廣東工業(yè)大學(xué)輕工化工學(xué)院 衛(wèi)林進(jìn) 李大光

廣州天科生物科技有限公司 舒緒剛

谷氨酰胺二肽相對于谷氨酰胺單體，溶解度高，熱穩(wěn)定性好，并能夠被小腸黏膜完整吸收，然后在腸黏膜、肝、腎、骨骼肌等組織器官中被快速分解，產(chǎn)生體內(nèi)所需的氨基酸，提高血漿中谷氨酰胺濃度，從而發(fā)揮谷氨酰胺的作用 （周榮艷和彭健，2005）。常見的谷氨酰胺二肽有甘氨酰谷氨酰胺二肽和丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽（俗稱力肽）兩種類型，其可分解產(chǎn)生谷氨酰胺。本文對目前谷氨酰胺二肽合成方法及其在畜牧養(yǎng)殖中的應(yīng)用作一綜述。

1 谷氨酰胺二肽合成方法

目前，國內(nèi)外已知的二肽及多肽合成方法主要有四類：生物酶法、微生物發(fā)酵法、化學(xué)反應(yīng)法和多肽固相合成法。

1.1 生物酶法 生物酶法是指通過一些具有生物活性和專一性的分解酶（天然或化工合成）水解目標(biāo)大分子蛋白質(zhì)，形成具有生物活性的小分子肽和氨基酸；或通過氨基酸合成酶進(jìn)行氨基酸的組裝與成肽（林軍，2009；黃惟德，1985）。 其特點(diǎn)是反應(yīng)條件溫和，原料廉價易得，但存在酶解效率不高，產(chǎn)物活性較低的問題。此外，分解物中具有生物活性的肽片段從兩個氨基酸到十幾個氨基酸不等，得到的產(chǎn)品中副產(chǎn)物居多，目標(biāo)產(chǎn)物純度較差，后續(xù)分離提純過程繁瑣，導(dǎo)致總體產(chǎn)率偏低（馬海樂等，2010；徐力等，2004）。

1.2 微生物發(fā)酵法 發(fā)酵法是指利用特定微生物的代謝活動將廉價原料轉(zhuǎn)變?yōu)槟繕?biāo)多肽的方法，其特點(diǎn)是發(fā)酵使用的細(xì)菌或酵母易于培養(yǎng)，原料獲取方便，條件容易控制（湯亞杰等，2007；陳堅(jiān)等，2004）。但酵母細(xì)胞中目標(biāo)活性肽含量較低，酵母用量大，收率低，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場需求，理論上僅為一種多肽生產(chǎn)方式，可以在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行小劑量合成。

1.3 化學(xué)反應(yīng)法 化學(xué)反應(yīng)法是通過一系列化學(xué)反應(yīng)對氨基酸前期處理，然后進(jìn)行肽鍵縮合的合成方法，是目前二肽及多肽小分子的研究熱點(diǎn)，其應(yīng)用前景最為廣闊。這是因?yàn)榛瘜W(xué)合成法反應(yīng)機(jī)理和操作方法多樣，反應(yīng)條件易于控制，反應(yīng)迅速、徹底，而且各個步驟產(chǎn)率高，產(chǎn)品專一性較好，具備工業(yè)化生產(chǎn)的理論條件。但氨基酸在中性條件下是以分子內(nèi)的兩性離子形式（+H3NCH（R）COO-）存在，氨基酸之間直接縮合成酰胺鍵的反應(yīng)在一般條件下難以進(jìn)行；而且氨基酸肽酯反應(yīng)無定向性，產(chǎn)物易發(fā)生消旋，若反應(yīng)物側(cè)鏈官能團(tuán)處理不當(dāng)，易引入副產(chǎn)物（楊梅林，2006）。此外，一些試劑，如催化劑、保護(hù)基團(tuán)試劑等毒副作用大且價格昂貴，化學(xué)合成步驟較多，因此整體產(chǎn)率不高，且生產(chǎn)成本高，制約了該方法的廣泛使用。目前國內(nèi)外已有的谷氨酰胺二肽化學(xué)合成方法主要有以下幾種。

1.3.1 活化酯法 活化酯法合成多肽是目前為止一種較為常用的合成方法，通過氨基保護(hù)、羧基活化、肽鍵縮合、去除保護(hù)基團(tuán)，最終得到目標(biāo)產(chǎn)物（Kato 和 Kurauchi，1999）。該方法的優(yōu)點(diǎn)是反應(yīng)條件溫和，使γ位酰胺基在反應(yīng)中比較穩(wěn)定，不易發(fā)生水解；縮合產(chǎn)物可以分離得到純品；氫解后雜質(zhì)較少，易于用重結(jié)晶法分離純化；原料工業(yè)來源充足。但總體反應(yīng)步驟較多，且反應(yīng)中要用到一些價格較高的原料導(dǎo)致成本增大。因此，若將該工藝路線進(jìn)行改進(jìn)和優(yōu)化，將會成為一種理想的制備谷氨酰胺二肽的方法。

1.3.2 酰氯法 谷氨酰胺直接與α-氯代酰氯在堿性條件下生成酰胺鍵，然后進(jìn)行氨解得到最終產(chǎn)物，最后分離提純即可得到目標(biāo)產(chǎn)品。此法巧妙利用活性較大的酰氯與氨基酸中氨基進(jìn)行反應(yīng)，生成酰胺鍵，具有反應(yīng)溫和，合成路線短，收率高的優(yōu)點(diǎn)，但常用的2-D-氯丙酰氯價格昂貴，氨解過程中可能發(fā)生消旋，得到消旋產(chǎn)物，難以分離。一種改進(jìn)方式是原料采用谷氨酸，先在酸性條件下與醇形成谷氨酸脂，然后在pH=8左右與酰氯反應(yīng)，最后進(jìn)行氨解，得到谷氨酰胺二肽。此法的優(yōu)點(diǎn)：一是避免了以往反應(yīng)中γ-酰胺的水解，二是選用廉價的谷氨酸，降低生產(chǎn)成本，適合工業(yè)化生產(chǎn)（金輝，2003）。

1.3.3 酸酐法 酸酐中羰基作為活性親電中心，可以與帶孤對電子的氨基發(fā)生親核取代反應(yīng)，形成肽鍵，得到二肽。目前已有的酸酐法是N-羧基內(nèi)酸酐（NCA）法和混合酸酐法（Stehle 等，1982）。區(qū)別在于前者通過甘氨酸或丙氨酸與光氣二氯化碳環(huán)合生成N-羧基內(nèi)酸酐；而后者是氨基酸與酯制的直鏈狀酸酐。該方法的優(yōu)點(diǎn)是反應(yīng)條件溫和，速度快，收率高，但是中間體N-羧基內(nèi)酸酐不穩(wěn)定，以及混合酸酐有兩個羰基活性中心，若不采取對應(yīng)措施易發(fā)生同等加成反應(yīng)，得到難以分離的副產(chǎn)物，限制了其工業(yè)化應(yīng)用。

1.3.4 保護(hù)γ-酰胺法 大多研究認(rèn)為，谷氨酰胺作為腸外營養(yǎng)物質(zhì)不宜直接被機(jī)體吸收利用，主要原因是谷氨酰胺本身的水溶液穩(wěn)定性差，自身的酰胺鍵易發(fā)生水解，生成對人體有害的環(huán)化產(chǎn)物-焦谷氨酸（李幼生和黎介壽，2002）。Yasutsugu（1992）研究表明，使用呫噸氫醇將其保護(hù)起來再進(jìn)行酯化縮合反應(yīng)，避免了γ酰胺基團(tuán)的水解。這種方法可以避免L-谷氨酰胺的γ-酰胺水解，但是無疑增加了操作步驟，而且呫噸氫醇價格昂貴，使得該方法僅理論可行。

1.4 固相合成法 固相是指多肽合成中的載體是固相，一般以不溶性的氯甲基聚苯乙烯樹脂為載體，其他氨基酸原料在載體上進(jìn)行多肽縮合。氯甲基聚苯乙烯樹脂作為不溶性的固相載體，首先將一個氨基被封閉基團(tuán)X保護(hù)的氨基酸共價連接在固相載體上。在三氟乙酸的作用下，脫掉氨基的保護(hù)基，這樣第一個氨基酸就與固相載體相連接。然后氨基被封閉的第二個氨基酸的羧基通過N，N’-二環(huán)己基碳二亞胺 （DCC）活化，羧基被DCC活化的第二個氨基酸再與已接在固相載體上的第一個氨基酸的氨基反應(yīng)形成肽鍵，這樣在固相載體上就生成了一個帶有保護(hù)基的二肽。重復(fù)上述肽鍵形成反應(yīng)，使肽鏈從C端向N端生長，直至達(dá)到所需要的肽鏈長度。最后脫去保護(hù)基X，用HF水解肽鏈和固相載體之間的酯鍵，就得到了合成好的肽。固相合成的優(yōu)點(diǎn)主要表現(xiàn)在最初的反應(yīng)物和產(chǎn)物都是連接在固相載體上，因此可以在一個反應(yīng)容器中進(jìn)行所有的反應(yīng)，便于自動化操作，加入過量的反應(yīng)物可以獲得高產(chǎn)率的產(chǎn)物，同時產(chǎn)物很容易分離。但是固相合成法對于載體條件要求苛刻，合成過程中伴隨縮合位點(diǎn)，產(chǎn)物異構(gòu)，原料間縮合等問題的發(fā)生，產(chǎn)物中存在數(shù)量較為可觀的副產(chǎn)物，而且整體反應(yīng)速度慢。

2 谷氨酰胺二肽在生豬養(yǎng)殖中的應(yīng)用

2.1 在斷奶仔豬上的應(yīng)用 斷奶仔豬，尤其是早期斷奶仔豬，由于從采食母乳過渡到固體飼料，易造成仔豬斷奶后采食量降低而導(dǎo)致營養(yǎng)不足，并且因飼料中抗原物質(zhì)引起仔豬腸道過敏反應(yīng)，導(dǎo)致仔豬出現(xiàn)生長遲緩、腹瀉、免疫力下降等為主要特征的 “早期斷奶綜合征”，給養(yǎng)豬業(yè)帶來直接經(jīng)濟(jì)損失。研究表明，斷奶仔豬日糧中添加甘谷二肽，能明顯降低仔豬腹瀉率，提高仔豬采食量、日增重，表明甘谷二肽有增強(qiáng)仔豬免疫力，促進(jìn)仔豬生長的作用（黃冠慶等，2003）。此外，由甘氨酰谷氨酰胺二肽在仔豬體內(nèi)分解而生成的谷氨酰胺作為細(xì)胞供能物質(zhì)和氮源，能促進(jìn)仔豬腸道細(xì)胞的修復(fù)、器官的生長和蛋白質(zhì)的合成，有利于仔豬生長。

2.2 在妊娠和哺乳期母豬上的應(yīng)用 活性二肽另一個重要的用途是通過二肽與一些動物體內(nèi)所需的微量元素或者重要的金屬元素進(jìn)行螯合，得到營養(yǎng)價值更高的氨基酸螯合物類產(chǎn)品。盡管螯合物在動物體內(nèi)的吸收機(jī)制目前尚無定論，但目前主要有兩種觀點(diǎn)：一是金屬離子與二肽螯合，形成穩(wěn)定的電中性化合物，通過細(xì)胞膜進(jìn)入血漿，進(jìn)而被吸收；二是微量元素氨基酸螯合物利用氨基酸和小肽吸收機(jī)制，通過小腸刷狀緣，以氨基酸和肽類形式被吸收，這種方式使得金屬元素吸收和循環(huán)進(jìn)入機(jī)體的效率更高。楊玲媛和陳永豐（2011）研究表明，在妊娠和哺乳期母豬日糧中添加適量氨基酸螯合鐵可有效減少死胎，提高仔豬初生重和初生仔豬含鐵量，并能預(yù)防仔豬貧血和提高仔豬存活率。

3 前景展望

綜上所述，谷氨酰胺二肽及其衍生物具有良好的市場前景。但由于谷氨酰胺二肽生產(chǎn)難度大，我國的工業(yè)化生產(chǎn)技術(shù)尚不成熟，導(dǎo)致成本過高，主要依賴進(jìn)口。因此，如何設(shè)計(jì)一條高效的合成路線，對于降低活性肽生產(chǎn)成本，擴(kuò)大谷氨酰胺二肽的應(yīng)用范圍至關(guān)重要，這也是今后活性肽類產(chǎn)品的一個發(fā)展方向。

[1]陳堅(jiān)，衛(wèi)功元，李寅，等.微生物發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽[J].無錫輕工大學(xué)學(xué)報，2004，23（5）：104 ～ 110.

[2]黃冠慶，傅偉龍，高萍.甘氨酰谷氨酰胺二肽對斷奶仔豬生長性能及血液激素水平的影響[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2003，24（3）：66 ～ 68.

[3]黃惟德.多肽合成[M].北京：科學(xué)出版社，1985.

[4]金輝.1谷氨酰胺二肽的合成工藝研究2非甾體抗炎鎮(zhèn)痛藥-扎托洛芬合成研究：[碩士學(xué)位論文][D].成都：四川大學(xué)，2003.

[5]李幼生，黎介壽.谷氨酰胺二肽的研究進(jìn)展 [J].中華胃腸外科雜志，2002，5（3）：232 ～ 233.

[6]林軍.用于生物合成谷胱甘肽的重組大腸桿菌—釀酒酵母耦合系統(tǒng)的高效運(yùn)行機(jī)制：[博士學(xué)位論文][D].無錫：江南大學(xué)，2009.

[7]馬海樂，郝志偉，何榮海，等.基于超聲預(yù)處理的大米降血壓多肽的制備及其功能評價[J].中國食品學(xué)報，2010，10（6）：36 ～ 40.

[8]湯亞杰，徐小玲，李冬生.發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽的研究進(jìn)展[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2007，33（1）：75 ～ 79.

[9]徐力，李相魯，吳曉霞，等.一種新的玉米抗氧化肽的制備與結(jié)構(gòu)表征[J].高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報，2004，25（3）：466 ～ 469.

[10]楊玲媛，陳永豐.微量元素氨基酸螯合物的吸收特點(diǎn)及其在養(yǎng)豬生產(chǎn)中的應(yīng)用[J].科技與推廣，2011，10：65 ～ 67.

[11]楊梅林.蠶蛹蛋白的酶法水解及其產(chǎn)物的抗氧化性研究：[碩士學(xué)位論文][D].無錫：江南大學(xué)，2006.

[12]周榮艷，彭健.谷氨酰胺及其二肽與動物腸道營養(yǎng)免疫[J].飼料研究，2005，7：53 ～ 56.

[13]Kato T，Kurauchi M.Process for the production of glutamine derivatives[P].US，5032675，1991.

[14]Stehle P，Khhne B，Kubin W，et al.Synthesis and characterication of tyrosine and glutamine containing peptide[J].Appl Biochem，1982，4：280.

[15]Yasutsugu.Studies on the synthesis of peptides containing glutamine as the C-term inalⅠ.P rotection of amide-nitrogen with xanthyl group during peptide synthesis bull[J].Chem Soc Japan，1992，35（12）：1966 ～ 1970.