鐘露苗，莫美霞，夏新華

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410208;2.湖南省藥品審評(píng)認(rèn)證與不良反應(yīng)監(jiān)測(cè)中心，湖南長(zhǎng)沙410013;3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，湖南長(zhǎng)沙410007)

舒胸片在《中國(guó)藥典》2010年版一部中也是收載品種［1］，由三七、紅花和川芎三味中藥組成，功效主治制備方法、日服劑量與《中國(guó)藥典》2005年版一部記載相同。為繼續(xù)探討該復(fù)方有效成分富集純化的方法，作者采用大孔樹(shù)脂吸附技術(shù)，選擇LSA-30、HPD-100兩種樹(shù)脂，在系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)吸附性能研究基礎(chǔ)上［2，8-9］，考察不同濃度梯度的乙醇對(duì)方中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、羥基紅花黃色素A、阿魏酸和川芎嗪［3-5］6種有效成分的洗脫能力。

1 儀器與試藥

1.1 儀器shimadzu LC-10Atvp型高效液相色譜儀;shimadzu SPD-10Avp型紫外檢測(cè)器;N3000色譜工作站。AY120 SHIMADZU分析天平。玻璃層析柱(內(nèi)徑1.5 cm)。

1.2 試藥與材料人參皂苷Rg1(批號(hào):110703-200322，供含量測(cè)定用)、人參皂苷Rb1(批號(hào):110704-200318，供含量測(cè)定用)、三七皂苷R1(批號(hào):110745-200312)、川芎嗪(批號(hào):110817-200305，供含量測(cè)定用)、阿魏酸(批號(hào):07733-9910，供含量測(cè)定用)、羥基紅花黃色素A對(duì)照品(批號(hào):111637-200502，供含量測(cè)定用)，均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。

乙腈為色譜純(Caledon Laboratories LTD.)，水為重蒸水，其余試劑均為分析純。

三七經(jīng)鑒定為五加科植物三七Panax Notoginseng(Burk.)F.H.Chen的干燥根及根莖;川芎經(jīng)鑒定為傘形科植物川芎Ligugsticum ChuanxiongHort.的干燥根莖;紅花經(jīng)鑒定為菊科植物紅花Carthamus tinctoriusL.的干燥花。均由湖南三湘中藥飲片有限公司提供。

LSA-30型大孔吸附樹(shù)脂，由西安藍(lán)深交換吸附材料有限責(zé)任公司提供，HPD-100型大孔吸附樹(shù)脂由滄州寶恩化工有限公司提供。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 舒胸片提取液的制備按2010年版《中國(guó)藥典》舒胸片處方各藥味比例，制備同參考文獻(xiàn)［2］2.1項(xiàng)“取三七細(xì)粉，加50%乙醇浸泡2.5 h，回流提取2次，加醇量分別為藥材的8倍、6倍量，提取時(shí)間分別為2.5 h、2.0 h，收集醇提液，回收乙醇，備用;取川芎，加10倍量水煎煮2 h，濾過(guò)，濾液另存，藥渣與紅花加8倍量水煎煮2次，每次1 h，合并3次煎液，60℃減壓濃縮至每1 mL含1 g生藥，在攪拌下緩緩加入乙醇使含乙醇量達(dá)70%，靜置24 h，濾過(guò)，濾液回收乙醇，與上述醇提液合并”，60℃減壓濃縮至生藥質(zhì)量濃度為0.4 g/mL和0.6 g/mL，濾過(guò)，分別將pH值調(diào)至5，即得。

2.2 定量測(cè)定

2.2.1 3種皂苷的測(cè)定［6-7］

2.2.1.1 色譜條件Apollo C18-A色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);以乙腈為流動(dòng)相A，以水為流動(dòng)相B，按表1中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫;體積流量:1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):203 nm，柱溫:30℃。

表1 3種皂苷梯度洗脫條件

2.2.1.2 對(duì)照品溶液的制備分別精密稱取人參皂苷Rg1對(duì)照品、人參皂苷Rb1對(duì)照品和三七皂苷R1對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含人參皂苷Rg10.309 mg、人參皂苷Rb10.315 mg與三七皂苷R10.130 mg的混合溶液，即得。

2.2.1.3 供試品溶液的制備與測(cè)定精密量取洗脫液適量，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。照上述色譜條件，分別精密吸取供試品溶液與對(duì)照品溶液各5 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積積分值，計(jì)算，即得。

2.2.2 川芎嗪的測(cè)定

2.2.2.1 色譜條件Apollo C18-A色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);以甲醇-水(50∶50)為流動(dòng)相;檢測(cè)波長(zhǎng):280 nm;體積流量:1.0 mL/min;柱溫:30℃。

2.2.2.2 對(duì)照品溶液的制備精密稱取川芎嗪對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含0.020 5 mg川芎嗪的溶液，即得。

2.2.2.3 供試品溶液的制備與測(cè)定同2.2.1.1項(xiàng)方法。

2.2.3 阿魏酸的測(cè)定

2.2.3.1 色譜條件Apollo C18-A色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);以甲醇-1%的醋酸(35∶65)為流動(dòng)相;檢測(cè)波長(zhǎng):320 nm;體積流量:1.0 mL/min;柱溫:30℃。

2.2.3.2 對(duì)照品溶液的制備精密稱取阿魏酸對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含0.030 8 mg阿魏酸的溶液，即得。

2.2.3.3 供試品溶液的制備與測(cè)定同2.2.1.1項(xiàng)下方法。

2.2.4 羥基紅花黃色素A的測(cè)定

2.2.4.1 色譜條件Apollo C18-A色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);以甲醇-1%磷酸水溶液(38∶62)為流動(dòng)相;檢測(cè)波長(zhǎng):403 nm;體積流量:1.0 mL/min;柱溫:30℃。

2.2.4.2 對(duì)照品溶液的制備精密稱取羥基紅花黃色素A對(duì)照品適量，加25%甲醇制成每1 mL含0.065 mg的溶液，即得。

2.2.4.3 供試品溶液的制備與測(cè)定同2.2.1.1項(xiàng)下方法。

2.3 不同濃度乙醇梯度洗脫能力的考察

2.3.1 實(shí)驗(yàn)方法取生藥質(zhì)量濃度為0.4 g/mL混合提取液吸附飽和的LSA-30樹(shù)脂，取生藥質(zhì)量濃度為0.6 g/mL混合提取液吸附飽和的HPD-100樹(shù)脂，先用蒸餾水以2 BV/h的體積流量進(jìn)行洗脫，棄去水洗液，然后再依次用10%、30%、50%、70%、95%乙醇進(jìn)行洗脫，各收集洗脫液100 mL，按上述方法測(cè)定各成分的含有量，并計(jì)算洗脫量與洗脫率。

2.3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.3.2.1 不同濃度乙醇對(duì)三七皂苷R1洗脫吸附的情況結(jié)果見(jiàn)表2及圖1。

表2 三七皂苷R1在兩種樹(shù)脂上的梯度洗脫數(shù)據(jù)(n=2)

圖1 三七皂苷R1在樹(shù)脂上梯度洗脫的累積洗脫情況

由表2及圖1可見(jiàn)，在LSA-30樹(shù)脂上，30%乙醇對(duì)三七皂苷R1的洗脫率最高，達(dá)30%，繼用50%和70%乙醇洗脫，累積洗脫率達(dá)53%以上;在HPD-100樹(shù)脂上，10%乙醇與30%乙醇洗脫率分別為20%左右，累積洗脫率約為43%，繼續(xù)用50%、70%、95%乙醇洗脫，三七皂苷R1的累積洗脫率不再增加。兩種樹(shù)脂相比，從10%乙醇到95%乙醇洗脫，LSA-30樹(shù)脂的累積洗脫率高于HPD-100樹(shù)脂。

另外，三七皂苷R1在兩種樹(shù)脂上的累積洗脫率均低于60%，而95%乙醇洗脫液中已不能檢出三七皂苷R1，故推測(cè)其在水洗脫液中可能有一部分損失。

2.3.2.2 不同濃度乙醇對(duì)人參皂苷Rg1洗脫吸附的考察結(jié)果見(jiàn)表3及圖2。

表3 人參皂苷Rg1在兩種樹(shù)脂上的梯度洗脫數(shù)據(jù)(n=2)

圖2 人參皂苷Rg1在樹(shù)脂上梯度洗脫的累積洗脫情況

由表3及圖2可見(jiàn)，在LSA-30樹(shù)脂上，70%乙醇可將吸附的人參皂苷Rg1基本脫附完全;而在HPD-100樹(shù)脂上，50%乙醇使人參皂苷Rg1基本脫附完全，表明人參皂苷Rg1在HPD-100樹(shù)脂上易于脫吸附。兩種樹(shù)脂相比，從10%乙醇到95%乙醇洗脫，LSA-30樹(shù)脂的累積洗脫率幾乎100%，明顯高于HPD-100樹(shù)脂。

另外，人參皂苷Rg1在HPD-100樹(shù)脂上的累積洗脫率約為70%，推測(cè)損失的原因與上述三七皂苷R1相似，即可能因其在該樹(shù)脂上較易脫吸附，其損失部分亦可能在水洗液中。

2.3.2.3 不同濃度乙醇對(duì)人參皂苷Rb1洗脫吸附的情況結(jié)果見(jiàn)表4及圖3。

表4 人參皂苷Rb1在兩種樹(shù)脂上的梯度洗脫數(shù)據(jù)(n=2)

圖3 人參皂苷Rb1在樹(shù)脂上梯度洗脫的累積洗脫情況

由表4及圖3可見(jiàn)，在LSA-30與HPD-100兩種樹(shù)脂上，70%乙醇均可將吸附的人參皂苷Rb1基本洗脫吸附完全。兩種樹(shù)脂相比，從10%乙醇到95%乙醇洗脫，LSA-30樹(shù)脂的累積洗脫率稍高于HPD-100樹(shù)脂，人參皂苷Rb1累積洗脫率均達(dá)80%以上

2.3.2.4 不同濃度乙醇對(duì)羥基紅花黃色素A［10］洗脫吸附的考察結(jié)果見(jiàn)表5及圖4。

表5 羥基紅花黃色素A在兩種樹(shù)脂上的梯度洗脫數(shù)據(jù)(n=2)

注:LSA-30樹(shù)脂的吸附量為6.04mg，HPD-100樹(shù)脂的吸附量為3.04mg。

圖4 羥基紅花黃色素A在樹(shù)脂上梯度洗脫的累積洗脫情況

由表5及圖4可見(jiàn)，在LSA-30樹(shù)脂上，70%乙醇可將吸附的羥基紅花黃色素A基本脫吸附完全;而在HPD-100樹(shù)脂上，10%乙醇可洗脫約一半的羥基紅花黃色素A，50%乙醇可使其基本脫附完全，表明羥基紅花黃色素A在HPD-100樹(shù)脂上更易脫吸附。兩種樹(shù)脂相比，從10%乙醇到95%乙醇洗脫，LSA-30樹(shù)脂的累積洗脫率與HPD-100樹(shù)脂相近。

2.3.2.5 不同濃度乙醇對(duì)川芎嗪洗脫吸附的考察結(jié)果見(jiàn)表6及圖5。

表6 川芎嗪在兩種樹(shù)脂上的梯度洗脫數(shù)據(jù)(n=2)

圖5 川芎嗪在樹(shù)脂上梯度洗脫的累積洗脫情況

由表6及圖5可見(jiàn)，川芎嗪在LSA-30與HPD-100兩種樹(shù)脂上，用不同濃度乙醇梯度洗脫，其脫吸附情況較為相似，30%乙醇可使約一半的川芎嗪洗脫吸附，70%乙醇則可使其基本脫附完全。兩種樹(shù)脂相比，從10%乙醇到95%乙醇洗脫，LSA-30樹(shù)脂的累積洗脫率稍高于HPD-100樹(shù)脂。

2.3.2.6 不同濃度乙醇對(duì)阿魏酸洗脫吸附的考察結(jié)果見(jiàn)表7及圖6。

表7 阿魏酸在兩種樹(shù)脂上的梯度洗脫數(shù)據(jù)(n=2)

圖6 阿魏酸在樹(shù)脂上梯度洗脫的累積洗脫情況

由表7及圖6可見(jiàn)，在LSA-30與HPD-100兩種樹(shù)脂上，70%乙醇均可將吸附的阿魏酸基本洗脫吸附完全。兩種樹(shù)脂相比，從10%乙醇到95%乙醇洗脫，LSA-30樹(shù)脂的累積洗脫率稍高于HPD-100樹(shù)脂。

3 討論

3.1 在同一樹(shù)脂上，盡管上述6種不同結(jié)構(gòu)類型的有效成分在梯度洗脫過(guò)程中洗脫吸附的難易或快慢雖然不完全相同，但均可用70%乙醇將其基本洗脫下來(lái)，95%乙醇洗脫液中已幾乎不能檢出各有效成分。

3.2 在不同樹(shù)脂上，上述6種不同結(jié)構(gòu)類型的有效成分在梯度洗脫過(guò)程中洗脫吸附快慢存在明顯的差異，HPD-100樹(shù)脂明顯快于LSA-30樹(shù)脂，用50%乙醇即可將上述各成分基本脫附完全(人參皂苷Rb1除外)。但從10%乙醇到95%乙醇各成分的累積洗脫率來(lái)看，LSA-30樹(shù)脂優(yōu)于HPD-100樹(shù)脂，這可能與HPD-100樹(shù)脂較易脫吸附以致于水洗除雜質(zhì)過(guò)程時(shí)有效成分亦部分被洗脫而損失有關(guān)?？梢?jiàn)，樹(shù)脂不是越易洗脫吸附性能就越好，而是應(yīng)該對(duì)洗脫劑具有一定的選擇性，方可有效地與雜質(zhì)分開(kāi)。與HPD-100相比，LSA-100樹(shù)脂對(duì)于上述6種有效成分具有較好的脫吸附性能。

3.3 從吸附［2］與脫吸附性能研究結(jié)果進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，采用LSA-100樹(shù)脂純化舒胸片相比HPD-100樹(shù)脂較優(yōu)。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典:2010年版一部［S］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:636.

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