【作 者】趙鵬，吳太虎,＊，孫建軍

1 南方醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，廣州，510515

2 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生裝備研究所，天津，300161

0 引言

全血或血液制品在采集、處理、保存和運(yùn)輸過(guò)程中，由于各種原因，尤其是冷鏈保障過(guò)程中保存條件不當(dāng)，會(huì)引起紅細(xì)胞破裂。溶血是紅細(xì)胞膜的完整性受到裂解或破損并釋放血紅蛋白的過(guò)程[1-2]。溶血后，游離血紅蛋白將裂解成二聚體與結(jié)合珠蛋白結(jié)合，進(jìn)而通過(guò)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)清除，但一旦超出結(jié)合珠蛋白的結(jié)合能力，病人輸血時(shí)將會(huì)發(fā)生血紅蛋白血癥[3]。因此，溶血程度是評(píng)價(jià)紅細(xì)胞質(zhì)量的重要參數(shù)。雖然已有多種措施用于提高紅細(xì)胞在血液處理、保存、運(yùn)輸和輸注過(guò)程中的穩(wěn)定性，但紅細(xì)胞在離體后仍將有溶血的危險(xiǎn)。目前，通常以游離血紅蛋白濃度劃分溶血程度[1～3]，即采用不大于0.8% 或1% 溶血（相對(duì)應(yīng)的游離血紅蛋白濃度至少不大于200 mg/dl）作為評(píng)估輸注血液制品的標(biāo)準(zhǔn)[1]。游離血紅蛋白濃度的測(cè)定對(duì)評(píng)價(jià)紅細(xì)胞溶血的程度具有重要的價(jià)值。本系統(tǒng)按照可見分光光度法的設(shè)計(jì)原理，使用500 nm波長(zhǎng)的藍(lán)綠光作為光源，照射經(jīng)聯(lián)苯胺法配制的樣本，通過(guò)的光信號(hào)經(jīng)放大處理后，利用朗伯-比爾定律計(jì)算出吸光度。在濃度0～200 mg/dl范圍進(jìn)行了大量的檢測(cè)試驗(yàn)，將試驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)平均值應(yīng)用最小二乘法擬合，得到了較理想的吸光度和濃度線性關(guān)系曲線，實(shí)現(xiàn)對(duì)游離血紅蛋白濃度的測(cè)定。

1 測(cè)量原理

游離血紅蛋白的定量分析方法，分直接光譜法和化學(xué)法兩種。由于血漿（清）對(duì)本底測(cè)定存在干擾，臨床檢驗(yàn)普遍采用化學(xué)法。其中，國(guó)際血液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)推薦氰化高鐵血紅蛋白法作為全血測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)方法，但是血紅蛋白轉(zhuǎn)化為氰化高鐵血紅蛋白后，有類似過(guò)氧化物酶的作用會(huì)影響測(cè)量的結(jié)果[4]，所以，本文采用了測(cè)定血漿(清)游離血紅蛋白的經(jīng)典方法—聯(lián)苯胺比色法。

1.1 分光光度法

光譜法測(cè)量就是定量檢測(cè)游離血紅蛋白對(duì)特定波長(zhǎng)的光吸收。每一種物質(zhì)根據(jù)特定的內(nèi)部結(jié)構(gòu)和能級(jí)狀態(tài)，都有其特定的吸收光譜。所以，可根據(jù)物質(zhì)的吸收光譜來(lái)分析物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和含量。根據(jù)血紅蛋白吸收光譜的特性，測(cè)定的光譜法主要包括：近紅外光譜法（760、850 nm），三波長(zhǎng)（560、576、592 nm）法和紫外分光光度法（414 nm）等[5～7]。

入射光源的波長(zhǎng)選擇至關(guān)重要，應(yīng)該選擇游離血紅蛋白吸收率較高，或者與除游離血紅蛋白外的物質(zhì)吸收率差異顯著的波段，從而提高信噪比，降低干擾因素。一般輸注的血液按常規(guī)可保存35 ～ 42 d，在保存期中紅細(xì)胞的膜完整性和流動(dòng)性有很大改變。紅細(xì)胞破裂后，游離的血紅蛋白濃度明顯上升。此時(shí)，根據(jù)溶血的程度呈現(xiàn)粉紅色、紅色，而紅色對(duì)光的吸收范圍在490 nm～530 nm[8]。本文選用500 nm的波長(zhǎng)為光源，并使用PerkinElmer的LAMBDA35紫外分光光度計(jì)，在300～600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)同時(shí)對(duì)游離血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)液、膽紅素、膽固醇和總蛋白等進(jìn)行了光譜掃描，分析了血漿中各種成分對(duì)測(cè)量結(jié)果的影響程度，結(jié)果膽紅素和膽固醇影響較大（如圖1所示）。當(dāng)將血漿樣本經(jīng)聯(lián)苯胺試劑比色后，干擾減弱。

圖1 . 膽紅素和膽固醇的吸收光譜圖Fig.1 Absorption spectra of bilirubin and cholesterol

1.2 朗伯-比爾定律

光與介質(zhì)發(fā)生作用時(shí)，除發(fā)生反射現(xiàn)象和折射現(xiàn)象外，還將發(fā)生吸收現(xiàn)象。物質(zhì)對(duì)光的吸收作用即為分子俘獲光子的過(guò)程，既與分子內(nèi)部能態(tài)結(jié)構(gòu)有關(guān)，又與分子同光子的碰撞幾率有關(guān)。對(duì)于均勻分布的連續(xù)體系，光的吸收滿足朗伯-比爾定律，其數(shù)學(xué)表達(dá)式為：

其中，A為吸光度，I0為入射輻射強(qiáng)度，It為透過(guò)輻射強(qiáng)度，T為透過(guò)率，Cn為成分n的濃度(mg/dl)，L為光程長(zhǎng)(m)，αn為成分n的吸收系數(shù)（mg/dl*m）。吸收系數(shù)α是物質(zhì)本身的固有性質(zhì)，不同濃度的同一物質(zhì)在相同波長(zhǎng)處吸收系數(shù)相同。

公式（1）的適用條件為：

(1) 吸收過(guò)程中各物質(zhì)間無(wú)相互作用，但各物質(zhì)的吸收度具有可加合性；

(2)輻射與物質(zhì)的作用僅限于吸收過(guò)程，無(wú)熒光、散射光等現(xiàn)象；

(3)吸收物是一種均勻分布的連續(xù)體系。

除以上條件外，在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中會(huì)受到諸多因素的干擾。

2 系統(tǒng)設(shè)計(jì)

游離血紅蛋白檢測(cè)儀由采集模塊、微控制處理模塊和人機(jī)交互模塊組成。其中，采集模塊按照分光光度法設(shè)計(jì)；微控制處理模塊主要由AVR系列單片機(jī)ATmega88以及外圍電路組成；人機(jī)交互模塊包括鍵盤控制和液晶顯示。

2.1 硬件設(shè)計(jì)

系統(tǒng)硬件設(shè)計(jì)由采集電路模塊、微控制處理器模塊、液晶顯示模塊、鍵盤控制模塊和電源管理模塊組成，如圖2所示。

圖2 系統(tǒng)硬件框圖Fig.2 Block diagram of the system hardware

其中，信號(hào)的采集、處理電路主要按照分光光度法設(shè)計(jì)[8]，由光源、吸收池、光敏探測(cè)器、放大電路、濾波電路和微處理器等6部分構(gòu)成，如圖3所示。

圖3 信號(hào)采集、處理電路框圖Fig.3 Circuit diagram of signal acquisition and processing

(1) 光源 光源除了波長(zhǎng)的選擇外，光輻射的強(qiáng)度和穩(wěn)定性也是至關(guān)重要的。由于發(fā)光二極管(Laser Emission Diode，LED)作為一種新型光源正快速進(jìn)入光譜分析領(lǐng)域，所以選用主波長(zhǎng)為505 nm的LED作為光源，并采用MAX1916l的經(jīng)典電路來(lái)驅(qū)動(dòng)LED，以滿足光源在特定的測(cè)量區(qū)域內(nèi)光輻射強(qiáng)度和穩(wěn)定性的要求。

(2) 吸收池 吸收池是指盛放液體樣品或與樣品作用的器件，又稱比色皿。吸收池的材料因光譜區(qū)而異，在可見光區(qū)使用玻璃吸收池，在紫外區(qū)使用石英吸收池。本文實(shí)驗(yàn)使用常規(guī)的10 ml的玻璃或石英樣品池。

(3) 光敏探測(cè)器 光敏探測(cè)器主要由光敏二極管及其電路構(gòu)成。其作用是當(dāng)光經(jīng)過(guò)吸收池與樣品作用后，檢測(cè)攜帶樣品信息的光信號(hào)，并將光信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)，通過(guò)放大和濾波后，進(jìn)行模數(shù)轉(zhuǎn)換，以數(shù)字信號(hào)的形式輸出。

(4) 信號(hào)處理和分析 一般信號(hào)的處理和分析由微處理器實(shí)現(xiàn)。主要通過(guò)控制光源驅(qū)動(dòng)，將采集來(lái)的空白、樣品光譜信號(hào)進(jìn)行分析處理，實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品中游離血紅蛋白的測(cè)定。具體功能的實(shí)現(xiàn)，除電路連接外，由軟件完成，可見系統(tǒng)的軟件設(shè)計(jì)。

(5) 其他外圍電路 液晶顯示采用MC141模塊，主要進(jìn)行了與ATmega88外圍接口電路的設(shè)計(jì)。鍵盤控制模塊共有4個(gè)按鍵，分別通過(guò)與單片機(jī)的I/O口連接。電源管理模塊采用可替換的9 V電池供電和直流電源供電兩種方式。由于游離血紅蛋白濃度的測(cè)量不需要連續(xù)長(zhǎng)時(shí)間的檢測(cè)，只需在測(cè)量時(shí)驅(qū)動(dòng)光源定時(shí)測(cè)量即可，因此采用正?！菝叩墓ぷ髂Ｊ剑行У乩秒娔?，大大降低功耗。

2.2 軟件設(shè)計(jì)

系統(tǒng)軟件設(shè)計(jì)在AVRStudio4平臺(tái)下，通過(guò)對(duì)ATmega88編程實(shí)現(xiàn)了按鍵掃描、信號(hào)采集、計(jì)算分析、存儲(chǔ)顯示和電源管理等功能。系統(tǒng)軟件設(shè)計(jì)流程圖如圖4所示。

圖4 系統(tǒng)軟件設(shè)計(jì)流程圖Fig.4 Software fl ow chart of the system

系統(tǒng)初始化后，首先判斷各功能鍵是否按下，共有4個(gè)功能鍵，分別是空白調(diào)零、樣品測(cè)量和歷史數(shù)據(jù)瀏覽導(dǎo)航（▲和▼分別指示上一條和下一條測(cè)量記錄）。若空白調(diào)零或樣品測(cè)量功能響應(yīng)，則MCU使能LED，并定時(shí)采集信號(hào)。信號(hào)經(jīng)過(guò)A/D轉(zhuǎn)換后，將統(tǒng)計(jì)平均值利用朗伯-比爾定律(式1)，計(jì)算出吸光度，再代入最小二乘擬合多項(xiàng)式(如圖5所示)得出濃度值，顯示于液晶屏。若瀏覽數(shù)據(jù)導(dǎo)航功能響應(yīng)，則可最多瀏覽最近測(cè)量的20條數(shù)據(jù)結(jié)果。單片機(jī)存儲(chǔ)和液晶顯示的結(jié)果包括測(cè)量序號(hào)、濃度、吸光度和溶血程度。最后，系統(tǒng)采用休眠——工作轉(zhuǎn)化的電源管理模式，大大降低了系統(tǒng)功耗。

2.3 主要設(shè)計(jì)指標(biāo)

（1）測(cè)量波長(zhǎng)：500 nm；

（2）測(cè)量濃度范圍：≤ 200 mg/dl；

（3）測(cè)量吸光度范圍：≤ 1；

（4）測(cè)量溶血程度范圍：≤ 1%；

（5）樣品皿規(guī)格：10 ml。

3 實(shí)驗(yàn)與結(jié)果

為了光譜定量分析的精確，必須保證實(shí)驗(yàn)在相對(duì)一致的環(huán)境下操作。選用生理鹽水作為空白溶液，將400 mg/dl 的FHb標(biāo)準(zhǔn)液稀釋為(10～200) mg/dl的20個(gè)等級(jí)濃度的標(biāo)準(zhǔn)液。配制聯(lián)苯胺試劑，分別標(biāo)定(10～200) mg/dl的FHb標(biāo)準(zhǔn)液。使用空白溶液進(jìn)行調(diào)零，分別對(duì)FHb標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行測(cè)定，并對(duì)單個(gè)FHb標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行多次測(cè)量，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果取平均值(表1)。

表1 標(biāo)定測(cè)定數(shù)據(jù)Tab.1 Measurement data of the calibration

然后，利用朗伯-比爾定律，經(jīng)最小二乘法擬合出吸光度和濃度之間的關(guān)系曲線。以下是測(cè)量吸光度和濃度關(guān)系的最小二乘擬合曲線(如圖5所示)，相關(guān)系數(shù)R2= 0.9998。

4 結(jié)論

圖5 吸光度和濃度關(guān)系的最小二乘擬合曲線Fig.5 The extinction-density curve based on Least Squares Fitting

在全血及成分血質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，除懸浮紅細(xì)胞外，對(duì)全血和冰凍解凍紅細(xì)胞中游離血紅蛋白有明確的規(guī)定[7]，[9～11]。當(dāng)血液或血液制品發(fā)生溶血后，對(duì)需要輸注的血液進(jìn)行游離血紅蛋白濃度的測(cè)定尤為重要。一般采用觀察法來(lái)判斷溶血程度，雖然簡(jiǎn)便、快速，但是當(dāng)游離血紅蛋白濃度大于50 mg/dl后(呈淡紅色和紅色)，并不能精確而真實(shí)地反應(yīng)濃度大小以及溶血程度?；瘜W(xué)法測(cè)量也有一定的局限性，在野外急需輸血的情況下不易實(shí)現(xiàn)。

本文研制的游離血紅蛋白檢測(cè)儀，具有測(cè)量精度高、測(cè)量時(shí)間短、功耗低以及體積小便于攜帶的特點(diǎn)。目前，系統(tǒng)基本實(shí)現(xiàn)了對(duì)懸浮紅細(xì)胞中游離血紅蛋白的定量分析，對(duì)于全血的測(cè)定，由于其中若干干擾因素的存在，以及聯(lián)苯胺法操作復(fù)雜，有穩(wěn)定性差的缺點(diǎn)，影響了系統(tǒng)測(cè)定的準(zhǔn)確性。今后，希望通過(guò)大量的臨床試驗(yàn)，不斷地完善系統(tǒng)設(shè)計(jì)，將測(cè)定誤差消除。并在此基礎(chǔ)之上，針對(duì)血液保存質(zhì)量評(píng)估中游離血紅蛋白濃度和溶血的關(guān)系進(jìn)行進(jìn)一步的探討。

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