楊宏強(qiáng)，王 菊，李 江，馬少波，卞志遠(yuǎn)，趙 瑾，張示杰，陳孝平

2.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院肝膽外科；

3.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院

囊型肝包蟲(chóng)病是世界畜牧地區(qū)常見(jiàn)的人獸共患疾病。包蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程即是包蟲(chóng)與宿主相互作用、相互影響的過(guò)程。大量的研究表明宿主對(duì)包蟲(chóng)的抑制主要與宿主的免疫反應(yīng)有關(guān)[1－2]，而包蟲(chóng)對(duì)宿主的影響主要表現(xiàn)在對(duì)寄生的組織器官結(jié)構(gòu)和功能的損傷。在囊型肝包蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，隨著包蟲(chóng)囊的不斷增大，導(dǎo)致肝臟組織發(fā)生了嚴(yán)重的病理解剖學(xué)改變。由于不易獲得病理組織標(biāo)本，對(duì)人肝包蟲(chóng)病患者的肝內(nèi)組織結(jié)構(gòu)尤其是肝內(nèi)管道的病理學(xué)研究受到限制，相關(guān)報(bào)道較少見(jiàn)，本研究通過(guò)對(duì)近年來(lái)收集的手術(shù)切除的人囊型肝包蟲(chóng)及其周?chē)母蝺?nèi)血管及膽管標(biāo)本，進(jìn)行病理組織學(xué)研究，描述囊性肝包蟲(chóng)外囊及周?chē)蝺?nèi)血管、膽管的病理解剖學(xué)改變，探討其對(duì)肝臟產(chǎn)生的影響。

1 材料及方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 選取我院2009年6月至2010年6月囊性肝包蟲(chóng)患者的新鮮手術(shù)標(biāo)本42例，其中肝右葉包蟲(chóng)39例，肝左葉包蟲(chóng)3例，所有標(biāo)本均包括肝包蟲(chóng)外囊及其外面附著的四級(jí)及四級(jí)以上肝內(nèi)管道（實(shí)驗(yàn)組）。病理教研室提供無(wú)肝病尸檢者肝組織5例（四級(jí)Glisson系統(tǒng)內(nèi)管道及周?chē)谓M織）做正常對(duì)照（對(duì)照組），其中肝右葉組織4例，肝左葉組織1例。

1.2 主要試劑和儀器 Masson三色試劑盒、ACTIN、VEGF單克隆抗體均購(gòu)于DAKO公司，通用型二抗及DAB顯色試劑盒購(gòu)自于北京中杉金橋生物技術(shù)公司。

1.3 大體標(biāo)本觀察 大體標(biāo)本觀察肝包蟲(chóng)周?chē)?、膽管（Glisson系統(tǒng)為主）及周?chē)M織的病理解剖學(xué)改變。

1.4 制片 實(shí)驗(yàn)組取包蟲(chóng)外囊及其表面附著的Glisson鞘內(nèi)四級(jí)管道，對(duì)照組取肝臟對(duì)應(yīng)級(jí)別的Glisson系統(tǒng)組織標(biāo)本經(jīng)10%的中性甲醛溶液固定，石蠟包埋；制備4μm厚的組織切片備用。

1.5 標(biāo)本組織HE染色 組織切片用60。C烘烤30min后進(jìn)行常規(guī)HE染色，顯微鏡下觀察。

1.6 Masson染色 切片脫蠟至水，按Masson三色試劑盒說(shuō)明書(shū)：加A1、A2液1∶1混和液，染色15min；流水稍洗，酸酒精分化，流水沖洗10min；加B液5min；蒸餾水洗去B液2min；加C液5min，倒去C液，加D液染25min；1%冰醋酸洗去D液約1 min；95%酒精洗3次，每次1min；無(wú)水乙醇脫水5 min，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固，顯微鏡觀察。

1.7 免疫組織化學(xué)染色（SP法） 組織均經(jīng)常規(guī)固定，脫水石蠟包埋，每例連續(xù)切片10張，切片厚度5 μm，37。C烘箱過(guò)夜備用。每例均與HE染色對(duì)照。石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟至水，將切片浸入0.1mol／L枸櫞酸鹽緩沖液（pH 6.0）中，微波修復(fù)10min（高火，750W），自然冷卻至室溫，PBS緩沖液5min×3次，10%山羊血清封閉，37。C孵育10min，滴加一抗（ACTIN、VEGF抗體，工作濃度均為1∶100）。4。C孵育過(guò)夜；PBS浸洗玻片3次（每次5min），37。C復(fù)溫1h；加通用型二抗，37。C孵育30min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染10min，l%鹽酸乙醇分化，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。

2 結(jié) 果

2.1 大體病理標(biāo)本觀察結(jié)果 肝包蟲(chóng)外囊組織質(zhì)韌，自肝剝離面呈黃白色，表面較光滑?？梢?jiàn)樹(shù)枝狀的Glisson系統(tǒng)內(nèi)血管及膽管失去原有的解剖位置，包繞、附著于外囊表面，管道與外囊粘連緊密，不能分離，其所屬肝組織消失。外囊及附著的肝內(nèi)管道的切面可以觀察到，粘附于外囊的管道略隆起，近肝門(mén)段管道管腔殘存而至遠(yuǎn)端漸閉鎖（圖1）。

圖1 完整的肝包蟲(chóng)外囊及其表面附著的樹(shù)枝狀的Glisson系統(tǒng)（▲所示）左上角圖顯示外囊及其表面附著的肝內(nèi)管道橫剖面Fig.1 Unbroken ectocyst of hepatic hydatid cyst and blood vessels and bile ducts in the Glisson＇s system（▲）attached on the surface of ectocyst，transverse plane of the Glisson＇s system attached on the surface of ectocyst is showed in left－upper figure

2.2 蘇木素－伊紅染色鏡下觀察結(jié)果 對(duì)照組5例均見(jiàn)正常肝內(nèi)Glisson鞘內(nèi)結(jié)構(gòu)完整，各種管道排列整齊，管腔飽滿，周?chē)梢?jiàn)疏松結(jié)締組織包繞。肝動(dòng)脈管腔規(guī)則，管徑較小，管壁厚，而且內(nèi)膜、中膜、外膜分界清晰。門(mén)靜脈管徑明顯較肝動(dòng)脈及膽管大，管壁薄。膽管管腔規(guī)則，粘膜、肌層結(jié)構(gòu)完整（圖2－Ⅰ）。高倍鏡下觀察匯管區(qū)結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞圍繞匯管區(qū)排列整齊，大小正常，細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)清晰，未見(jiàn)明顯變性、壞死。（圖3－Ⅰ）。

實(shí)驗(yàn)組42例囊性肝包蟲(chóng)周?chē)饽?nèi)Glisson鞘內(nèi)結(jié)構(gòu)紊亂，各種管道排列雜亂，管道周?chē)w維組織明顯增生，管道與周?chē)M織分界不清。肝動(dòng)脈管徑減小，動(dòng)脈壁厚薄不一，而且內(nèi)膜、中膜、外膜分界不及對(duì)照組清晰。門(mén)靜脈管徑明顯減小，管腔變得扁平，管壁變薄。膽管管腔不規(guī)則，管徑減小，而膽管壁變厚（圖2－Ⅱ）。肝包蟲(chóng)囊腫周?chē)母谓M織結(jié)構(gòu)形態(tài)異常、萎縮，匯管區(qū)結(jié)構(gòu)不清，可見(jiàn)肝細(xì)胞大小不均、變性、壞死（圖3－Ⅱ）。

圖2 －Ⅰ 正常肝臟肝組織及肝內(nèi)Glisson系統(tǒng)管道（右肝，四級(jí)）（HE×40）；圖2－Ⅱ 囊型肝包蟲(chóng)外囊壁及其表面附著的肝內(nèi)Glisson系統(tǒng)管道（右肝，四級(jí)）及周?chē)谓M織（HE×40）。圖3－Ⅰ 正常肝組織（HE×400）；圖3－Ⅱ 肝包蟲(chóng)外囊周?chē)母谓M織（HE×400）。（A－肝內(nèi)動(dòng)脈，B－肝內(nèi)膽管，C－肝包蟲(chóng)外囊，V－門(mén)靜脈）Fig.2－Ⅰ Hepatic blood vessels and bile ducts in the Glisson＇s system （right lobe of liver，4th stage）of normal hepatic tissue of human（HE，×40）Fig.2－Ⅱ Blood vessels and bile ducts in the Glisson＇s system（right lobe of liver，4th stage）hepatic tissue attached on the surface of ectocyst hepatic hydatid cyst of human（HE，×40）.Fig.3－Ⅰ Normal hepatic tissue（HE，×400）.Fig.3－Ⅱ Hepatic tissue attached on the surface of ectocyst（HE，×400）.（A－Intrahepatic Artery，B－Intrahepatic bile ducts，C－Ectocyst of hepatic hydatid cyst，V－Portal Vein）

2.3 Masson染色結(jié)果 Masson染色顯示：肌細(xì)胞呈紅色，膠原纖維呈藍(lán)色，細(xì)胞核呈藍(lán)黑色。鏡下觀察，對(duì)照組5例正常肝內(nèi)Glisson鞘內(nèi)以藍(lán)色為主，組織疏松，膠原纖維少，各種管道結(jié)構(gòu)層次清楚。動(dòng)脈管壁厚，其中膜可見(jiàn)大量紅染的平滑肌組織和少量藍(lán)染的膠原纖維。門(mén)靜脈壁藍(lán)染，可見(jiàn)少量紅染組織，即有大量的膠原纖維和少量的平滑肌組織。膽管壁以藍(lán)染為主，偶見(jiàn)紅染組織（圖4－Ⅰ）。實(shí)驗(yàn)組42例均可見(jiàn)肝包蟲(chóng)外囊表面附著的Glisson鞘內(nèi)呈藍(lán)染纖維組織較對(duì)照組明顯增多。動(dòng)脈管壁結(jié)構(gòu)層次不清，中膜藍(lán)染組織明顯增多，即平滑肌減少而膠原纖維明顯增多。門(mén)靜脈壁藍(lán)染，即含有大量的膠原纖維。膽管壁藍(lán)染，管壁變薄，未見(jiàn)紅染組織（圖4－Ⅱ）。

2.4 Actin免疫組化結(jié)果Actin在管道內(nèi)平滑肌組織呈陽(yáng)性表達(dá)。顯微鏡下觀察，對(duì)照組可見(jiàn)Glisson鞘內(nèi)肝動(dòng)脈、門(mén)靜脈、膽管壁內(nèi)Actin均有著色，呈陽(yáng)性表達(dá)（圖5－Ⅰ）。實(shí)驗(yàn)組可見(jiàn)肝包蟲(chóng)外囊表面附著的的Glisson鞘內(nèi)動(dòng)脈管壁著色明顯變淡；門(mén)靜脈壁著色變淡，呈弱陽(yáng)性表達(dá)；膽管壁著色亦明顯減少，呈弱陽(yáng)性或陰性表達(dá)（圖5－Ⅱ），Actin染色結(jié)果說(shuō)明實(shí)驗(yàn)組中各管道的平滑肌成分較對(duì)照組明顯減少。

2.5 VEGF免疫組化結(jié)果 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）主要在新生的小血管及小膽管上皮細(xì)胞內(nèi)呈陽(yáng)性表達(dá)。對(duì)照組：5例正常肝內(nèi)Glisson鞘內(nèi)偶有VEGF陽(yáng)性表達(dá)（圖6－Ⅰ），未見(jiàn)新生的小血管及小膽管。實(shí)驗(yàn)組：42例肝包蟲(chóng)外囊與肝組織間均可見(jiàn)大量新生之小血管及小膽管增生，其上皮細(xì)胞內(nèi)VEGF呈陽(yáng)性表達(dá)（圖6－Ⅱ）。

3 討 論

以往的包蟲(chóng)病引起肝內(nèi)管道病變的研究多局限于影像學(xué)范疇[3－5]，主要的原因是囊型肝包蟲(chóng)病傳統(tǒng)的手術(shù)方式是內(nèi)囊摘除術(shù)，這種術(shù)式很難獲得肝包蟲(chóng)周?chē)蝺?nèi)管道的臨床病理標(biāo)本，而無(wú)法對(duì)其進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。新的根治性手術(shù)——外膜內(nèi)外囊完整切除術(shù)的應(yīng)用，不但明顯提高了手術(shù)療效[6－7]，同時(shí)可以獲得包蟲(chóng)囊腫周?chē)∽兊母蝺?nèi)管道標(biāo)本，對(duì)其進(jìn)行病理學(xué)研究。

本課題組在肝包蟲(chóng)外膜內(nèi)外囊切除術(shù)中發(fā)現(xiàn)，肝包蟲(chóng)囊腫周?chē)鶪lisson系統(tǒng)內(nèi)的血管和膽管變形、移位，失去原有的解剖位置，和術(shù)前的影像學(xué)結(jié)果相符[4]。本研究進(jìn)一步觀察了囊腫周?chē)∽兊母蝺?nèi)管道的病理變化，發(fā)現(xiàn)肝包蟲(chóng)周?chē)蝺?nèi)管道失去原有的解剖位置，包繞貼敷于外囊。HE鏡下觀察見(jiàn)Glisson鞘變形，其內(nèi)肝動(dòng)脈、門(mén)靜脈及膽管關(guān)系紊亂，管腔變窄、變形。這些改變均提示：囊性肝包蟲(chóng)在膨脹性生長(zhǎng)過(guò)程中，長(zhǎng)期擠壓周?chē)蝺?nèi)管道，造成肝內(nèi)管道解剖位置、結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。

本課題組前期研究中提出：肝包蟲(chóng)外囊與肝實(shí)質(zhì)間還存在著一層新的膜樣纖維結(jié)構(gòu)—“外膜”，本研究進(jìn)一步證實(shí)了肝包蟲(chóng)外囊周?chē)∽兊腉lisson鞘及其內(nèi)的肝動(dòng)脈、門(mén)靜脈及膽管是“外膜”的重要組成部分。本實(shí)驗(yàn)Masson及Actin染色鏡下觀察結(jié)果顯示：肝包蟲(chóng)外膜內(nèi)Glisson鞘內(nèi)的纖維組織明顯增多；肝動(dòng)脈、門(mén)靜脈及膽管壁內(nèi)平滑肌成份明顯減少而膠原纖維成份明顯增多，管壁分層結(jié)構(gòu)基本消失，與周?chē)w維結(jié)構(gòu)分界不清，提示Glisson鞘及其內(nèi)管道結(jié)構(gòu)發(fā)生了纖維化。本課題組先前的研究結(jié)果表明TGF－β1和CTGF在肝包蟲(chóng)外囊與肝組織間的外膜層內(nèi)有高表達(dá)[8]，這些與纖維化密切相關(guān)的基因可能參與了Glisson鞘及其內(nèi)管道結(jié)構(gòu)的纖維化的過(guò)程。

圖4 －Ⅰ 正常右肝內(nèi)Glisson系統(tǒng)管道（四級(jí)）（Masson×100）；圖4－Ⅰ 右肝囊型肝包蟲(chóng)及其表面附著的肝內(nèi)Glisson系統(tǒng)管道（四級(jí)）（Masson×100）。圖5－Ⅰ 正常右肝內(nèi)Glisson系統(tǒng)管道（四級(jí)）Actin表達(dá)（免疫組化×100）；圖5－Ⅱ 右肝囊型肝包蟲(chóng)及其表面附著的肝內(nèi)Glisson系統(tǒng)管道（四級(jí)）Actin表達(dá)（免疫組化×100）。圖6－Ⅰ 正常右肝內(nèi)Glisson系統(tǒng)管道（四級(jí)）VEGF表達(dá)（免疫組化×400）；（A－肝內(nèi)動(dòng)脈，B－肝內(nèi)膽管，C－肝包蟲(chóng)外囊，V－門(mén)靜脈）圖6－Ⅱ 右肝囊型肝包蟲(chóng)與肝組織間VEGF表達(dá)，此圖中B為增生的膽管，V為增生的血管（免疫組化×400）Fig.4－Ⅱ Normal hepatic blood vessels and bile ducts in the Glisson＇s system （right lobe of liver，4th stage）of human（Masson stain，×100）Fig.4－Ⅱ Blood vessels and bile ducts in the Glisson＇s system（right lobe of liver，4th stage）attached on the surface of ectocyst hepatic hydatid cyst of human（Masson stain，×100）Fig.5－Ⅰ Expression of Actin in normal hepatic blood vessels and bile ducts in the Glisson＇s system （right lobe of liver，4th stage）of human（SP，×100）Fig.5－Ⅱ Expression of Actin in blood vessels and bile ducts in the Glisson＇s system （right lobe of liver，4th stage）attached on the surface of ectocyst hepatic hydatid cyst of human（SP，×100）Fig.6－Ⅰ Expression of VEGF in normal hepatic blood vessels and bile ducts in the Glisson＇s system （right lobe of liver，4th stage）of human（SP，×100）（A－Intrahepatic Artery，B－Intrahepatic bile ducts，C－Ectocyst of hepatic hydatid cyst，V－Portal Vein）Fig.6－Ⅱ Expression of VEGF between hepatic tissue and ectocyst hepatic hydatid cyst of human，B is proliferative bile ducts and V is proliferative blood vessel（SP，×100）

隨著肝包蟲(chóng)囊腫的生長(zhǎng)，其周?chē)母谓M織萎縮甚至消失。組織萎縮甚至消失的主要原因有兩方面，即細(xì)胞凋亡和壞死。前期研究結(jié)果表明，凋亡不是包蟲(chóng)周?chē)渭?xì)胞消失的主要原因[9]，包蟲(chóng)外囊鄰近的肝細(xì)胞發(fā)生變性壞死，因此，提示壞死可能是肝包蟲(chóng)周?chē)渭?xì)胞消失的主要方式。壞死是因病理因素而導(dǎo)致的被動(dòng)死亡，如物理性或化學(xué)性的損害因子及缺氧與營(yíng)養(yǎng)不良等均導(dǎo)致細(xì)胞壞死。本研究用VEGF染色鏡下觀察外膜內(nèi)肝內(nèi)管道周?chē)写罅啃律⊙芗靶∧懝茉錾?，間接說(shuō)明局部組織存在缺血缺氧現(xiàn)象。囊性肝包蟲(chóng)周?chē)蝺?nèi)管道解剖位置、組織結(jié)構(gòu)的改變及其纖維化等解剖病理性改變，會(huì)導(dǎo)致其功能發(fā)生改變，不能維持局部肝組織正常血供及營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，導(dǎo)致局部組織缺血缺氧，細(xì)胞因缺血缺氧營(yíng)養(yǎng)不良，而發(fā)生萎縮、壞死，并且細(xì)胞壞死又可進(jìn)一步加重周?chē)M織的纖維化。

綜上所述，囊性肝包蟲(chóng)在慢性膨脹性生長(zhǎng)過(guò)程中，對(duì)囊腫周?chē)蝺?nèi)管道長(zhǎng)期壓迫，肝內(nèi)管道移位變形并發(fā)生纖維化，其功能受到嚴(yán)重影響，導(dǎo)致局部組織缺血缺氧，而組織缺血缺氧是導(dǎo)致肝包蟲(chóng)囊腫周?chē)母谓M織萎縮、變性、壞死而消失的原因之一。

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