)中用的是高壓滅菌飼料；另外，我們的數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)差較大，而文獻(xiàn)中的甚小。

總之，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物近交品系在長(zhǎng)期嚴(yán)格近交繁育的過(guò)程中，形成了各自的遺傳特性，在繁殖生理和生長(zhǎng)特性等方面，品系間具明顯差異［12-14］，對(duì)各品系繁殖方法、繁育特性和生長(zhǎng)發(fā)育的跟蹤分析，可以為合理設(shè)計(jì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提供科學(xué)數(shù)據(jù)和理論基礎(chǔ)［14］；受孕鼠在妊娠期間對(duì)各種微小操作都可能極為敏感，操作容易產(chǎn)生負(fù)性作用，影響繁育生理過(guò)程，對(duì)這些負(fù)性作用的充分認(rèn)識(shí)，有助于課題的合理設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可重復(fù)性。

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