孫國慶，哈 福，苗永旺，李大林

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南省家畜改良工作站，云南 昆明 650225）

溶菌酶全稱為1，4－O－溶菌酶，又稱N－乙?；谒崴饷?，是一種堿性水解酶，存在于微生物和多種動、植物的組織及體液中。它可以裂解細菌細胞壁 N－乙酰胞壁酸和 N－乙酰葡糖胺之間的β－（1，4）－糖苷鍵，具有抗菌、抗腫瘤、抑制血管生成等活性。堿和氧化劑對其有抑制作用，食鹽則對其有活化作用。

奶牛乳房炎是奶牛業(yè)中危害大、可導(dǎo)致嚴重經(jīng)濟損失的常見疾病之一，目前此種疾病已成為奶牛養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的瓶頸。全世界約有2.2億多頭奶牛，其中10%～30%患有各種類型的乳房炎，中國奶牛乳房炎發(fā)病率普遍高于國外。近幾十年來，由于濫用抗生素，菌株耐藥性越來越強，傳統(tǒng)的乳房炎抗生素療法的弊端已日益明顯，由此乳房炎抗性基因的研究逐漸成為熱點，溶菌酶基因就是其中的重要候選基因之一。

1 溶菌酶的發(fā)現(xiàn)及分類

1921年，Alexander Fleming（1881～1955）發(fā)現(xiàn)了一種驚人的溶菌物質(zhì)，后來稱之為溶菌酶（lysozyme，LYZ）。由于當(dāng)時人們未發(fā)現(xiàn)其對許多人類致病菌并有殺菌作用，所以一開始并未被重視。90多年后的今天，溶菌酶不僅作為一種模式系統(tǒng)廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)化學(xué)、酶學(xué)、晶體學(xué)和分子生物學(xué)，而且其溶菌功能已為世人普遍接受并被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)和藥物制劑。溶菌酶生物學(xué)功能的很多方面還沒完全搞清楚，比如溶解肽聚糖所得的片段在細菌－宿主相互作用中發(fā)揮的作用、存在于同一宿主中的各種溶菌酶之間的生物學(xué)關(guān)聯(lián)性等［1］。

1937年，Abraham與Robinson從卵蛋白中最先分離出溶菌酶晶體，此后人們在人和動物的多種組織、分泌液及某些植物、微生物中也發(fā)現(xiàn)了溶菌酶的存在。1984年，Jolles等在蛋白質(zhì)水平上對不同來源的人溶菌酶（human LYZ，hLYZ）進行了研究，并率先發(fā)表了hLYZ氨基酸序列。1988年Castanon等從人組織細胞系（U－937）和胎盤文庫中篩選出hLYZ cDNA，并對其進行了系統(tǒng)的描述。同年，Yoshimura等用免疫學(xué)方法從胎盤λgt11文庫中篩選到hLYZ cDNA，并在酵母中表達成功。然后，Chung等和Huang等分別從人的巨噬細胞、帕內(nèi)特細胞和中國人胎盤中克隆出hLYZ cDNA［2］。2001年，Strausberg等直接向GenBank提交了從人結(jié)腸腺瘤中克隆的hLYZ cDNA。

溶菌酶按其來源與氨基酸序列的差異可分為6類：c型（chicken or conventional type，雞蛋清）溶菌酶，包括來自于胃的溶菌酶和結(jié)合鈣離子的溶菌酶；g型（goose－type，鵝）溶菌酶；細菌溶菌酶；i型（in－vertebrate type，無脊椎動物）溶菌酶；植物溶菌酶和噬菌體溶菌酶。目前，動物界中發(fā)現(xiàn)三類溶菌酶，即c型、g型和i型。i型溶菌酶是溶菌酶家族的一個較新的成員，最初在海星（Asterias rubens）中發(fā)現(xiàn)，近年來被廣泛研究。對各類溶菌酶的系統(tǒng)發(fā)育分析得出，c型溶菌酶主要存在于脊索動物門，節(jié)肢動物門的一些綱中也以c型溶菌酶為主，在一些脊索動物和雙殼貝類軟體動物（無脊椎動物）中發(fā)現(xiàn)了g型溶菌酶（至少是與其相關(guān)的基因）的存在。

一般來說，較高等的動物都有i型溶菌酶的產(chǎn)生。雞蛋清溶菌酶是唯一同時存在于脊椎動物、原索動物和無脊椎動物中的類型，也是目前研究得最廣泛、最透徹的類型。盡管這三類溶菌酶典型的一級結(jié)構(gòu)同源性并不高，但是它們的三級結(jié)構(gòu)卻有著驚人的相似。溶菌酶在抗菌防御方面的生物功能已普遍被人們所接受，此外，有些溶菌酶（不止在一類溶菌酶中）還可發(fā)揮消化酶的作用［1］。

牛LYZ基因主要在乳腺中表達，特別是在奶?；既榉垦椎臅r期，LYZ基因的表達量明顯增加，這可能是生物自身的一種防御機制。溶菌酶能夠水解微生物細胞壁的N－乙酰葡萄糖胺（NAG）和N－乙酰胞壁質(zhì)酸（NAM）間的β－1，4糖苷鍵，肽聚糖的空間結(jié)構(gòu)被破壞，細胞壁破裂。溶菌酶不但對革蘭氏陽性細菌具有直接的溶菌作用，而且還在相應(yīng)輔助因子（分泌型免疫球蛋白A和補體）的參與下，對革蘭氏陰性菌（如大腸桿菌）和真菌具有間接的溶解作用。另外，溶菌酶還能與各種誘發(fā)炎癥的酸性物質(zhì)結(jié)合使其滅活，并能夠增強抗菌素和其它藥物的療效，改善組織基質(zhì)的粘多糖代謝，從而達到消炎、修復(fù)組織的目的。

2 溶菌酶的基因結(jié)構(gòu)及其進化

1965年，Phillips等人用x射線晶體結(jié)構(gòu)分析法闡明了溶菌酶的三維結(jié)構(gòu)，確認溶菌酶分子近橢圓形，大小為4.5nm×3.0nm×3.0nm，α螺旋僅占25%，在分子的一些區(qū)域有伸展著的β片層結(jié)構(gòu)。溶菌酶內(nèi)部幾乎均為非極性，疏水作用在溶菌酶的折疊構(gòu)象中起到重要作用，分子表面有一個容納多糖底物的裂隙，是溶菌酶的活性部位。

不同物種LYZ基因都由4個外顯子和3個內(nèi)含子構(gòu)成。外顯子2編碼酶催化中心的殘基（Glu－35和Asp－52）；外顯子3編碼連接外顯子2區(qū)域的框架，確定底物位置，完善活性位點，提高催化效率；外顯子1和4編碼溶菌酶前體信號肽及N端和C端［3］。最先被測序的哺乳動物溶菌酶基因是人類溶菌酶基因，該基因位于人類第12條染色體上，總長5 856bp，內(nèi)含子和第4外顯子中都存在重復(fù)序列，與雞溶菌酶基因的主要差別集中在內(nèi)含子和3＇非編碼區(qū)［4］。牛的LYZ基因位于5號染色體，全長5 673bp，5′－UTR長度為31bp，3′－UTR長度為489 bp，由4個外顯子和3個內(nèi)含子組成，編碼區(qū)核苷酸序列全長為444bp，編碼148個氨基酸；四個外顯子對應(yīng)的編碼區(qū)大小分別為136bp、165bp、76bp和67bp［5］。1979年Baldacci等用分子克隆的方法獲得雞溶菌酶基因，全長約3.9kb，是其mRNA長度的6倍。在牛中最先發(fā)現(xiàn)了多基因編碼溶菌酶的現(xiàn)象，從此反芻動物溶菌酶及其基因作為一種重要的模式系統(tǒng)在DNA復(fù)制、基因重組、遺傳進化等研究領(lǐng)域被廣泛關(guān)注［6］。

C型溶菌酶可分為鈣結(jié)合溶菌酶和非鈣結(jié)合溶菌酶兩類。非鈣結(jié)合溶菌酶在一些鳥類和哺乳類中有發(fā)現(xiàn)，進化上與α乳清蛋白關(guān)系較近，兩者氨基酸序列相似性約有40%，都擁有保守的二硫鍵和一段相似的內(nèi)含子－外顯子結(jié)構(gòu)，它們的二級和三級結(jié)構(gòu)也都相同。但表達部位和功能差別顯著。

與廣泛存在于動物各種體液中的溶菌酶相比，α乳清蛋白只存在于哺乳動物的乳汁和初乳中。另外，α乳清蛋白也沒有催化活性，但是它能改變半乳糖轉(zhuǎn)移酶的特異性，其與半乳糖轉(zhuǎn)移酶的相互作用可以促進乳糖合成。有人認為，哺乳動物中溶菌酶和α乳清蛋白共存的進化因素是共同祖先基因的重復(fù)突變及隨后的遺傳分化［7］。一般來說，α乳清蛋白不具備溶菌酶的活性，溶菌酶也不參與乳糖的合成，但是已有人在針鼴乳中發(fā)現(xiàn)了一種蛋白，它同時具備了α乳清蛋白（很弱）和溶菌酶的特性［8］。這一發(fā)現(xiàn)有力地支持了溶菌酶和α乳清蛋白來自于同一祖先的假設(shè)。

溶菌酶在動物界普遍存在，不同溶菌酶也可同時發(fā)現(xiàn)于某一類物種中（例如，脊椎動物中的c型和g型溶菌酶，節(jié)肢動物中的c型和i型溶菌酶，軟體動物中的g型和i型溶菌酶），由此事實可自然聯(lián)想到三種溶菌酶的進化關(guān)系。不同類型的動物溶菌酶在結(jié)構(gòu)上的一致性也揭示它們有可能來自于同一前體，但是其氨基酸序列的巨大差異又使這一猜測充滿了不確定性［1］。

3 溶菌酶基因的多態(tài)性研究

陳仁金等利用PCR－SSCP技術(shù)對30個公牛家系的610頭中國荷斯坦牛LYZ基因進行多態(tài)性檢測，利用最小二乘均數(shù)法對LYZ基因的多態(tài)位點與體細胞評分（somatic cell score，SCS）和305d產(chǎn)奶量進行相關(guān)分析［9］。根據(jù)PCR產(chǎn)物的測序結(jié)果與GenBank公布的牛的LYZ基因（GenBank登錄號：NC－007303）序列比對表明，在LYZ基因的外顯子1的115位點發(fā)生T＞G的核苷酸替換，此替換使編碼蛋白質(zhì)的相應(yīng)氨基酸由Arg變?yōu)長eu；該位點經(jīng)PCR－SSCP法檢測發(fā)現(xiàn)了3種基因型TT、TG和GG。研究表明，115T＞G位點的GG基因型對中國荷斯坦牛的SCS和305d產(chǎn)奶量有較大的遺傳效應(yīng)，可作為分子標記用于奶牛乳房炎抗性的篩選［9］。Sahoo等通過對印度河流型水牛的研究發(fā)現(xiàn)，在LYZ基因外顯子3上存在多態(tài)位點，并闡明了其與LYZ活性和體細胞數(shù)（somatic cell count，SCC）的關(guān)聯(lián)性［10］。孫懷昌等人研究結(jié)果表明，表達人溶菌酶基因的重組質(zhì)粒對奶牛乳房炎具有可靠、持久的治療效果，可以代替抗菌素使用［11］。

陳仁金等對牛亞科6個群體溶菌酶基因的編碼區(qū)核苷酸序列進行PCR擴增和測序，結(jié)合GenBank上海福特牛該基因（GenBank登錄號：NC＿007303）編碼區(qū)核苷酸序列進行了遺傳和進化分析。結(jié)果表明，在檢測的樣本中（水牛除外），有5個核苷酸多態(tài)位點，定義了9種單倍型；群內(nèi)核苷酸多樣性（Pi）在0.00000～0.00196之間，揭示群體內(nèi)遺傳多樣性較低。構(gòu)建的分子系統(tǒng)發(fā)育樹表明，瘤牛、蒙古牛和魯西黃牛間關(guān)系密切，瘤牛和普通牛與牦牛關(guān)系相對較近，而與大額牛關(guān)系相對較遠，為牛亞科的系統(tǒng)進化研究提供了一定理論基礎(chǔ)［12］。李銳等用PCR的方法擴增并測定了大額牛LYZ基因的編碼區(qū)核苷酸序列（444bp），其中 AT含量（53.95%）明顯高于GC含量（46.05%），并與GenBank上8個物種相應(yīng)基因編碼區(qū)核苷酸序列進行比對分析和系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)大額牛與普通牛（核苷酸序列一致性為99.3%）首先聚為一類，再與其他物種（與人、豬、家鼠、溝鼠、猊猴、雞和斑馬魚核苷酸序列一致性為76.6%、79.4%、81.8%、71.3%、68.2%、58.9% 和50.5%）聚為一類。該系統(tǒng)聚類結(jié)果與動物學(xué)分類基本一致，亦與攀寶良利用乳蛋白基因構(gòu)建反芻動物種系發(fā)生樹結(jié)果［13］基本一致，表明LYZ基因適合構(gòu)建不同物種間系統(tǒng)進化樹［14］。

侯其瑞等對京海黃雞的LYZ基因的SNPs與生長、產(chǎn)蛋性能和體重的關(guān)聯(lián)分析得出，LYZ基因可能是控制京海黃雞生長發(fā)育的主基因或與主基因緊密連鎖，暗示在選種、育種過程中，可將雞LYZ基因作為京海黃雞體重候選基因應(yīng)用于遺傳標記輔助選擇［15－16］。許罕華等在編碼細菌氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶的融合基因序列中插入雞LYZ基因3＇端核基質(zhì)附著區(qū)（MAR）表達試驗結(jié)果表明，雞LYZ基因3＇端MAR在同源細胞系對基因表達沒有激活作用，與該基因5＇端MAR在同源或異源細胞系中能激活基因表達形成鮮明對照，表明5＇端MAR和3＇端 MAR在調(diào)節(jié)雞LYZ基因表達上存在一種協(xié)調(diào)關(guān)系。人溶菌酶突變可導(dǎo)致遺傳性非神經(jīng)系統(tǒng)淀粉樣病變癥（h ereditary systemic amylo idosis），由溶菌酶氨基酸序列中Phe57Ile、Trp64Arg、Ile56Thr和 Asp67His改變引起［17－18］，該病患者組織中有大量的淀粉樣物質(zhì)沉淀，臨床表現(xiàn)伴隨腎臟、心臟和肝臟的病變。

4 溶菌酶及其基因的應(yīng)用前景

溶菌酶具有多種藥理作用，現(xiàn)在已經(jīng)廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)臨床。作為一種存在于人體正常體液及組織中的非特異性免疫因素，具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤的功效。溶菌酶具有破壞細菌細胞壁結(jié)構(gòu)的功能，用溶菌酶處理G＋細菌可以在破壞細胞壁后得到原生質(zhì)體，所以被廣泛用于生物技術(shù)中，成為基因工程、細胞工程中細胞融合操作必不可少的工具酶。溶菌酶作為一種非特異性免疫因子，對腸道中腐敗性微生物有特殊殺滅作用，溶菌酶是雙歧桿菌增長因子，有防止腸炎和變態(tài)反應(yīng)的作用，對嬰、幼兒的腸道菌群有平衡作用。有試驗表明，在低度酒中每公斤添加20mg的溶菌酶替代水楊酸作防腐劑，對酒的風(fēng)味無不良影響，且受酒類澄清劑的影響很小，并可以去除水楊酸的毒性，是低度酒類較好的防腐劑。日本成功把溶菌酶用于清酒的防腐劑。最近的研究表明，水牛奶中的溶菌酶與歐洲牛（bovine）的有56.5%同源性，與馬的有30.4%同源性。水牛溶菌酶的特異活性是普通牛的10倍，并且具有更加廣的pH耐受范圍。該酶主要對革蘭氏陽性菌有效。據(jù)奶水牛產(chǎn)地當(dāng)?shù)厝朔Q，食用水牛奶不易生病，具有良好的增強免疫力功效。

雖然溶菌酶廣泛存在于動植物體內(nèi)，但天然含量少，提取純化過程步驟繁瑣，產(chǎn)量低，無法大量獲取，若采用化學(xué)合成方法成本昂貴，大多數(shù)普通患者無法承受。與此相比，若采用基因工程的方法來合成溶菌酶，它具有操作簡單，成本比較廉價，能大量獲取，重復(fù)性好，有廣闊的市場應(yīng)用前景。牛乳溶菌酶作為c型溶菌酶中的一種，在治療奶牛子宮內(nèi)膜炎、乳房炎等細菌性疾病中不僅具有相似的生物學(xué)作用，還具有同源性的優(yōu)勢。付世新等通過畢赤酵母GS115分泌表達系統(tǒng)獲得了重組牛乳溶菌酶，為溶菌酶的規(guī)模化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)［19］。

對LYZ基因的研究多集中在轉(zhuǎn)基因和疾病防治上，而對牛的LYZ基因其在機體中的生物功能和作用途徑還有很多尚待探索的地方。而目前對牛的LYZ基因多態(tài)性與奶牛乳房炎關(guān)聯(lián)分析的研究較少。劉梅等認為未來的研究重點已經(jīng)不是溶菌酶的殺菌作用，而是其消化功能和其他未知的生物學(xué)功能［20］。研究發(fā)現(xiàn)，反芻動物的皺胃、食葉鳥的嗉囊、文昌魚腸和一些昆蟲（如果蠅、工蟻、臭蟲和蚊子等）消化道的不同部位以及唾液腺中，溶菌酶c的含量豐富，推測可能與溶菌酶c的消化功能相適應(yīng)［20］。Lee－Huang等研究發(fā)現(xiàn)，人溶菌酶作為人絨毛膜促性腺激素的組分之一，其107～115位的9個氨基酸（RAWVAWRNR）能有效抑制HIV病毒的復(fù)制，并能調(diào)節(jié)HIV感染細胞的基因表達，具有抗HIV病毒的作用［21］。此外，在工業(yè)上，溶菌酶可以作為食品的保鮮劑或添加劑。例如，在嬰兒食品中添加溶菌酶可以使其更接近人乳的成分。同時，溶菌酶能夠增強抗生素的作用效力，增加機體的抗感染能力。隨著溶菌酶功能的不斷發(fā)現(xiàn)，在未來的工業(yè)、醫(yī)學(xué)和其他領(lǐng)域中，溶菌酶必將具有重要的應(yīng)用價值。已有人嘗試利用LYZ基因來研究生物的進化，并得到與傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法、生化方法等基本一致的結(jié)果，表明LYZ基因可能對生物進化研究有幫助。

［1］ Callewaert L，Michiels C W.Lysozymes in the animal kingdom［J］.Biosci，2010，35（1）：127－160.

［2］ Chung L P，Keshav S，Gordon S.Cloning the human lysozyme cDNA：inverted Alu repeat in the mRNA and in situ hybridization for macrophages and Paneth cells［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1988，85（17）：6227－6231.

［3］ Jolles P，Jolles J.What＇s new in lysozyme research？Always a model system，today as yesterday［J］.Mol Cell Biochem，1984，63（2）：165－189.

［4］ Peters C W，Cruse U，Pollwein R，et al.The human lysozyme gene.Sequence organization and chromosomal localization［J］.Eur J Biochem，1989，182（3）：507－516.

［5］ Elsik C G，Tellam R L，Worley K C，et al.The genome sequence of taurine cattle：a window to ruminant biology and evolution［J］.Science，2009，324（5926）：522－528.

［6］ Dobson D E，Prager E M，Wilson A C.Stomach lysozymes of ruminants.I.Distribution and catalytic properties［J］.Biol Chem，1984，259（18）：11607－11616.

［7］ Qasba P K，Kumar S.Molecular divergence of lysozymes and alpha－lactalbumin［J］.Crit Rev Biochem Mol Biol，1997，32（4）：255－306.

［8］ Hopper K E，McKenzie H A.Comparative studies of alpha－lactalbumin and lysozyme：Echidna lysozyme［J］.Mol Cell Biochem，1974，3（2）：93－108.

［9］ 陳仁金，楊章平，毛永江，等.中國荷斯坦牛LYZ基因多態(tài)性及其與乳房炎的關(guān)聯(lián)分析［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，43（23）：4936－4941.

［10］ Sahoo N R，Kumar P.PCR－SSCP of Serum Lysozyme Gene（Exon－III）in Riverine Buffalo and Its Association with Lysozyme Activity and Somatic Cell Count［J］.Asian－Australian Journal of Animal Sciences，2010，8（23）：993－999.

［11］ 孫懷昌，于 鋒，蘇建華，等.人溶菌酶基因治療奶牛乳腺炎的初步研究［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2004，35（2）：227－232.

［12］ 陳仁金，楊章平，毛永江，等.牛亞科6個群體LYZ基因序列分析及系統(tǒng)進化研究［J］.揚州大學(xué)學(xué)報（農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版），2009，30（2）：30－33.

［13］ 樊寶良，李 寧，吳常信.依據(jù)乳蛋白基因序列構(gòu)建反芻動物種系發(fā)生樹的研究［J］.遺傳學(xué)報，2000，27（6）：485－497.

［14］ 李 銳，陳仁金，楊章平，等.大額牛溶菌酶（LYZ）基因序列測定和進化分析［J］.中國牛業(yè)科學(xué)，2009，35（6）：1－6.

［15］ 侯啟瑞，王金玉，王慧華，等.京海黃雞LYZ基因SNPs檢測及其與生長、產(chǎn)蛋性能的聯(lián)系［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2010，41（5）：524－530.

［16］ 侯啟瑞，王金玉，王慧華，等.京海黃雞LYZ基因外顯子的遺傳多態(tài)性及其與體重的關(guān)聯(lián)分析［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2010，37（7）：124－128.

［17］ Valleix S，Drunat S，Philit J B，et al.Hereditary renal amyloidosis caused by a new variant lysozyme W64Rin a French family［J］.Kidney Int，2002，61（3）：907－912.

［18］ Yazaki M，F(xiàn)arrell S A，Benson M D.A novel lysozyme mutation Phe57Ile associated with hereditary renal amyloidosis［J］.Kidney Int，2003，63（5）：1652－1657.

［19］ 付世新，齊長學(xué)，羅春海，等.牛乳溶菌酶在畢赤酵母中的分泌表達及活性分析［J］.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2010，32（6）：428－431，454.

［20］ 劉 梅，張士璀.溶菌酶C及其生物學(xué)功能［J］.生命的化學(xué)，2006，26（5）：465－467.

［21］ Lee－Huang S，Maiorov V，Huang P L，et al.Structural and functional modeling of human lysozyme reveals a unique nonapeptide，HL9，with anti－HIV activity［J］.Biochemistry，2005，44（12）：4648－55.