劉紅，劉賓，李瑞娟，楊萌萌，李鵬聰，張?chǎng)?，孫旭東，楊鐵生

細(xì)胞角蛋白（cytokeratin，CYK）是形成上皮細(xì)胞骨架的主要結(jié)構(gòu)蛋白，具有保持上皮細(xì)胞完整性的作用[1]。根據(jù)等電點(diǎn)和分子量不同，CYK 可以分為 I 型和 II 型，I 型 CYK 屬于酸性蛋白，包括 CYK-9 ～ CYK-23，II 型 CYK 屬于堿性蛋白，包括 CYK-1 ～ CYK-8[2]。I 型 CYK 中的 CYK-19廣泛分布在正常組織表面的層狀或鱗狀上皮細(xì)胞，分子量約為 40 kD[3]。

CYFRA21-1 是 CYK-19 被半胱天冬酶 3 裂解后，從細(xì)胞中釋放出來(lái)時(shí)形成的可溶性片段[4]，在非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）、頭頸鱗細(xì)胞癌、口腔鱗狀上皮細(xì)胞癌等鱗細(xì)胞癌中，或者乳腺癌、肝癌、肺癌和胰腺內(nèi)分泌腫瘤等轉(zhuǎn)移癌類中都會(huì)高表達(dá)[5-9]，具有很好的血清診斷學(xué)價(jià)值，已被作為腫瘤細(xì)胞在血液和骨髓中循環(huán)的標(biāo)志物，同時(shí)也是預(yù)后診斷的重要標(biāo)志物[10-11]。目前，臨床上應(yīng)用的人血清 CYFRA21-1 免疫檢測(cè)試劑盒中的抗體主要為進(jìn)口產(chǎn)品，而具有高結(jié)合能力的特異抗體的制備是免疫檢測(cè)方法成功建立的關(guān)鍵[12]，也是影響檢測(cè)成本的重要因素。因此，CYFRA21-1特異 mAb 單克隆抗體的制備，對(duì)免疫檢測(cè)方法的建立和檢測(cè)成本的控制具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血清樣本 血清樣本共計(jì) 134 份，其中男性 74 份，女性 60 份，年齡在 20 ～ 92 歲，全部為本院門診及住院患者樣本。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6 周齡，雌性 BALB/c 小鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.1.3 主要試劑和儀器 CYFRA21-1 化學(xué)發(fā)光法定量檢測(cè)試劑盒為北京源德生物醫(yī)學(xué)工程有限公司產(chǎn)品；CYFRA21-1 重組蛋白購(gòu)于德國(guó) Progen公司；堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗鼠和辣根過氧物酶標(biāo)記的山羊抗鼠 IgG 購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司；BCIP/NBT 底物顯色試劑盒、可溶性單組分 TMB 顯色試劑盒購(gòu)于北京天根生物技術(shù)有限公司；蛋白預(yù)染和普通 Marker 均購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺購(gòu)于 Genview 公司（北京）；0.45 μm PVDF 膜購(gòu)于北京華美轉(zhuǎn)導(dǎo)科技有限公司；完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑、抗 Ig 亞型分析試劑盒（ISO1 型）購(gòu)自 Sigma 公司；HAT、100 × HT、PEG 4000、RPMI-1640、IMDM 購(gòu)于美國(guó) Gibco 公司；HItrap Protein G 購(gòu)自美國(guó) Parmacia Biotech 公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；小鼠骨髓瘤細(xì)胞（SP2/0）為本實(shí)驗(yàn)室保存。

MPC-1 型微孔單光子計(jì)數(shù)儀為北京源德生物醫(yī)學(xué)工程有限公司產(chǎn)品；蛋白電泳儀、半干轉(zhuǎn)膜儀、680 型酶標(biāo)儀為美國(guó) Bio-Rad 產(chǎn)品；5417R 型高速冷凍離心機(jī)為德國(guó) Eppendorf 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 間接 ELISA CYFRA21-1 蛋白溶于0.05 mol/L pH 9.6 的 Na2CO3包被液，終濃度5 μg/ml，100 μl/孔包被微孔板，4 ℃ 過夜；棄去包被液，每孔加入含有 1% 酪蛋白的 0.02 mol/L 的PBS（pH 7.4）封閉液 300 μl，2 ～ 8 ℃ 封閉 12 ～18 h；棄去封閉液，用 0.02 mol/L PBST 洗板 3 次，拍干，常溫抽干 12 ～ 18 h 后，置于密封袋中，2 ～8 ℃ 保存；直接或者用 PBST 將待測(cè)樣品（血清、腹水或者細(xì)胞上清）稀釋后，每孔 100 μl，37 ℃ 溫育 1.5 h，PBST 洗板 5 次，拍干；用 PBST 將 HRP標(biāo)記的山羊抗屬 IgG 按 1:5000 倍稀釋，100 μl/孔，37 ℃ 溫育 1 h，PBST 洗板 5 次，拍干；TMB 顯色，20 min 后，用 2 mol/L 的硫酸 50 μl/孔終止顯色反應(yīng)，450 nm 下測(cè)定各孔 OD 值。1.2.2 抗體制備

1.2.2.1 小鼠免疫 8 只 BLAB/c 小鼠，進(jìn)行尾部采血，收集血清分別用間接 ELISA 測(cè)定小鼠血清的免疫前效價(jià)；將 CYFRA21-1 用等體積的弗氏完全佐劑混勻充分乳化，50 μg/只，背部皮下多點(diǎn)注射小鼠，進(jìn)行初免；每間隔 3 周進(jìn)行 1 次加強(qiáng)免疫，共計(jì) 2 次，每次 CYFRA21-1 都與等體積弗氏不完全佐劑混勻乳化，免疫量為 25 μg/只，免疫方法為背部皮下多點(diǎn)注射；間隔 10 d 后，對(duì) 8 只小鼠分別進(jìn)行尾部采血，收集血清，通過間接ELISA 測(cè)定免疫后小鼠血清效價(jià)。

1.2.2.2 細(xì)胞融合 選取 3 次免疫后血清效價(jià)最高的小鼠，將 CYFRA21-1 溶于 PBS，按50 μg/只進(jìn)行脾臟終加強(qiáng)免疫；3 d 后脫頸殺死加強(qiáng)免疫的小鼠，無(wú)菌取脾，收集脾淋巴細(xì)胞，與 SP2/0細(xì)胞在 PEG 4000 作用下進(jìn)行融合；用含 1% HAT的完全 RPMI-1640 培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)篩選，于融合后的第 3、6 天進(jìn)行換液處理；融合后第 7 ～ 14 天改用 HT 培養(yǎng)液，第 14 天后采用完全培養(yǎng)液；融合后第 8 天采用有限稀釋法對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行連續(xù)篩選，待細(xì)胞集落生長(zhǎng)至孔底 1/3 時(shí)，吸取上清用間接 ELISA 方法篩選，陽(yáng)性克隆率達(dá)到 100%時(shí)，正式建株；用 ISO1 鼠 mAb 亞類檢測(cè)試劑盒，按照說明書，檢測(cè)制備雜交瘤細(xì)胞分泌抗體的亞型；對(duì)陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，并液氮冷凍保存。

1.2.2.3 腹水 mAb 的制備及純化 6 周齡雌性BALB/c 小鼠，每只腹腔注射 0.5 ml 滅菌石蠟油，每株抗體準(zhǔn)備 2 只小鼠；7 d 后取生長(zhǎng)良好雜交瘤細(xì)胞重懸于無(wú)血清培養(yǎng)基中，每只小鼠腹腔接種1 × 106個(gè)細(xì)胞；7 ～ 14 d 后，小鼠腹腔明顯增大時(shí)，采集腹水；采用飽和硫酸銨法，利用 protein G 親和柱，純化效價(jià)較高的腹水；0.02 mol/L 的 PBS（pH 7.4）對(duì)洗脫液進(jìn)行透析，將純化好的抗體保存在PBS 中，SDS-PAGE 檢測(cè) mAb 純度；Bradford 法測(cè)定 mAb 濃度。

1.2.3 mAb 的特性鑒定

1.2.3.1 mAb 效價(jià)測(cè)定 用已建立間接 ELISA方法測(cè)定制備的 mAb 效價(jià)。

1.2.3.2 Western blot 將 CYFRA21-1 重組蛋白溶于 0.02 mol/L 的 PBS（pH 7.4）中，制備 12% 的濃縮膠和 5% 分離膠，按 15 μg/孔上樣，進(jìn)行SDS-PAGE；分離濃縮膠和分離膠，15 V 電壓下，電轉(zhuǎn) 40 min，將分離膠上蛋白轉(zhuǎn)移到 PVDF 膜；PVDF 膜浸泡在含 0.1% Tween-20 和 5% BSA 的20 mmol/L TBS 緩沖液（pH 7.4）中，4 ℃ 封閉過夜；用含 0.1% Tween-20 的 TBS 緩沖液（pH 7.4）洗膜，每次 10 min，共 4 次；用含 1% BSA 和0.1% Tween-20 的 TBS 緩沖液將純化好的 mAb分別稀釋 10 000 倍，室溫浸泡 PVDF 膜 2 h 后，重復(fù)洗膜過程；用含 1% BSA 的 TBS-T 緩沖液將堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗鼠稀釋 5000 倍作為二抗，室溫浸泡 PVDF 膜 2 h 后，重復(fù)洗膜過程；加入顯色底物，顯色 5 min 后，用蒸餾水終止反應(yīng)。

1.2.3.3 競(jìng)爭(zhēng) ELISA CYFRA21-1 蛋白溶于0.05 mol/L pH 9.6 的 Na2CO3包被液，終濃度50 μg/ml，100 μl/孔包被微孔板，4 ℃ 過夜；棄去包被液，每孔加入含有 1% 酪蛋白的 0.02 mol/L的 PBS（pH 7.4）封閉液 300 μl，2 ～ 8 ℃ 封閉 12 ～18 h；棄去封閉液，用 0.02 mol/L PBST 洗板 3 次，拍干，常溫抽干 12 ～ 18 h 后，置于密封袋中，2 ～8 ℃ 保存；用 PBST 將待制備的 CYFRA21-1 單抗稀釋至終濃度 3 μg/ml，取 50 μl 待測(cè)校準(zhǔn)品或血清樣品與 50 μl 稀釋好的 mAb 共同加入 96 孔板，充分混勻，37 ℃ 溫育 0.5 h，PBST 洗板 5 次，拍干；用 PBST 將 HRP 標(biāo)記的山羊抗鼠 IgG 按1:5000 倍稀釋，100 μl/孔，37 ℃ 溫育 1 h，PBST洗板 5 次，拍干；TMB 顯色，20 min 后，用 2 mol/L的硫酸 5 μl/孔終止顯色反應(yīng)，450 nm 下測(cè)定各孔OD 值，計(jì)算樣品濃度值。

1.2.3.4 人血清 CYFRA21-1 檢測(cè) 嚴(yán)格按照北京源德生物醫(yī)學(xué)工程有限公司的 CYFRA21-1 化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒操作說明書進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 小鼠血清效價(jià)

如圖 1 所示，將經(jīng)過 3 次免疫之后，8 只小鼠血清效價(jià)都有了明顯提高；以 P/N（陽(yáng)性孔吸光值/陰性對(duì)照孔吸光值）≥ 2.1 為判斷是否具有免疫活性的標(biāo)準(zhǔn)，1 號(hào)小鼠血清稀釋 64 × 103倍，2 號(hào)小鼠血清稀釋 128 × 103倍，3 號(hào)稀釋 16 × 103倍，4、5 和 6 號(hào)血清稀釋 512 × 103倍，7 和 8 號(hào)稀釋 256 × 103倍后仍具有免疫活性；其中，4 號(hào)小鼠在 3 只血清免疫活性最高的小鼠中，在相同稀釋倍數(shù)下，其 OD450吸光值最高，因此選取 4 號(hào)小鼠進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞建株。

2.2 雜交瘤細(xì)胞株的建立

將雜交瘤細(xì)胞株上清從 1:2000 開始進(jìn)行倍比稀釋，用間接 ELISA 方法檢測(cè)，以 P/N（陽(yáng)性孔吸光值/陰性對(duì)照孔吸光值）≥ 2.1 為判斷是否為陽(yáng)性細(xì)胞株的判斷標(biāo)準(zhǔn)，共有 5 株雜交瘤細(xì)胞能持續(xù)穩(wěn)定分泌 CYFRA21-1 的 mAb，其中 3F1、2G8、12G7 和 4H12 上清稀釋 2048 × 103倍，1D10 上清稀釋 1024 × 103倍后，都仍具有免疫活性（表 1）。經(jīng)抗體亞型檢測(cè)試劑盒檢測(cè)，上清效價(jià)較高的 3F1、2G8、12G7 和 4H12 4 株雜交瘤細(xì)胞中，2G8、12G7 兩株細(xì)胞系分泌抗體都為IgG1，輕鏈都為 κ，將這兩株細(xì)胞分泌抗體分別命名為 2G8 和 12G7。

2.3 mAb 純化和效價(jià)

圖 1 小鼠血清效價(jià)Figure 1 The titers of mice sera

表 1 陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞Table 1 The positive hybridoma cell

圖 2 mAb 純化Figure 2 Purification of mAb

如圖 2 所示，SDS-PAGE 檢測(cè)純化后的 2G8和 12G7 兩株抗體純度都高于 95%，重鏈分子量約為 50 kD，輕鏈分子量約為 27 kD，符合理論分子量；經(jīng) Bradford 法檢測(cè)，2G8 濃度為 1.2 mg/ml，12G7 濃度為 2.0 mg/ml。

用建立的間接 ELISA 方法檢測(cè)，以 P/N（陽(yáng)性孔吸光值/陰性對(duì)照孔吸光值）≥ 2.1 為判斷陽(yáng)性的標(biāo)準(zhǔn)，2G8 在稀釋 1024 × 103倍時(shí)仍具有免疫活性，12G7 在稀釋 2048 × 103倍時(shí)仍具有免疫活性，效價(jià)分別為 1 × 10-6和 5 × 10-7（圖 3）。

2.4 mAb 特異性

Western blot 結(jié)果表明（圖 4），2G8 和 12G7都能準(zhǔn)確識(shí)別 CYFRA21-1 蛋白，產(chǎn)生一條分子量稍大于 30 kD 的條帶，符合理論分子量大小。

圖 4 Western blot分析結(jié)果Figure 4 Analysis result of western blot

人絨毛促性腺激素（human chorionic gonadotropin，HCG）、人促卵泡激素（follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）和人促黃體生成素（luteotropic hormone，LH）是存在于血清中的CYFRA21-1 主要類似物，用含有 1% 酪蛋白、5‰Proclin-300 的 0.01 mol/L PBS（pH 7.4）作為稀釋液，經(jīng)競(jìng)爭(zhēng) ELISA 檢測(cè)顯示，2G8 和 12G7 與這3 種類似物交叉反應(yīng)率最高只有 0.77%（表 2），表明 2G8 和 12G7 具有很高的特異性，能特異識(shí)別 CYFRA21-1，而不會(huì)與血清中其他類似物產(chǎn)生明顯交叉反應(yīng)。

2.5 人血清 CYFRA21-1 檢測(cè)

圖 3 2G8 和 12G7 效價(jià)Figure 3 The titers of 2G8 and 12G7

表 2 與類似物的交叉反應(yīng)率Table 2 Cross reactivity (CR) with analogues

圖 5 相關(guān)性分析Figure 5 The correlation analysis

用利用 2G8 和 12G7 建立的競(jìng)爭(zhēng) ELISA 檢測(cè)方法，對(duì)來(lái)自本院的 134 份血清樣本進(jìn)行檢測(cè)，將其結(jié)果與北京源德生物醫(yī)學(xué)工程有限公司的CLIA 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果分別比較發(fā)現(xiàn)，檢測(cè)結(jié)果之間沒有顯著差異（F = 0.0908 ＜ F臨界值= 3.0183，P = 0.9132 ＞ 0.05），線性關(guān)系分別為 y = 0.8167 x +0.3755（r = 0.9772）（圖 5A）和 y = 0.8142 x +0.3655（r = 0.9770)（圖 5B）。

3 討論

癌癥已經(jīng)成為危害人類健康的首要疾病之一，但如果能準(zhǔn)確診斷，并在預(yù)后對(duì)病情發(fā)展進(jìn)行有效監(jiān)控，能顯著改善患者的生活質(zhì)量，并延長(zhǎng)患者壽命。CYFRA21-1 是 CYK-19 的可溶性片段，存在于肺癌、食管癌等上皮細(xì)胞起源的腫瘤細(xì)胞中，能被釋放進(jìn)入血液，是 NSCLC 的最敏感腫瘤標(biāo)志物，并且與癌變程度有關(guān)，已被作為多種腫瘤診斷和預(yù)后監(jiān)測(cè)標(biāo)志物[10]。目前，CYFR21-1 的臨床檢測(cè)方法基本都是基于免疫檢測(cè)平臺(tái)，因此其特異mAb 的制備具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

1992 年，Pujol 等[4]就采用雜交瘤技術(shù)，制備出 BM19.21 和 KS19.1 兩株 mAb，并被配對(duì)使用建立了 CYFRA21-1 的免疫測(cè)定方法，能夠特異識(shí)別血清中的 CYFRA21-1。至今，臨床上已有多種細(xì)胞角蛋白的特異 mAb 被應(yīng)用到細(xì)胞角蛋白可溶性片段的免疫檢測(cè)上[13]。國(guó)內(nèi)有多種CYFRA21-1 免疫檢測(cè)試劑盒被商品化，但所用抗體都為國(guó)外進(jìn)口產(chǎn)品，增加了試劑盒成本。本研究通過雜交瘤技術(shù)，制備出了 2G8 和 12G7 兩株CYFRA2 的 mAb，都屬于輕鏈為 κ 的 IgG1，效價(jià)分別為 1 × 10-6和 5 × 10-7，能從血清樣本中特異識(shí)別 CYFRA21-1，并且經(jīng) protein G 純化后，純度都高于 95%，濃度也分別達(dá)到 1.2 mg/ml 和2.0 mg/ml，利用這兩種 mAb 通過競(jìng)爭(zhēng) ELISA 對(duì)134 份血清樣本的檢測(cè)結(jié)果與北京源德生物醫(yī)學(xué)工程有限公司的 CYFRA21-1 化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)結(jié)果有很好的相關(guān)性，表明這兩種mAb 能代替進(jìn)口 CYFRA21-1，用于 CYFRA21-1免疫診斷試劑盒完全國(guó)產(chǎn)化，及其生物學(xué)特性的深入研究。

[1] Alix-Panabières C, Vendrell JP, Slijper M, et al. Full-length cytokeratin-19 is released by human tumor cells: a potential role in metastatic progression of breast cancer. Breast Cancer Res, 2009,11(3):R39.

[2] Coulombe PA, Omary MB. 'Hard' and 'soft' principles defining the structure, function and regulation of keratin intermediate filaments.Curr Opin Cell Biol, 2002, 14(1):110-122.

[3] Yamamoto K, Oka M, Hayashi H, et al. CYFRA 21-1 is a useful marker for esophageal squamous cell carcinoma. Cancer, 1997, 79(9):1647-1655.

[4] Pujol JL, Grenier J, Daures JP, et al. Serum fragment of cytokeratin subunit 19 measured by CYFRA 21-1 immunoradiometric assay as a marker of lung cancer. Cancer Res, 1993, 53(1):61-66.

[5] Wang J, Zhang N, Li B, et al. Decline of serum CYFRA21-1 during chemoradiotherapy of NSCLC: a probable predictive factor for tumor response. Tumour Biol, 2011, 32(4):689-695.

[6] Tjensvoll K, Oltedal S, Farmen RK, et al. Disseminated tumor cells in bone marrow assessed by TWIST1, cytokeratin 19, and mammaglobin A mRNA predict clinical outcome in operable breast cancer patients.Clin Breast Cancer, 2010, 10(5):378-384.

[7] Bambang IF, Lu D, Li H, et al. Cytokeratin 19 regulates endoplasmic reticulum stress and inhibits ERp29 expression via p38 MAPK/XBP-1 signaling in breast cancer cells. Exp Cell Res, 2009, 315(11):1964-1974.

[8] Flores-Fernández JM, Herrera-López EJ, Sánchez-Llamas F, et al.Development of an optimized multi-biomarker panel for the detection of lung cancer based on principal component analysis and artificial neural network modeling. Expert Syst Appl, 2012, 39(12):10851- 10856.

[9] Chung GE, Lee JH, Yoon JH, et al. Prognostic implications of tumor vascularity and its relationship to cytokeratin 19 expression in patients with hepatocellular carcinoma. Abdom Imaging, 2012, 37(3):439-446.[10] Patel JL, Erickson JA, Roberts WL, et al. Performance characteristics of an automated assay for the quantitation of CYFRA 21-1 in human serum. Clin Biochem, 2010, 43(18):1449-1452.

[11] Vilardell F, Novell A, Martin J, et al. Importance of assessing CK19 immunostaining in core biopsies in patients subjected to sentinel node study by OSNA. Virchows Arch, 2012, 460(6):569-575.

[12] Singh MK, Srivastava S, Raghava G, et al. HaptenDB: a comprehensive database of haptens, carrier proteins and anti-hapten antibodies. Bioinformatics, 2006, 22(2):253-255.

[13] Rakha EA, El-Sayed ME, Green AR, et al. Prognostic markers in triple-negative breast cancer. Cancer, 2007, 109(1):25-32.