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食品和飼料中鐮刀菌毒素的檢測(cè)方法

2012-01-25 23:04河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院張勇法
中國(guó)飼料 2012年6期
關(guān)鍵詞:檢測(cè)法色譜法鐮刀

河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 張勇法

河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)與工程學(xué)院 楊建英 景愛(ài)華

鐮刀菌毒素是鐮刀菌產(chǎn)生的一類次生代謝產(chǎn)物,是影響谷物品質(zhì)的一個(gè)重要因素。受鐮刀菌毒素污染的食物進(jìn)入動(dòng)物體后,可抑制機(jī)體的免疫系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)的功能。目前污染小麥的鐮刀菌毒素主要包括脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)、伏馬毒素(fumonisin)、單端孢霉烯醇(又稱T-2毒素)和玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)。目前,我國(guó)對(duì)鐮刀菌毒素的限量標(biāo)準(zhǔn)還不夠完善,對(duì)伏馬毒素和T-2毒素尚無(wú)限量。因此,建立快速準(zhǔn)確的檢測(cè)方法和制定完善的鐮刀菌毒素的限量標(biāo)準(zhǔn),對(duì)提高小麥籽粒的品質(zhì),保證食品安全具有重要意義。本文對(duì)鐮刀菌毒素檢測(cè)方法作一綜述。

1 生物學(xué)檢測(cè)法

Widestrand等(2003)利用鐮刀菌毒素具有細(xì)胞毒性的性質(zhì),以5-溴-2'-脫氧尿苷(5-BrdU)生物鑒定來(lái)評(píng)估谷物提取液對(duì)3T3細(xì)胞DNA合成的影響,從而判斷谷物鐮刀菌毒素的含量。該方法較為簡(jiǎn)單,成本也低,適用于毒素檢測(cè)的初步篩選,但其所需時(shí)間較長(zhǎng),專一性較差,不能確定一種或多種毒素的存在,也不能準(zhǔn)確定量,因此該方法使用范圍有限。

2 物理化學(xué)檢測(cè)法

2.1 薄層層析法 薄層層析法 (thin layer chromatography,TLC)是毒素檢測(cè)的經(jīng)典方法,本方法具快速、設(shè)備簡(jiǎn)單、成本低、分離效果好等優(yōu)點(diǎn),但靈敏度稍差,并且對(duì)研究人員和環(huán)境有危害,而且TLC法涉及到一個(gè)可視化顏色定量的問(wèn)題,還是不如氣相色譜和液相色譜方便、準(zhǔn)確(蔣木庚和楊紅,1997)。近年來(lái)應(yīng)用較少。

2.2 高效液相色譜法 高效液相色譜法(high performance liquid chromatography, HPLC)法通過(guò)色譜法對(duì)毒素含量進(jìn)行測(cè)定,具有快速、準(zhǔn)確、穩(wěn)定、靈敏度高和自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn),己成為一種極為普及的真菌毒素的檢測(cè)手段。鮑蕾等(2005)采用免疫親和柱凈化、柱前衍生結(jié)合高效液相色譜法檢測(cè)谷物中的T-2毒素,結(jié)果表明,方法的檢測(cè)限為0.1 mg/kg,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差低于9%,回收率為80.0%~95.0%。 Lippolis等(2008)研究發(fā)現(xiàn),用I-NC、2-NC和PCC熒光標(biāo)記HPLC法測(cè)定樣品中的T-2毒素,其檢測(cè)限分別為10.0、6.3 ng和2.0 ng。Danyi等(2009)利用HPLC法測(cè)定食品添加劑中ZEN及其衍生物,在樣品前處理時(shí)比較了酶聯(lián)免疫色譜凈化與固相萃取凈化兩種方法對(duì)結(jié)果的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),前處理采用酶聯(lián)免疫色譜凈化法回收率為89%~110%,變異系數(shù)較??;而采用固相萃取凈化法回收率較差,且待檢物較易受到萃取柱載體的影響。林維宣等(2001)采用免疫親和色譜法對(duì)樣品進(jìn)行前處理,使用鄰苯二甲醛作為衍生化試劑測(cè)定了醬油中伏馬毒素Bl、B2的含量,結(jié)果表明,回收率分別為84.6%~89.2%、60.3%~69.5%,最低檢出限分別為0.01、0.02 mg/kg。最近幾年,液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)以及熒光HPLC等的廣泛應(yīng)用使得HPLC檢測(cè)的專一性顯著提高(Meister,2008;Berthiller等,2005)。

2.3 氣相色譜法 氣相色譜法(gas chromatography,GC)法多用于毒素及其代謝產(chǎn)物的微量測(cè)定,是分析測(cè)定單端孢霉烯族毒素化合物的最理想方法,具有靈敏度高、高分離效能、高檢測(cè)效能、分析快速等優(yōu)點(diǎn)。但是,該方法前處理較繁瑣,需要提純凈化。另外,氣相色譜儀價(jià)格昂貴,推廣應(yīng)用具有一定的局限性。梁穎等(2006)在分析鐮刀菌毒素的同時(shí),還對(duì)其衍生化試劑及衍生條件進(jìn)行了比較研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn),氟化衍生后檢測(cè)靈敏度較高,而硅烷化衍生不需加熱,在室溫下即可完成,且生成物穩(wěn)定。此外,ROMER公司推薦了乙腈-水(84:16,V/V)作為提取溶劑,該提取溶劑在目前鐮刀菌毒素分析中使用比較廣泛(Berthiller等 ,2005;Bily 等 ,2004;Eke等,2004)。目前,DON、T-2、ZEN和伏馬毒素的免疫親和柱均已商品化,被廣泛應(yīng)用于4種毒素的定量分析中(李軍等,2006;隋凱等 2006)。

2.4 色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法 質(zhì)譜與氣相色譜(gas chromatography-Mass spectrometry,GC-MS) 或液相色譜聯(lián)用 (liquid chromatography-mass spectrometer,LC-MS),能增強(qiáng)鑒定的可靠性,具有專一性強(qiáng),靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。但由于只有專業(yè)測(cè)試或研究機(jī)構(gòu)中心才具備其設(shè)備,而且存在前處理較為繁瑣,需要對(duì)樣品進(jìn)行提取、凈化和濃縮等應(yīng)用瓶頸,所以并不適用于日常檢測(cè),普及具有一定困難。羅毅等(1998)建立的鐮刀菌毒素的電子捕獲GC-MS法,檢測(cè)T-2毒素的最低限為5×10-11g。該法不僅能檢測(cè)低含量的化合物,而且能確定混合物中的某一化合物,廣泛應(yīng)用于T-2毒素以及其他真菌毒素的檢測(cè),但是昂貴的設(shè)備限制了該法的廣泛使用。Mateo等 (2002)建立了對(duì)DON、NIV、ZEN、T-2和伏馬毒素 5種鐮刀菌毒素的LC-MS檢測(cè)法。劉承蘭等(2005)采用LC-MS/MS法測(cè)定了玉米和蘆筍中的伏馬毒素B1、B2的含量,樣品前處理采用固相萃取法凈化,最低檢測(cè)限為80 pg,回收率為78.3%~104.9%。

3 免疫學(xué)分析法

3.1 酶聯(lián)免疫吸附法 曹艷紅等(2006)采用直接競(jìng)爭(zhēng)性ELISA法檢測(cè)谷物中T-2毒素,結(jié)果表明,該方法最低檢出量為0.125 ng/mL,添加70~280 ng/g T-2毒素的大米樣品和面粉樣品的平均回收率分別為85%~117.5%和98.1%~102.5%。競(jìng)爭(zhēng)ELISA法是測(cè)定小分子抗原的方法,尤其適用于食品安全中鐮刀菌毒素的檢測(cè)(陳愛(ài)華和楊堅(jiān),2004)。Pal等(2004)建立免疫過(guò)濾膜法檢測(cè)T-2毒素的方法,該免疫過(guò)濾膜上分布著36種抗體點(diǎn)區(qū)域,試驗(yàn)利用T-2毒素-辣根過(guò)氧化物酶(T-2 toxin-HRP)作為示蹤分析物,以4-氯-1-萘酚作為底物,結(jié)果表明,該方法可以快速簡(jiǎn)便的檢測(cè)出小麥和家禽飼料中的T-2毒素,檢測(cè)敏感度分別為 12.5 mg/kg和 25 mg/kg。

3.2 放射免疫法 Ler等(2006)研究報(bào)道,利用放射性標(biāo)記的三明治免疫學(xué)熒光化學(xué)發(fā)光和電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)法改進(jìn)ELISA法,檢測(cè)T-2毒素,可以提高檢測(cè)敏感度。宋康泰等(1987)合成了T-2毒素的人工抗原T2-BSA和3H標(biāo)記的T-2毒素,用T2-BSA免疫家兔獲得的高質(zhì)量的抗血清,與3H標(biāo)記T-2毒素的親和常數(shù)為3.2×109M-1,終滴度為l∶2000,測(cè)定水中T-2毒素的最低檢出限為1.0 ng/mL,測(cè)定血和尿的樣品時(shí)最低檢出限為2.0 ng/mL。然而,由于放射免疫有一定的危險(xiǎn)性,影響人身體健康,因此,該方法未被廣泛應(yīng)用。

3.3 免疫熒光法 熒光免疫分析(Fluoroimmunoassay)的方法很多,如熒光偏振免疫分析、熒光猝滅免疫分析、熒光增強(qiáng)免疫分析、時(shí)間分辨熒光免疫分析等。Lippolis等(2011)針對(duì)T-2毒素及其代謝物HT-2毒素建立了免疫熒光檢測(cè)方法。免疫熒光法檢測(cè)鐮刀菌毒素,能夠達(dá)到ng甚至pg的檢測(cè)水平。

4 T-2毒素的其他檢測(cè)法

由于以上方法只能檢測(cè)一種T-2毒素,而T-2毒素的代謝物HT-2也常常存在于污染的谷物中,為了滿足實(shí)際檢測(cè)的需要,Visconti等(2005)建立了一種可以同時(shí)檢測(cè)T-2和HT-2毒素的靈敏精確的新方法,即熒光標(biāo)記的高效液相色譜法,免疫親和凈化后,1-antroylnitrile(1-AN)作為標(biāo)記試劑,T-2毒素和其代謝物HT-2檢出率分別為5 μg/kg和 3 μg/kg。 此外,Li等(2009)用桔林油脂酵母α-淀粉酶基因插入可以表達(dá)人體細(xì)胞色素P4503A4和同源的人CYP 450還原酶的啤酒酵母中。將該菌株和葡聚糖表達(dá)菌株用于微孔板真菌毒素生物學(xué)檢測(cè)試驗(yàn),用甲醇作溶劑,多粘菌素B九肽作為滲透促進(jìn)劑;通過(guò)熒光檢測(cè)糖酶的分泌受到抑制程度顯示其毒性,可以檢測(cè)T-2毒素的最低劑量為100 ng/mL。

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