健康奶牛與臨床型乳腺炎奶牛乳腺線粒體蛋白組差異表達分析/王建鋒（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州 730070），陶金忠，張 勇…//中國獸醫(yī)學(xué)報.-2012，32(1).-63～68

運用亞細胞蛋白質(zhì)組學(xué)的研究策略，分離純化亞細胞結(jié)構(gòu)再進行蛋白質(zhì)組學(xué)研究，可提高低豐度蛋白在雙向凝膠電泳中的檢出率。通過對比分析乳腺炎奶牛乳腺與正常奶牛乳腺線粒體蛋白質(zhì)組的表達變化，為奶牛乳腺炎的生物學(xué)治療及抗病育種工作篩選出目基因和蛋白。超速離心法分離線粒體，雙向凝膠電泳分離蛋白，PDQuest7．4軟件分析差異蛋白斑點，高效液相色譜串聯(lián)離子阱質(zhì)譜鑒定差異蛋白。從奶牛乳腺線粒體蛋白2－DE圖譜中篩選出17個差異表達的蛋白質(zhì)斑點，質(zhì)譜鑒定出17個差異表達蛋白（6個蛋白在奶牛乳腺炎發(fā)生過程中下調(diào)，8個上調(diào)，1個只在正常情況下表達，2個只在乳腺炎乳腺組織中表達）。篩選出的差異蛋白質(zhì)涉及到細胞的能量代謝、蛋白質(zhì)合成、mRNA的加工成熟及調(diào)亡調(diào)控等許多方面，表明奶牛乳腺炎發(fā)生時乳腺線粒體組織結(jié)構(gòu)和代謝狀態(tài)都發(fā)生了明顯的變化。

一種直接用于PCR 擴增的山羊瘤胃微生物DNA 提取方法的建立/許發(fā)芝（安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，安徽 合肥 230036），吳勝國，李呂木…//中國微生態(tài)雜志.-2012，24(1).-66～68

目的建立提取高質(zhì)量的瘤胃微生物DNA 的方法，為采用免培養(yǎng)技術(shù)研究山羊瘤胃微生物奠定基礎(chǔ)。方法：采集山羊瘤胃內(nèi)容物，用SDS 高鹽法提取微生物總DNA，以通用引物擴增細菌和古細菌的16S rDNA。結(jié)果提取到的瘤胃微生物總DNA 片段大于23 kb，PCR 能夠擴增出細菌和古細菌的16S rDNA 片段。結(jié)論用該提取方法得到的山羊瘤胃微生物總DNA 能夠滿足后續(xù)實驗的需要。

鴨毛囊中ASIP基因片段的克隆及組織表達分析/梁正翠（揚州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚州 225009），楊海明，王志躍…//中國獸醫(yī)學(xué)報.-2011,31(6).-864～869

根據(jù)GenBank發(fā)表的雞刺鼠信號蛋白(ASIP)基因序列的同源保守區(qū)域,設(shè)計了1對特異性引物。以番鴨、高郵鴨和英系北京鴨(即櫻桃谷鴨)毛囊RNA為模板,經(jīng)擴增、測序及拼接得到的部分mRNA序列均為編碼序列,共308bp,對應(yīng)編碼102個氨基酸。與已發(fā)表的原雞和鵪鶉的ASIP對應(yīng)的mRNA核苷酸序列進行比對,番鴨、高郵鴨和英系北京鴨的同源性均在92.53%以上,相應(yīng)編碼的氨基酸序列同源性均高于92.16%。高郵鴨與英系北京鴨核苷酸,氨基酸序列一致,同源性為100%。半定量PCR結(jié)果顯示,番鴨ASIP基因表達具有較高的普遍性,在皮膚組織(毛囊和皮膚)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)(下丘腦)及其他非皮膚中均有表達。皮膚和毛囊的表達差異不顯著(P＞0.05),下丘腦中的ASIP基因相對表達量最高,極顯著高于皮膚中ASIP基因的表達量(P＜0.01),而與毛囊中的差異不顯著(P＞0.05)。

奶山羊BLG基因敲除載體的構(gòu)建/陳華濤（西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院農(nóng)業(yè)部動物生殖生理和胚胎工程重點開放實驗室，陜西 楊凌 712100），李倩，胡林勇…//中國獸醫(yī)學(xué)報.-2011，31(6).-858～863

根據(jù)已知的BLG序列設(shè)計引物,通過PCR技術(shù)克隆同源臂序列,5′端同源臂2 264bp,包括外顯子1,3′端同源臂4 461bp,包括全部的外顯子3、4、5、6、7,分別連入克隆載體pMD18-T Simple載體中并測序。然后以含有正負篩選標(biāo)記基因的ploxpⅡ載體為基礎(chǔ),將5′端和3′端同源臂片段先后連入其中,進行酶切、PCR鑒定。將構(gòu)建好的基因敲除載體轉(zhuǎn)化組成型表達Cre重組酶的大腸桿菌BM25.8,驗證Loxp位點的活性。結(jié)果表明,構(gòu)建了奶山羊BLG基因第2外顯子缺失的基因敲除載體pBLG2T,且pBLG2T載體中的正選neo基因可以被Cre重組酶去除。為獲得BLG 1條等位基因缺失型細胞株以及培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)奶山羊新品種奠定基礎(chǔ)。

豬源鏈球菌對大環(huán)內(nèi)酯類主要耐藥基因的檢測/芮萍（河北科技師范學(xué)院河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點實驗室，河北 秦皇島 066004），馬增軍，陳翠珍…//中國獸醫(yī)學(xué)報.-2011，31(6).-838～842

為了解豬源鏈球菌對紅霉素相關(guān)耐藥基因ermB、ermA和mefA的分布,對河北省及遼寧部分地區(qū)的64株豬源鏈球菌分離株,用PCR方法檢測51株紅霉素耐藥株和13株紅霉素敏感株中ermB、ermA和mefA基因。結(jié)果顯示,耐藥菌株中ermB基因的檢出率為98.04%(50/51),ermA的檢出率為25.49%(13/51),沒有檢出mefA基因。初步表明河北省及遼寧部分地區(qū)的豬源鏈球菌對紅霉素的耐藥機制以ermB基因介導(dǎo)為主。20株菌的ermB基因核苷酸序列與GenBank中同源序列相似性為99%～100%。與參照序列AJ972604.1相比,20株菌的ermB氨基酸序列的突變位點較少,主要有Thr 75→Ser、Ser 100→Asn、Arg 118→His、Leu 175→Ile,以100和118位突變?yōu)橹?進一步說明ermB基因是相對穩(wěn)定的。

利用反向遺傳技術(shù)拯救H9N2重組病毒/井波（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)部動物流感重點開放實驗室，黑龍江 哈爾濱 150001），李呈軍，陳化蘭//中國獸醫(yī)學(xué)報.-2011，31(6).-835～837，851

為研制高效特異的H9N2亞型AI疫苗,選取我國具有代表性的毒株A/chicken/Shanghai/10/01(H9N2)(簡稱SH10),以12質(zhì)粒系統(tǒng)為基礎(chǔ),利用反向遺傳操作技術(shù)構(gòu)建了1株表面基因由SH10提供、內(nèi)部基因由12質(zhì)粒系統(tǒng)提供的重組病毒SH/PR8,為新型疫苗的研制提供了新的毒株。

FSH對體外培養(yǎng)仔豬睪丸支持細胞skp2表達的影響/甘瑞（西南大學(xué)動物科技學(xué)院重慶市牧草與草食家畜重點實驗室 重慶 400716），左敬，張國升…//畜牧獸醫(yī)學(xué)報.-2011，42(6).-765～771

本研究旨在確定促卵泡素是否可通過cAMP、Ca2+內(nèi)流和細胞外調(diào)節(jié)的蛋白激酶(ERK1/2)調(diào)節(jié)培養(yǎng)條件下未成熟仔豬睪丸支持細胞中S期激酶相關(guān)蛋白2(skp2)的表達。以培養(yǎng)的仔豬睪丸支持細胞為實驗材料,通過添加各種信號通路的抑制劑,運用Western blot檢測skp2、p27kip1蛋白的表達,運用實時熒光定量PCR檢測skp2mRNA的表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn),促卵泡素(50ng.mL-1)以時間依賴的方式促進了skp2蛋白和mRNA的表達(P＜0.05),這一作用在30min時達到高峰。FSH(50ng.mL-1)和Forskolin(10μmol.L-1)均促進了skp2蛋白和mRNA的表達(P＜0.05),但降低了p27kip1蛋白的水平,而Rp-cAMP、Verapamil和U0126都抑制了FSH的作用,使skp2蛋白和mRNA的表達有所下降,但提高了p27kip1蛋白的表達,但3種抑制劑單獨作用時對skp2蛋白、mR-NA以及p27kip1蛋白的表達沒有顯著影響(P＞0.05)。這表明FSH可能主要通過影響cAMP的產(chǎn)生和Ca2+內(nèi)流,并激活ERK1/2通路調(diào)節(jié)skp2蛋白的表達,而skp2蛋白的水平與p27kip1蛋白成負相關(guān)。

豬SelS基因啟動子區(qū)的克隆及序列分析/張寧波（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所 動物營養(yǎng)學(xué)國家重點實驗室，北京 100193），井文倩，李奎//畜牧獸醫(yī)學(xué)報.-2011，42(6).-759～764

本研究旨在克隆和分析豬硒蛋白S基因(Selenoprotein S,SelS)啟動子序列,并初步探討潛在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點對其表達的影響。通過SON-PCR技術(shù)克隆豬SelS基因啟動子序列,利用PromoterScan、Promoter 2.0等在線工具預(yù)測其啟動子特征,利用細菌脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)刺激PK15細胞,研究NF-kappaB轉(zhuǎn)錄因子對豬SelS基因啟動子活性的影響。試驗獲得了豬SelS基因約3kb的啟動子序列,部分序列比對發(fā)現(xiàn)豬、人、牛和小鼠物種間相似性僅7%～51%。預(yù)測豬SelS基因轉(zhuǎn)錄起始位點在-398bp,豬和人SelS基因啟動子存在系列保守的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點,包括NF-kappaB、CCAAT box、SP1、USF等,但均未發(fā)現(xiàn)典型的TATA box。細胞試驗表明,NF-kappaB轉(zhuǎn)錄因子可以上調(diào)豬SelS基因的表達。結(jié)果提示,物種間SelS基因啟動子相似性較低,但豬和人SelS基因的轉(zhuǎn)錄因子非常保守,LPS誘導(dǎo)試驗提示,豬SelS基因表達可能受NF-kappaB轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。

雞恒定鏈分子跨膜區(qū)2個氨基酸殘基在形成MHCⅡ-Ii復(fù)合物中的作用/許發(fā)芝（安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)安徽省人獸共患病學(xué)重點實驗室，合肥23003），吳勝國，劉雪蘭…//畜牧獸醫(yī)學(xué)報.-2011，42(5).-721～728

本研究旨在探明雞恒定鏈跨膜區(qū)特定氨基酸在形成MHCⅡ-Ii復(fù)合物聚合中的作用特征。用大引物PCR定點突變法將雞Ii鏈跨膜區(qū)2個氨基酸Gln47和Thr50分別突變?yōu)楸彼?Ala),再連接到pEGFP-C1載體中,構(gòu)建含Ii-GFP融合基因的真核表達載體。同時還分別構(gòu)建了含pDsRed2-N1-MHCⅡα、pDsRed2-N1-MHCⅡβ、pEGFP-N1-MHCⅡα和pEGFP-N1-MHCⅡβ真核表達載體。用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將這些重組質(zhì)粒單獨或共轉(zhuǎn)染至COS-7細胞,培養(yǎng)48h后經(jīng)熒光顯微鏡檢測野生型Ii和突變型Ii與MHCⅡ類分子的細胞定位,并通過免疫共沉淀研究它們之間的相互關(guān)系。結(jié)果顯示,野生型Ii鏈與MHCⅡα或MHCⅡβ之間存在細胞內(nèi)的共定位,而突變型Ii與MHCⅡα或MHCⅡβ在細胞中共表達后未出現(xiàn)共定位現(xiàn)象。免疫共沉淀結(jié)果顯示,在野生型Ii鏈與MHCⅡα或(和)MHCⅡβ單轉(zhuǎn)染或三者共轉(zhuǎn)染COS-7細胞后,均能檢測到MHCⅡα-Ii、MHCⅡβ-Ii和MHCⅡ-Ii復(fù)合物,而突變型Ii鏈與MHCⅡα或(和)MHCⅡβ單轉(zhuǎn)染或三者共轉(zhuǎn)染COS-7細胞后,均檢測不到MHCⅡα-Ii、MHCⅡβ-Ii和MHCⅡ-Ii復(fù)合物。因此Ii鏈跨膜區(qū)Gln47和Thr50 2個氨基酸對于MHCⅡ-Ii復(fù)合體的形成是至關(guān)重要的。

3種受體抑制劑對雞傳染性支氣管炎病毒感染雞胚腎細胞的影響/尹鑫（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院 哈爾濱 150030），張穎，劉瀾瀾…//畜牧獸醫(yī)學(xué)報.-2011，42(5).-704～710

本研究旨在闡明雞氨肽酶N(chAPN)、唾液酸以及硫酸乙酰肝素在傳染性支氣管炎病毒(IBV)M41株感染宿主細胞中的作用以及3種受體特異抑制劑對IBV M41株在自然宿主CEK細胞內(nèi)增殖能力的影響。作者選擇苯丁抑制素(Bestatin)、神經(jīng)氨酸酶(NA)和肝素酶Ⅲ分別作為APN、唾液酸以及硫酸乙酰肝素的抑制劑,在不同條件下,單獨或共同預(yù)處理CEK細胞,而后接入IBV M41株病毒感染細胞,應(yīng)用熒光定量PCR方法定量檢測IBVM41株在CEK細胞中的增殖變化,應(yīng)用雞胚半數(shù)感染劑量法(EID50)測定病毒感染雞胚能力的變化。結(jié)果表明,經(jīng)Bestatin和NA處理的CEK細胞獲得了抵抗IBV M41株感染的能力,與未經(jīng)處理的(對照組)細胞相比,Besta-tin和NA能顯著降低IBV M41株在CEK細胞內(nèi)的增殖及對雞胚的感染能力(P＜0.01),且Bestatin處理后CEK細胞內(nèi)的病毒增殖量顯著低于NA處理后CEK細胞內(nèi)的病毒增殖量,兩者病毒液的EID50滴定值差異顯著(P＜0.01);肝素酶Ⅲ的處理則對病毒增殖無顯著影響;3種受體抑制劑共同處理CEK細胞后,病毒增殖量顯著下降(P＜0.01),但仍有病毒增殖,病毒液的EID50滴定值為102.12±0.05.0.1mL-1。結(jié)果提示,chAPN在IBV感染宿主細胞的過程中發(fā)揮特異性受體作用,而唾液酸在IBV感染宿主細胞中發(fā)揮輔助受體作用,硫酸乙酰肝素不是IBV在自然感染中的必需因素,同時提示,可能存在其他未知受體因子參與IBV感染宿主細胞的過程。

不同采集方法對豬卵母細胞的采集效率和成熟率的影響/卿玉波（云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 云南省版納微型豬近交系重點實驗室，昆明 650201），魏紅江，姜河?！?/畜牧獸醫(yī)學(xué)報.-2011，42(5).-629～634

本研究旨在開發(fā)出一種對COCs損傷小且采集效率和卵母細胞成熟率高的卵母細胞采集方法。從屠宰場采集來的卵巢運回實驗室后隨機分為3組,分別用抽吸法、解剖法和刀切過濾法3種方法采集COCs,然后進行體外成熟培養(yǎng),通過對COCs采集效率、COCs完整性及卵母細胞體外成熟率的比較,研究解剖法、刀切過濾法和抽吸法3種采集方法對豬卵母細胞的采集效率和成熟率的影響。結(jié)果表明：每個卵巢采集COCs個數(shù),刀切過濾法顯著高于解剖法和抽吸法(P＜0.05),而解剖法僅為1.55個,顯著低于抽吸法(P＜0.05);采集效率抽吸法最佳,采集和挑選單個COCs的時間顯著低于解剖法和刀切過濾法(P＜0.05),刀切過濾法次之,但顯著低于解剖法(P＜0.05);A、B級COCs比例,解剖法高達99.23%,顯著高于其他2種方法(P＜0.05),刀切過濾法與抽吸法差異不顯著(P＞0.05);卵母細胞的成熟率,解剖法和刀切過濾法都達到80%,二者間差異不顯著(P＞0.05),但顯著高于抽吸法(P＜0.05);100個成熟卵母細胞所需的卵巢數(shù)量,刀切過濾法最少,僅為17.4個,而解剖法和抽吸法分別高達80.6和90.3個;需要的總采集時間(采集和挑選的時間),刀切過濾法最低,僅為126.6min,而解剖法最高,為758.9min。綜上所述,與抽吸法和解剖法相比,刀切過濾法是一種高效、快速的卵母細胞采集方法。