劉淑華，楊宗照，謝 正

Sapovirus（SaV）即札幌病毒，又名札如病毒、沙波病毒，屬于杯狀病毒科（Caliciviridae），為單股正鏈RNA病毒，基因組全長(zhǎng)7－8kb，帶有多聚A尾，沒有囊膜，病毒直徑27－35nm。SaV與人和動(dòng)物的胃腸炎有關(guān)，不同年齡人群都可感染，以嬰幼兒最易感，能夠引起人（尤其是兒童和老人）的腹瀉，主要經(jīng)糞—口傳播。SaV原型毒株于1977年發(fā)現(xiàn)于日本Sapporo（札幌）的一個(gè)孤兒院。近年來(lái)，在一些地方SaV逐漸成為僅次于諾如病毒（NoV），排列第二的腹瀉病主要病因［1］。

1 基 因

測(cè)出的第一個(gè)SaV基因組是 Hu／Manchester／93／UK，它屬于GII型。SaV包含有2個(gè)主要的開放閱讀框（ORF）。ORF1編碼一個(gè)多聚蛋白，經(jīng)過(guò)蛋白酶處理后分解為幾個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白和一個(gè)衣殼蛋白 （capsid，VP1）。ORF2 編 碼 一 個(gè) 堿 性 蛋 白（VP2），它是非結(jié)構(gòu)蛋白。GI、GIV、GV型SaV還含有一個(gè)較小的ORF3，編碼一個(gè)堿性蛋白。

由于人的SaV不能進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，因此不能使用中和試驗(yàn)對(duì)SaV進(jìn)行分型，比較普遍接受的分型方法是對(duì)衣殼蛋白全基因的序列分析。SaV被分為 GI．1－5，GII．1－6，GIV．1和 GV．1，即4個(gè)主型，13個(gè)亞型［2－3］。

2 SaV的流行病學(xué)

SaV可以感染人、豬、貂、蛤、牡蠣等，感染人的主要為GI、GII、GIV和GV型，感染豬的主要為GⅢ型以及少量其它類型，如GVI、VII型。

已經(jīng)有報(bào)道發(fā)生SaV的國(guó)家有匈牙利、意大利、美國(guó)、日本、韓國(guó)、中國(guó)、丹麥、芬蘭、匈牙利、意大利、斯洛文尼亞、西班牙、愛爾蘭、巴西等。SaV在我國(guó)安徽、廣州、南京、南寧等地腹瀉病例中均存在該病毒，檢出的基因型有GI、II型，尚未有GIV、V型的報(bào)道。同一地區(qū)不同年份可能以不同的基因型為主［4］。日本6年的檢測(cè)結(jié)果顯示2003－2004年GI．1為主，此后2004－2005年 GI．6為主，2005－2007又以GI．1為主，2007－2008以 GIV為主，2008－2009以GI為主。有時(shí)也會(huì)檢測(cè)到多種的基因型，如Pang［5］對(duì)2004－2007年加拿大Alberta地區(qū)爆發(fā)的胃腸炎病例檢測(cè)，GI、GII、GIV、GV均有發(fā)生。

SaV可以從病人糞便、環(huán)境樣本（如廢水）、水產(chǎn)（蛤）、食品等中檢出［6］。如 Hansman年從河水中檢出GI、GV型SaV。蛤、廢水中檢測(cè)出的SaV與兒童腹瀉病例的SaV基因序列同源性非常高，提示可能存在食源性傳播。

發(fā)病季節(jié)方面，資料還比較少，以寒冷季節(jié)相對(duì)較多。日本流行季節(jié)為4－6月或10－12月［7］。Christina對(duì)丹麥的檢測(cè)沒發(fā)現(xiàn)有明顯的季節(jié)性。Dey［8］對(duì)孟加拉國(guó)2004－2005年的嬰幼兒急性胃腸炎病例監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)發(fā)病以秋、冬季居多。

SaV常感染兒童，但也會(huì)導(dǎo)致成人發(fā)病。Wu［9］報(bào)道臺(tái)灣北部大學(xué)生發(fā)生SaV感染的報(bào)道。Mikula也報(bào)道了成人發(fā)病的例子。Pang［5］報(bào)道病例中發(fā)病年齡以老人（＞65歲）和兒童（＜6歲）為主。SaV在病人體內(nèi)的排毒期通常為2w，但少數(shù)在發(fā)病后2～4w仍然排毒［10］。

不同的人群中該病的檢出率，除去SaV引起的爆發(fā)病例外，一般情況下少的只有0．5%，多的為10%～20%。Liu［11］對(duì)北京2007年7月至2008年6月腹瀉樣本557份的檢測(cè)，檢出率僅占0．5%。Chang［12］對(duì)2006－2007年福建、安徽等9省1 110份樣本檢測(cè)，10份（0．9%）為SaV 陽(yáng)性，G I．1，G I．3，G II．3型均有。Nakanishi對(duì)腹瀉病例的檢測(cè)以輪狀病毒為主，其次是NoV、腺病毒，SaV只占了1．7%［13］，Chan－it［14］對(duì) 662 份 胃 腸 炎 兒 童 檢 測(cè)SaV陽(yáng)性20例（3%），其中15例為G為GI．1，其次為GII．1、GI．3。Svraka［15］對(duì)芬蘭2007－2009年的檢測(cè)表明478次急性胃腸炎檢測(cè)，SaV引起的有19次（4%），主要為GI．2，發(fā)病年齡多為60歲以上的老人。

對(duì)于兒童的檢測(cè)結(jié)果中，輪狀病毒NoV、sapo－virus、腺病毒、星狀病毒是常見的幾種病毒性腹瀉的病原，如Lyman［16］對(duì)29次幼兒園急性腹瀉的檢測(cè)，其中13次（45%）為病毒性腹瀉，其中輪狀病毒、NoV、星狀病毒、SaV 分別為17%、10%、10%、7%的陽(yáng)性率。Christina對(duì)丹麥0－3歲腹瀉兒童檢測(cè)SaV，97例（9%）為陽(yáng)性，7－18個(gè)月齡相對(duì)高發(fā)，G1．1占陽(yáng)性病例的一半。Rachakonda［17］對(duì)兒童腸胃炎病例226份的檢測(cè)結(jié)果表明23份（10．2%）為SaV陽(yáng)性，22份為 GI，1份為 GII。Phan［7］檢測(cè)日本1154份2003－2005年腹瀉嬰兒和兒童，469份為腹瀉病毒陽(yáng)性，其中SaV陽(yáng)性49份（10．44%）。測(cè)序表明GI（GI．1、GI．4、GI．6和GI．8）型為主，GI．6是2004－2005年的主型。

在某些地區(qū)SaV是病毒性腹瀉的主要病因。Pang［5］對(duì)2004－2007年加拿大 Alberta地區(qū)爆發(fā)的胃腸炎病例檢測(cè)，SaV占17．6%（43／244）。

3 癥狀與致病性

一般而言嬰兒、兒童、成人感染后主要引起腹瀉，癥狀比NoV輕一點(diǎn)。但是也有引起嚴(yán)重病例的報(bào)道。在日本Sapporo孤兒院，暴發(fā)的36例傳染性胃腸炎病例，單獨(dú)由SaV、NoV、輪狀病毒引起的各有6、8、10例，由NoV和SaV混合引起的1例，腺病毒和星狀病毒各占3例和2例，Sav成為引起腹瀉的主要病原之一［18］。

Johansson［19］報(bào)道23名成年人感染SaV的癥狀情形。平均年齡52歲，惡心腹瀉、嘔吐、腹部痙攣、頭痛、肌肉痛、發(fā)燒等癥狀。發(fā)生腹瀉占72%，嘔吐占56%，癥狀持續(xù)時(shí)間為6d。

Usuku［20］對(duì)日本初中生一次學(xué)習(xí)旅行后發(fā)生胃腸炎病例檢查43份樣本，未檢出NoV和常見的食源性細(xì)菌（沙門氏菌、志賀氏菌、彎曲桿菌），而檢出了33份SaV（GIV）型，說(shuō)明SaV可以引起胃腸炎疾病暴發(fā)。該文對(duì)癥狀統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)見表1。

表1 SaV感染引起的疾病癥狀

Hansman［21］檢測(cè)了日本2006年2－3月幼兒園發(fā)生1名成年人和66名兒童（61．7%）和嘔吐、腹瀉，經(jīng)檢查為SaV GI感染，此次沒有檢出輪狀病毒和NoV，說(shuō)明SaV能夠引起較為嚴(yán)重的疾病流行。

2007年5月臺(tái)灣北部55名大學(xué)生有胃腸炎癥狀：腹瀉、嘔吐、肚子絞痛、發(fā)燒。癥狀持續(xù)10d（平均4．7d），抽檢8份樣本，未檢出細(xì)菌、輪狀病毒、NoV，電鏡觀察到杯狀病毒樣粒子。使用針對(duì)SaV衣殼蛋白的引物SV－F11、SV－R1檢測(cè)到7個(gè)樣本為陽(yáng)性，熒光定量顯示每克糞便中的病毒cDNA拷貝數(shù)為0．286－172×108［22］。

據(jù)Wu報(bào)道SaV也引起嘔吐、腹瀉、肚子疼、發(fā)燒、脫水，持續(xù)12～60h［23］。

4 診 斷

實(shí)驗(yàn)室主要的診斷方法有針對(duì)病毒病原、病毒RNA和抗體等檢測(cè)方法。電鏡和抗原ELISA可以檢測(cè)完整的病毒粒子和病毒抗原。RT－PCR檢測(cè)病毒RNA，檢測(cè)人SaV的熒光定量RT－PCR方法已經(jīng)建立。重組的VLP被用來(lái)建立檢測(cè)抗體的ELISA方法。

4．1 電鏡（EM） 人的原型毒株Sapporo病毒首次發(fā)現(xiàn)是用電鏡。不過(guò)EM不很敏感，只能檢測(cè)到106／mL以上的病毒粒子。免疫電鏡可以增加敏感度（10倍以上），它的特異性取決于抗血清的質(zhì)量。EM的缺點(diǎn)是需要熟練的操作人員、儀器昂貴、比較費(fèi)時(shí)間，因此不適合大樣本的檢測(cè)。

4．2 RT－PCR 該方法最常用，不過(guò) RT－PCR的影響因素較多，包括樣品的質(zhì)量、RNA提取的方法、引物特異性、RT－PCR參數(shù)、檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的方法。巢式RT－PCR能提高敏感度10～1 000倍，但是也增加了交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)。熒光定量RT－PCR增加了檢測(cè)的敏感度，而且檢測(cè)速度更快。

4．2．1 RNA的提取 提取時(shí)要考慮RNA的回收能力和去除RNA抑制劑的能力。常用的有酚－氯仿、Trizol、磁珠等方法提取。

4．2．2 引物的設(shè)計(jì) 一般有兩種策略：（1）使用針對(duì)檢測(cè)人的SaV的引物，不擴(kuò)增其它動(dòng)物的SaV，目前以這種方法的應(yīng)用逐漸增多，大多數(shù)引物設(shè)計(jì)在相對(duì)保守的RdRp與衣殼蛋白連接區(qū)。但是即使是該區(qū)域的基因序列也有很大差異，因此常常需要設(shè)計(jì)較多的引物或設(shè)計(jì)兼并引物。（2）檢測(cè)杯狀病毒的通用引物是p290、p289，它們針對(duì)的保守區(qū)是RdRp區(qū)域的DYSKWDST、YGDD，這對(duì)引物通用性高但敏感度低，它能夠擴(kuò)增人的SaV、NoV，甚至輪狀病毒。因此，這對(duì)引物的擴(kuò)增結(jié)果需要測(cè)序以確定其特異性。

Okada［24］設(shè)計(jì)了針對(duì)人SaV GI、GII、GIV、GV型的RT－PCR，通過(guò)檢測(cè)臨床樣本，發(fā)現(xiàn)195份陽(yáng)性，其中GI、GII、GIV和 GV分別有106、79、3和7份。GI和GII在樣本收集的8年內(nèi)一致存在，另兩種出現(xiàn)的較晚。該方法是實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)SaV的較好的一種方法，它不但能夠檢測(cè)到各種基因型SaV，還能通過(guò)電泳區(qū)分，實(shí)際應(yīng)用價(jià)值較大。

表2 檢測(cè)SaV的通用引物

圖1 針對(duì)SaV型與亞型的RT－PCR引物的位置

Yan［25］針對(duì)引起腹瀉有多種病毒，設(shè)計(jì)了同時(shí)檢測(cè) NoV（GI、GII）、SaV、星狀病毒的 RT－PCR方法，其中 SaV 引物 序 列 為 SLV5317 5′－CTCGCCACCTACRAWGCBTGGTT－3′、SLV5749 5′－CGGRCYTCAAAVSTACCBCCCCA－3′。該方法的優(yōu)點(diǎn)是可以同時(shí)檢出多種病原，比較節(jié)省勞動(dòng)強(qiáng)度。不足是由于該方法設(shè)計(jì)的較早，主要是根據(jù)GI型SaV（Manchester／93、Sapporo／82、Houston／86）設(shè)計(jì)的，因此可能不能完全檢出所有類型的SaV。4．2．3 熒光定量 RT－PCR 與常規(guī)的 RT－PCR相比，熒光定量方法省去了電泳、雜交步驟，要快速、敏感，并且可以定量。

Oka［26］設(shè)計(jì)了檢測(cè)SaV的熒光定量方法，包含3條正向引物，2條MGBNFQ探針，1條反向引物，引物位置在多聚酶和衣殼蛋白的結(jié)合處，該方法的敏感度為每管25個(gè)拷貝。臨床試驗(yàn)證實(shí)該方法可以檢出了SaV GI、II、IV、V型，具有較好的敏感度和特異性，不與星狀病毒、腺病毒反應(yīng)。

表3 檢測(cè)SaV熒光定量RT－PCR的引物與探針

Chan［27］設(shè)計(jì)了的引物探針稍簡(jiǎn)潔一些，有2條正向引物，1條MGBNFQ探針，1條反向引物來(lái)檢測(cè)所有類型的人SaV，其位置也是在SaV和衣殼蛋白連接處。通過(guò)臨床應(yīng)用，證實(shí)該方法可以檢出了SaV GI、GII、GIV型，最低為10個(gè)拷貝／反應(yīng)，不與輪狀病毒和NoV反應(yīng)。

Logan［28］設(shè)計(jì)了實(shí)時(shí) RT－PCR 方法同時(shí)檢測(cè)NoV、SaV和星狀病毒，但不是在同一管檢測(cè)，而是每種病分開檢測(cè)，檢測(cè)SaV的探針針對(duì)GI、II、IV型，而且使用使用FAM單一染料標(biāo)記，因此對(duì)于測(cè)到的陽(yáng)性樣本不能區(qū)分是哪種基因型。

van Maarseveen［29］針對(duì)當(dāng)前導(dǎo)致腹瀉的病原較多這一問題，設(shè)計(jì)了同時(shí)檢測(cè)F群腺病毒、星狀病毒、輪狀病毒A群、NoV（GI、GII）和SaV的熒光定量方法。該方法敏感，提高了檢出率，但同樣該法設(shè)計(jì)的SaV引物是根據(jù)GI型序列（Mc114）設(shè)計(jì)的，可能不能完全檢出所有類型的SaV。

采用RT－PCR方法需要注意使用RT－PCR方法或者熒光定量方法檢出糞便中的排毒期在發(fā)生癥狀后14d絕大多數(shù)都轉(zhuǎn)為陰性，極個(gè)別仍可檢出。一些樣本需要稀釋以消除抑制性成分再擴(kuò)增。在對(duì)水中SaV檢測(cè)時(shí)需要先過(guò)濾、離心等方法濃縮后再提取 RNA［30］。

4．3 免疫學(xué)方法 使用提純的病毒或桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的病毒樣粒子產(chǎn)生的高免血清建立的抗原ELISA可以檢測(cè)病毒粒子或抗體，特異性比較高，但是由于SaV的變異度比較高，因此不能檢測(cè)所有的基因型SaV，限制了其應(yīng)用。

5 消毒措施

專門針對(duì)SaV有效的消毒技術(shù)還未見報(bào)道，因此只能采用常規(guī)衛(wèi)生和消毒措施。由于它屬于杯狀病毒，暫時(shí)可以參考針對(duì)其它杯狀病毒（如NoV）的研究報(bào)道。杯狀病毒抵抗力較強(qiáng)，在環(huán)境中可以保持?jǐn)?shù)周，加熱和10×10－12的氯化物可以用作水質(zhì)消毒。紫外線或γ射線可以滅活，乙醇、高溫等也有降低病毒滴度的作用。

6 總 結(jié)

盡管SaV已經(jīng)發(fā)現(xiàn)30多年了，由于SaV暫時(shí)還不能使用合適的細(xì)胞培養(yǎng)，對(duì)于研究SaV非常不便。在國(guó)外一些地方，此病成為腹瀉疾病爆發(fā)的主要原因，但有時(shí)感染也不表現(xiàn)臨床癥狀，尤其對(duì)于青年人往往沒有癥狀。目前國(guó)內(nèi)許多醫(yī)院還沒有對(duì)此病進(jìn)行檢查，許多地方病人的感染情況、流行情況尚不十分清楚，還沒有疫苗可用，還缺乏針對(duì)SaV明確有效的消毒技術(shù)，這些不利因素給該病的檢測(cè)、預(yù)防與控制帶來(lái)較大難度。由于一些豬SaV與人的SaV抗原性和基因同源性較高引起了人們的關(guān)注。

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