安 濤，何 賀，郭?；?，王洪星

（青海大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，青海 西寧 810001）

四味藏木香軟膠囊由藏木香、懸鉤木、寬筋藤、干姜四味藥組成，主要功能是治培根型木布病和促使瘟病初期的疫熱成型、虛熱癥、血痛病及涎痰病，呼吸不暢，食欲不振，兩肋刺疼，混合傳染病。研究表明，土木香內(nèi)酯（C15H20O2）是藏木香的主要活性成分之一。Caco－2細(xì)胞系源于人的結(jié)腸癌，其體外作用過程與藥物在小腸的吸收具有相關(guān)性，因此，廣泛應(yīng)用于揭示小腸上皮吸收的限速因素，評價藥物的吸收性。本實(shí)驗試圖通過對四味藏木香軟膠囊中藥物有效成分經(jīng)腸吸收動力學(xué)方法研究，以彌補(bǔ)市場上只有此藥湯散劑的不足，進(jìn)一步提高藏藥的療效，擴(kuò)大使用范圍，減少使用劑量，方便給藥，為改進(jìn)傳統(tǒng)藏藥劑型提供一定依據(jù)。

圖1 土木香內(nèi)酯的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗材料

細(xì)胞株Caco－2（ATCC＃HTB－37）購自美國 ATCC，土木香內(nèi)酯（110760－201004）對照品購自中國藥品生物制品檢定所。甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純，北京化工廠）、緩沖溶液（Hank＇s balanced salt solution，HBSS），實(shí)驗用二重水。四味藏木香軟膠囊（由青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院中藏藥研究中心制作，批號批號201112）；DMEM 培養(yǎng)基（DμLbecco＇s modified Eagel medium，Hyclone公司）；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS，equitech－Bio Inc.公司）；胰蛋白酶（Trypsin）購自北京華美生物工程公司；非必需氨基酸（nonessential amino acids，NEAA）購自美國Hy－clone公司；萘洛爾（proprnaolo1）、阿替洛爾（atenolo1）。

1.2 主要儀器

高效液相色譜儀（日本島津），LC－10AT 泵，ZA－100進(jìn)樣器，N2000工作站，SPD－10A檢測器，SY1200T超聲波清洗器，ZF－1型三用紫外分析儀；電子分析天平（FA1004，上海良平儀器儀表有限公司）；ZS－H型恒溫水浴振蕩器（哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司）；TGL－16C型高速臺式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.3 實(shí)驗方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)條件

Caco－2按“Caco－2細(xì)胞模型和標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程”，采用內(nèi)含10%胎牛血清、1%非必需氨基酸和青霉素－鏈霉素雙抗液的高糖DMEM培養(yǎng)基。將Caco－2細(xì)胞接種37℃含5%CO（相對濕度90%）培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，每天換液，約5d后按1∶5比例傳代。將細(xì)胞按一定密度接種在Millicell膜上，種植密度為1×105個／cm2，種植后每天換一次液，培養(yǎng)至21～23d，體外培養(yǎng)至融合經(jīng)檢測合格后，即可用于藥物的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝試驗。本實(shí)驗選擇43～44代，電阻＞25Ω／cm2的Caco－2細(xì)胞單層。

1.3.2 攝取、轉(zhuǎn)運(yùn)與外流實(shí)驗

將土木香內(nèi)酯溶于甲醇中制成儲備液，實(shí)驗前以HBSS緩沖液稀釋至所設(shè)計的劑量濃度，分別在細(xì)胞兩側(cè)加入受試化合物和HBSS溶液（AP側(cè)400μL，BL側(cè)1200μL）。AP側(cè)給藥為攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗；BL側(cè)給藥為外流實(shí)驗。用藥后于恒溫?fù)u床（37℃ ，50r·min－1）上溫育。土木香內(nèi)酯的給藥量為40μmol，溫育90min，分別收集AP側(cè)或BL側(cè)的溶液，單孔取點(diǎn)，每點(diǎn)平行3個孔。當(dāng)AP側(cè)給藥時，給藥端AP側(cè)取樣300μL，接受端BL側(cè)取樣1100μL；當(dāng)BL側(cè)給藥時，給藥端BL側(cè)取樣400μL，接受端AP側(cè)取樣350μL。所取樣品經(jīng)冷凍干燥后分別加入不同體積的甲醇，給藥端均加入300μL，接受端均加入100μL，漩渦混勻后超聲溶解50min。離心20min，取上清液，用HPLC測定。

1.3.3 HPLC色譜條件

色譜條件：高相液相色譜儀：色譜柱：C18柱，4.6m×150mm，5μm；測定波長：220nm；柱溫：20℃ ；流動相：乙腈∶水＝55%∶45%；流動相流速：1mL／min。進(jìn)樣量10μL。

1.3.4 表觀滲透系數(shù)的計算

土木香內(nèi)酯在Caco－2細(xì)胞單層模型中的值按下式計算：Papp＝（dQ／dt）／SC。dQ／dt為接收池藥物出現(xiàn)的速率，S為膜面積，C為藥物的初始濃度。P值越大，通透率越高。用t檢驗對兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較處理。

2 結(jié)果

2.1 土木香內(nèi)酯分析方法建立

精密稱取土木香內(nèi)酯25.00mg，置25mL容量瓶中，以甲醇稀釋至刻度，配成1.00mg·mL－1的儲備液。精密吸取儲備液30μL加最后一次洗細(xì)胞的HBSS稀釋到3mL，再從中依次取1000、600、500、400、300、200、100μL，分別用 HBSS稀釋至1mL，冷凍干燥，加入甲醇溶解并定容為1mL；各濃度點(diǎn)取20μL，進(jìn)樣分析。得到土木香內(nèi)酯在濃度范圍0.1～1.0mg·mL－1內(nèi)峰面積（Y）與濃度（X）的線性回歸方程為Y＝9.12×107X＋2.2×106，相關(guān)系數(shù)r＝0.9988。

圖2 土木香內(nèi)酯對照品和轉(zhuǎn)運(yùn)藥物的HPLC色譜

2.2 回收率實(shí)驗

AP側(cè)給藥，土木香內(nèi)酯的給藥濃度為40μmol·L－1。溫育90min后，取AP側(cè)或BL和BL側(cè)或AP側(cè)液，按“1.2.2”項方法處理，按項“1.2.3”進(jìn)行測定，按“1.2.4”項方法計算，得土木香內(nèi)酯的平均回收率為95.80%，RSD＝1.03%。

2.3 攝取轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗結(jié)果

AP側(cè)或BL側(cè)給藥，土木香內(nèi)酯的給藥濃度皆40μmol·L－1。培育90min后，分別取AP側(cè)或BL側(cè)和BL側(cè)或AP側(cè)液，按“2.1”項方法處理，進(jìn)行測定，按“2.2”項方法計算，土木香內(nèi)酯AP側(cè)到BL側(cè)和從BL側(cè)到AP側(cè)的P值，結(jié)果見表1。同理在模型中用普萘洛爾（proprnaolo1）、阿替洛爾（atenolo1）做比較。

表1 土木香內(nèi)酯在Caco－2細(xì)胞單層模型中的Papp值

3 討論

土木香內(nèi)酯是四味藏木香軟膠囊的主要有效成分之一，具有多種藥理活性。本研究通過Caco－2細(xì)胞模型，研究土木香內(nèi)酯跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的機(jī)制從而探討土木香內(nèi)酯小腸吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的機(jī)制，初步闡明土木香內(nèi)酯在小腸中吸收的機(jī)制和藥物吸收的難易程度。建立土木香內(nèi)酯在Caco－2細(xì)胞單層模型中的HPLC檢測方法，土木香內(nèi)酯的峰面積與質(zhì)量濃度線性關(guān)系良好，線性范圍為0.1～1.0mg·mL－1。應(yīng)用該方法分別測定了AP側(cè)給藥轉(zhuǎn)運(yùn)90min，時間點(diǎn)AP側(cè)和BL側(cè)液中原形土木香內(nèi)酯的總殘存量，回收率（AP側(cè)和BL側(cè)的總和）為95.80%，說明它們在Caco－2細(xì)胞內(nèi)基本無蓄積或僅有少量蓄積，對實(shí)驗結(jié)果分析不會產(chǎn)生影響。

根據(jù)文獻(xiàn)報道，在Caco－2細(xì)胞單層模型中，一般來說人體吸收完全的藥物Papp值大于10－5cm·s－1，而吸收差的藥物Papp值小于10－5cm·s－1，在此模型中我們將轉(zhuǎn)運(yùn)良好的陽性藥物普萘洛爾和難吸收的藥物阿替洛爾的Papp值進(jìn)行測定，得到普萘洛爾的Papp值為（2.32±0.11）×10－5cm·s－1；阿替洛爾的Papp值為（2.04±）×10－5cm·s－1與文獻(xiàn)報道的數(shù)據(jù)接近，而從表1我們可知土木香內(nèi)酯的表觀滲透系數(shù)在吸收良好的藥物的范圍內(nèi)，從腸腔側(cè)進(jìn)入體循環(huán)（內(nèi)流）與從體循環(huán)進(jìn)入腸腔側(cè)（外流）的數(shù)據(jù)相差不大，并且PappA－B／PappB－A為0.67，在0.5～2.0之間，所以雙向轉(zhuǎn)運(yùn)差異不大，初步說明土木香內(nèi)酯在小腸上屬于被動轉(zhuǎn)運(yùn)，受生物大分子的影響較小。因此，這些結(jié)果對四味藏木香軟膠囊的口服提供了一定的實(shí)驗和理論基礎(chǔ)。

近年來，土木香內(nèi)酯被發(fā)現(xiàn)具有止痛作用，土木香根的甲醇提取物對人胃腺癌細(xì)胞（Mk－1）、人子宮癌細(xì)胞（HeLa）和鼠黑素瘤細(xì)胞（B16F10）具有抗增殖作用，此次在Caco－2細(xì)胞單層模型中的研究將對今后土木香內(nèi)酯在這些疑難雜癥的研究方面提供一定的參考依據(jù)。

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