張守平，汪 明

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 國家動物原蟲實(shí)驗(yàn)室，北京 海淀 100193）

登革熱是由登革病毒（dengue virus，DENV／DV）引起的人和動物的一類以發(fā)熱，關(guān)節(jié)疼痛，紅疹為特征的蟲媒性疾病，白紋伊蚊和埃及伊蚊是其主要的傳播媒介。病毒感染后可引起登革熱（dengue fever，DF）、登革出血熱（dengue haemorrhagic fever，DHF）和登革休克綜合征（dengue shock syndrome，DSS）。登革熱廣泛的流行于熱帶和亞熱帶地區(qū)，近幾十年來，隨著旅游和經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，登革熱患者不斷增加。據(jù)WHO估計(jì)，目前全球2／5的人口受到登革熱感染的威脅，每年約有億計(jì)的人感染該病毒。我國廣東，云南，臺灣等省份亦有病例報(bào)道出現(xiàn)［1，9］。

1 病原學(xué)

1.1 病毒特征和理化特性 DENV屬于黃病毒科黃病毒屬，有囊膜，單股正鏈不分節(jié)段的RNA病毒。病毒粒子直徑約為40～50nm，20面體對稱。病毒基因組長約11kb，共編碼10個(gè)蛋白，即3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白（C－prM－E），和7個(gè)非 結(jié)構(gòu) 蛋白（NS1－NS2A－NS2BNS3－NS4A－NS4B－NS5）。其中E蛋白為病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，決定著病毒的組織親嗜性，介導(dǎo)病毒與細(xì)胞受體的結(jié)合，同時(shí)它還是影響病毒毒力，引起保護(hù)性免疫反應(yīng)及免疫病理損傷的重要成分［2］。

病毒對熱敏感，56℃30 min即可以滅活。氯仿、丙酮等脂溶劑、脂酶或去氧膽酸鈉可以通過破壞病毒包膜而滅活病毒。病毒對胃酸、膽汁和蛋白酶均敏感，對紫外線、γ射線亦敏感。酒精、1%碘酊、2%戊二醛、2%～3%過氧化氫、3%～8%甲醛等消毒劑也可以滅活病毒。

1.2 病原分離和培養(yǎng)特性 病毒可由發(fā)熱期患者的血清、血漿或白細(xì)胞中分離獲得。也可以從死者的肝臟、肺臟、脾臟、淋巴結(jié)、胸腺、腦脊液、腹水中分離獲得。從血液中分離病毒一般應(yīng)在發(fā)熱期進(jìn)行，最好是感染的前5d，即在形成中和型抗體之前［3］。

登革病毒可以在多種昆蟲和哺乳動物細(xì)胞中培養(yǎng)增殖，并引起培養(yǎng)細(xì)胞折光性增強(qiáng)、細(xì)胞變圓或細(xì)胞融合等不同程度的細(xì)胞病變。昆蟲傳代細(xì)胞系，如白紋伊蚊C6／36等對登革病毒敏感，可用于病毒分離，也是目前最常用的登革病毒增殖的細(xì)胞系。哺乳動物細(xì)胞系，如人細(xì)胞系、乳地鼠腎細(xì)胞（BHK21）、非洲綠猴腎細(xì)胞（VERO）、原代狗腎細(xì)胞（PDK）等均可用于病毒效價(jià)的滴定和疫苗的制備［4］。

1.3 抗原性、血清型 根據(jù)病毒E蛋白抗原性的不同，可以分為4個(gè)血清型，即DENV1，DENV2，DENV3，DENV4。各型病毒之間抗原性有交叉，但與黃病毒科的其他抗原群無交叉性。病毒包膜蛋白E的抗原決定簇既可以誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生保護(hù)性的中和抗體和血凝抑制抗體，還可能參與登革出血熱（DHF）和登革休克綜合征（DSS）的發(fā)生。非結(jié)構(gòu)蛋白NS1和NS3均具有免疫反應(yīng)性和免疫原性，可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生針對同型登革病毒的保護(hù)性免疫。

2 流行病學(xué)

人和靈長類動物是登革病感染的自然宿主，靈長類動物包括黑猩猩、獼猴、長臂猿、恒河猴、狒狒等。東南亞森林中的猴感染后多不發(fā)病，但可成為傳染源。登革病毒的媒介昆蟲是伊蚊屬成員，在登革熱疫區(qū)的主要傳播媒介是埃及伊蚊和白紋伊蚊。這些伊蚊在全世界大多數(shù)地區(qū)存在，當(dāng)叮咬感染了登革病毒的人或動物時(shí)，可以通過改換叮咬對象而直接傳播病毒。目前尚無在人－人之間的傳播。

本病的分布與其媒介伊蚊相一致，廣泛分布于全球的熱帶和亞熱帶的地區(qū)。目前已有一百多個(gè)國家報(bào)道本病的流行，主要是東南亞、南亞、西太平洋的一些國家和地區(qū)。我國的海南、廣東、廣西、福建、臺灣等沿海地區(qū)是登革熱的流行區(qū)［5］。早在19世紀(jì)70年代，我國臺灣就有登革熱發(fā)生的記載［6］。1917年，登革熱從南亞傳入我國大陸，先后在上海、廣東、福建、浙江、江西、湖北及臺灣等省發(fā)生流行。解放后，登革熱得到了良好的控制。在經(jīng)過了30多年后，1978年廣東省佛山市突然發(fā)生了由登革4型引起的登革熱流行。近幾年以來，廣東省幾乎每年均有登革熱病例發(fā)生，波及范圍越來越大，病例數(shù)上升明顯［1，7］。另外，云南，貴州等省也先后從伊蚊中分離到病毒，當(dāng)?shù)厝巳汉蛣游矬w內(nèi)也檢測到特異性的抗體［8］。北京、上海、香港、澳門等地輸入性病例的報(bào)道也都有發(fā)生［9］。有統(tǒng)計(jì)表明，從1978年以來，到1998的20年間，總共發(fā)生20次不同程度的流行。報(bào)告的病例是越來越多，波及的范圍是愈來愈廣，但大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，目前登革熱在中國并未形成地方性的流行［9］。

由于本病的媒介主要是伊蚊。因此在大多數(shù)地區(qū)，登革熱的流行具有明顯的季節(jié)性，多發(fā)生在氣溫高、雨量多的季節(jié)，主要是在5～10月份。一般雨后2～3周伊蟻密度上升，導(dǎo)致發(fā)病高峰出現(xiàn)。雨量增多，溫度升高，可縮短病毒在媒介中的潛伏期。在亞熱帶地區(qū)主要在多雨季節(jié)發(fā)生流行，雨季過后的幾個(gè)月，由于干旱，DF的發(fā)病率明顯下降。我國的流行季節(jié)，廣東、廣西為5～10月份，海南為3～10月份［10］。

本病是任何年齡均可發(fā)病，但不同地區(qū)稍有差異，東南亞地區(qū)發(fā)病群多數(shù)為15歲以下兒童，泰國登革出血熱多發(fā)生于5～8歲兒童，古巴的發(fā)病群則多數(shù)為成年人。我國從嬰兒到老人均有發(fā)病，以兒童和青壯年患病率最高，性別無明顯差異。

3 臨床癥狀和發(fā)病機(jī)制

3.1 臨床癥狀 登革病毒多引起無癥狀的隱性感染。而發(fā)病患者的主要臨床表現(xiàn)有登革熱（DF）、登革出血熱（DHF）以及登革休克綜合征（DSS）。DF主要臨床表現(xiàn)有突起高熱、嚴(yán)重頭痛（大部分是前額痛）、眼后痛（眼球活動時(shí)加重）、全身疼痛和關(guān)節(jié)痛，可伴有惡心嘔吐，另外可有淋巴結(jié)腫大、白細(xì)胞和血小板減少等癥狀。DF還可引發(fā)心、肝、肺、腎、腦等多系統(tǒng)損害，也可導(dǎo)致心肌損害。DHF／DSS的臨床表現(xiàn)更為嚴(yán)重，除了上述DF的癥狀外，可出現(xiàn)嚴(yán)重持續(xù)的腹痛，鼻、口腔、牙齦出血，皮膚出血瘀斑，黑色大便，極度口渴，皮膚黏膜蒼白，發(fā)冷，煩躁不安或嗜睡，血細(xì)胞比容＞35%等表現(xiàn)，嚴(yán)重者可致死亡。DENV感染還可導(dǎo)致腦炎。近幾年DENV感染病例的臨床表現(xiàn)有一些變化，在診斷中應(yīng)引起注意［8］。

3.2 發(fā)病機(jī)制 登革熱和登革出血熱的發(fā)病機(jī)制迄今尚未完全闡明，一般認(rèn)為是由于病毒和宿主復(fù)雜的相互作用引起的，重癥危險(xiǎn)因子包括患者年齡、病毒血清型和基因型以及宿主的遺傳背景等。近年的研究認(rèn)為發(fā)病機(jī)制有幾種假說：病毒親嗜性、病毒毒力學(xué)說、宿主的易感因素、抗體依賴性感染增強(qiáng)作用（antibody－dependent enhancement，ADE）、交叉反應(yīng)性T細(xì)胞反應(yīng)及細(xì)胞因子風(fēng)暴（cytokine storm）等［11］，現(xiàn)簡要介紹ADE和細(xì)胞因子風(fēng)暴。

學(xué)者認(rèn)為DENV表面存在群特異性決定簇和型特異性決定簇，前者產(chǎn)生的抗體對DENV感染有較強(qiáng)的增強(qiáng)作用，稱增強(qiáng)型抗體；后者產(chǎn)生的抗體稱中和型抗體。機(jī)體二次感染不同型DENV時(shí)，血清中中和型抗體不能完全中和病毒，而增強(qiáng)型抗體可以與病毒結(jié)合為免疫復(fù)合物，這些免疫復(fù)合物通過單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞膜上的Fc受體，促進(jìn)病毒在這些細(xì)胞中復(fù)制，出現(xiàn)ADE效應(yīng)，導(dǎo)致患者臨床癥狀加重，出現(xiàn)血液濃縮和休克，造成DHF／DSS［12］。但是發(fā)現(xiàn)，許多一次感染的患者也可以出現(xiàn)DHF／DSS，說明本病還存在其他的致病因素。

細(xì)胞因子是由免疫細(xì)胞及其他類型細(xì)胞分泌的小分子量可溶性蛋白或多肽的總稱，具有在細(xì)胞間傳遞信息，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的功能，同時(shí)還參與炎癥損傷等病理過程。但是過度的炎癥反應(yīng)能夠引起全身炎癥反應(yīng)綜合征，使機(jī)體處于高代謝和高動力循環(huán)狀態(tài)。炎性細(xì)胞因子的過度釋放有可能進(jìn)而引起多臟器功能障礙綜合征甚至導(dǎo)致死亡。在多種疾病的治療中，對炎癥反應(yīng)的控制都非常重要。研究發(fā)現(xiàn)，登革熱重癥患者中，IL－1，IL－4，IL－6，IL－13，TNF－α等水平明顯增高。TNF－α與血小板減少有明顯的相關(guān)性。研究顯示，Th1型反應(yīng)向Th2型反應(yīng)的轉(zhuǎn)變是DHF／DSS發(fā)生的一個(gè)重要機(jī)制，即重癥患者的細(xì)胞因子多為Th2型的細(xì)胞因子。病毒感染后，過量的細(xì)胞因子和炎性因子的釋放使得血管通透性增加，導(dǎo)致出血和休克［13－15］。

4 診斷

登革病毒的診斷主要是臨床癥狀結(jié)合實(shí)驗(yàn)室診斷。登革病毒的實(shí)驗(yàn)室診斷主要有病毒分離、抗原和抗體檢測、基因檢測等。

4.1 病毒分離 病毒分離是病毒病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。登革熱病毒血癥持續(xù)時(shí)間較短，應(yīng)該在發(fā)熱開始的4～5d內(nèi)，采集樣品。病毒的分離培養(yǎng)可通過活蚊、細(xì)胞或動物進(jìn)行?；钗茫ň尬煤鸵廖茫┓蛛x是目前最敏感的登革病毒分離方法，但對接種技術(shù)要求高而很少采用。蚊蟲細(xì)胞（C6／36、AP－61或 TRA－284）分離具有較高的敏感性。此外，也可利用哺乳動物細(xì)胞（BHK21、LLC－MK2）或乳鼠顱內(nèi)接種作為登革病毒的分離培養(yǎng)方法［16］。

4.2 抗原檢測 NS1蛋白是登革病毒感染的主要標(biāo)志性抗原，NS1蛋白出現(xiàn)時(shí)間早于IgM 抗體，可用于早期診斷。目前，已有多個(gè)商品化試劑盒用于檢測登革病毒的NS1抗原。且研究發(fā)現(xiàn)NS1N端aa1－15多肽為DENV－1血清型特異性優(yōu)勢線性表位，提示該表位多肽可作為早期分型診斷登革病毒感染抗原試劑盒［17］。

4.3 血清學(xué)檢測 由于登革病毒感染患者的體液免疫反應(yīng)在發(fā)病后至少可持續(xù)數(shù)周，標(biāo)本可采集時(shí)間比較長，因此血清學(xué)的方法檢測更方便采用。檢測IgM、lgG捕獲法ELISA、檢測IgM、IgG間接法ELISA和血凝抑制試驗(yàn)是登革病毒感染診斷最常用的血清學(xué)方法［18］。HI由于其敏感、簡便和重復(fù)性好而被用于初次感染和二次感染鑒別。由于HI檢測登革病毒感染與其他蟲媒病毒感染有交叉反應(yīng)，基本已被檢測IgM和IgG捕獲法ELISA取代。基于登革病毒E／M蛋白特異性IgM和IgG捕獲法ELISA具有較高的敏感性、特異性操作更簡便等特點(diǎn)，是登革病毒感染血清學(xué)診斷最重要和最常用的檢測方法。IgG／IgM 抗體比率常用于區(qū)分初次和二次感染。但是，目前采用捕獲IgM／IgG比值法鑒別初次和二次感染尚無一致的標(biāo)準(zhǔn)，而且難于區(qū)分登革病毒的血清型［19］。

4.4 基因診斷 近年來，登革病毒的分子生物學(xué)診斷方法日益完善，核酸擴(kuò)增成為快速診斷登革病毒的最重要方法，各種RT－PCR方法嘗試于檢測病毒的RNA。核酸擴(kuò)增技術(shù)在進(jìn)行檢測病毒的同時(shí)，也可以對登革病毒的血清型進(jìn)行鑒別［20］。Harris等應(yīng)用一步法多重RT－PCR，使反應(yīng)在同一管中進(jìn)行，并在登革病毒通用擴(kuò)增引物間引入一段和PCR產(chǎn)物大小不同的無關(guān)序列，構(gòu)建成內(nèi)參質(zhì)粒，通過電泳分析PCR產(chǎn)物的片段大小來鑒別內(nèi)參和檢測靶標(biāo)。內(nèi)參照的引入使RT－PCR結(jié)果的可靠性得到極大的提高［21］。

基因芯片（gene chips）技術(shù)因具有高通量和并行處理的特點(diǎn)，可對病原體進(jìn)行綜合檢測和分析。更因其操作簡便快速、成本低、體積小等特點(diǎn)，在分子生物學(xué)、疾病診斷和治療等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。肖維威等［22］用PCR方法擴(kuò)增含幾乎全長的2型登革病毒cDNA，酶切PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，通過建立2型登革病毒cDNA文庫獲取芯片探針。用點(diǎn)樣儀將探針制備成2型登革病毒檢測基因芯片，結(jié)果顯示樣品和2型登革病毒基因芯片雜交的敏感性強(qiáng)、特異性高［22］。

5 防制

5.1 治療 本病尚無有效的治療藥物，主要采取對癥支持療法，在治療中應(yīng)避免使用阿司匹林和布洛芬。有關(guān)于利巴韋林、干擾素和阿糖腺苷等用于DF／DHF臨床病例的報(bào)道，但其療效有待進(jìn)一步觀察。

5.2 預(yù)防 疫苗是預(yù)防登革熱最有效的途徑，然而，迄今仍沒有安全有效的疫苗用于登革熱的特異性預(yù)防。人類感染DENV后可產(chǎn)生型特異性中和抗體，對同型病毒的再感染具有免疫保護(hù)作用。但不同型的抗體之間不但沒有交叉免疫保護(hù)作用，而且還可能對異型病毒感染產(chǎn)生抗體依賴的感染增強(qiáng)作用（ADE）。因此，理想的DENV疫苗應(yīng)該是能誘導(dǎo)人體產(chǎn)生對4種血清型DENV均有免疫保護(hù)作用的四價(jià)疫苗［23］。鑒于M和E蛋白包含了主要的中和性抗體表位，用于產(chǎn)生免疫的抗原主要選擇M與E蛋白。減毒活疫苗與滅活病毒、重組亞單位疫苗或重組DNA疫苗相比，具有能夠提供單劑量的快速免疫；誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生更長久的中和性抗體，同時(shí)有效誘導(dǎo)機(jī)體的T細(xì)胞免疫；成本較低，便于推廣等優(yōu)點(diǎn)，可以更好地誘發(fā)機(jī)體的保護(hù)性免疫反應(yīng)。因而減毒活疫苗是目前首選疫苗的開發(fā)對象［24］。

6 展望

登革熱作為一種重要的蟲媒傳染病，發(fā)病人數(shù)逐年增加，嚴(yán)重危害著人類的健康。雖然其相關(guān)研究已經(jīng)取得了一定的成果，但有許多的問題亟待解決。登革熱的發(fā)病機(jī)制仍未有統(tǒng)一的共識，尤其是重癥病例，尚無有效預(yù)防與治療措施。今后的工作應(yīng)該從病毒與宿主的相關(guān)機(jī)制上著手，早日獲得有效治療登革熱的方法，并開發(fā)出具有保護(hù)作用的多價(jià)疫苗。

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