高 昕 王述民 曲家騏 劉 博 (沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院胸外科，沈陽(yáng)110016)

Annexin家族是一類鈣依賴性膜磷脂結(jié)合蛋白，參與膜轉(zhuǎn)運(yùn)及膜表面一系列依賴于鈣調(diào)蛋白的活動(dòng)，包括鈣離子通道的形成、調(diào)控炎癥反應(yīng)、纖溶、胞吐、胞吞、細(xì)胞增殖、DNA修復(fù)合成、細(xì)胞分化與凋亡、細(xì)胞骨架活動(dòng)、成骨細(xì)胞的形成和骨的重吸收、膜功能區(qū)的形成、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等［1］。廣泛存在于核內(nèi)、胞質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)膜下、儲(chǔ)Ca2+細(xì)胞器附近及細(xì)胞外基質(zhì)中，約占細(xì)胞總蛋白的2%。Annexin A2是家族中的一個(gè)重要成員，在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用［2，3］。本研究擬探討 Annexin A2基因沉默對(duì)肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響，進(jìn)一步明確肺癌轉(zhuǎn)移中相關(guān)分子機(jī)制，以期為肺癌的基因治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 DMEM及1640培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Gibco公司。胎牛血清購(gòu)于四季青生物工程有限公司。逆轉(zhuǎn)錄、rTaq DNA聚合酶、dNTP、限制性核酸內(nèi)切酶和DL2000試劑購(gòu)于日本TaKaRa公司。質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)于美國(guó)Axygen公司。Trizol及LipofectamineTM2000購(gòu)于美國(guó)Invotrigen公司。單克隆鼠抗人Annexin A2抗體購(gòu)于美國(guó)Diagnostica公司。生物素化的兔抗鼠IgG購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。A549，SPC-1-A，95D和95C肺癌細(xì)胞由本院呼吸實(shí)驗(yàn)室室保存。真核細(xì)胞載體psilencer-Annexin A2由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)黃昀博士惠贈(zèng)?？沽姿峄膍TOR多克隆抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology公司;抗β-actin單克隆抗體購(gòu)于晶美生物工程有限公司;HRP標(biāo)記二抗體和FITC標(biāo)記二抗購(gòu)于北京中山公司;ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)于美國(guó)Amersham公司;Transwell小室購(gòu)于丹麥Costar Corning公司;瑞士姬姆薩染色液購(gòu)于珠海貝索生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞系的培養(yǎng) A549、95D、SPC-1-A和95C共4種肺腺癌細(xì)胞系均用含10%胎牛血清、1%雙抗和1.5%谷胺酰胺的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，在37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3天傳代1次。

1.2.2明膠酶活性分析 應(yīng)用金屬蛋白酶活性分析實(shí)驗(yàn)進(jìn)行體外培養(yǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力分析。按1×104個(gè)細(xì)胞/每孔接種肺腺癌細(xì)胞于24孔培養(yǎng)板內(nèi)。細(xì)胞貼壁后，棄去培養(yǎng)液，換成無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)基。培養(yǎng)24小時(shí)后，收集培養(yǎng)上清液，1 000 r/min，離心10分鐘，取上清液分裝，-20℃凍存。配制10%SDS-PAGE膠(含1%明膠)，作為分離膠，上層為6%的積層膠，以15 μl的細(xì)胞培養(yǎng)上清液上樣，150 V恒壓電泳1小時(shí)后，取出凝膠放入2.5%Triton-X100溶液中浸泡2小時(shí)，然后在明膠酶緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl，200 mmol/L NaCl，10 mmol/L CaCl2，pH7.5)中37℃孵育18小時(shí)，考馬斯亮藍(lán)染色，透射掃描儀掃描并存貯圖像，Bio-Rad凝膠成像軟件分析蛋白負(fù)染情況。

1.2.3Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 棄去細(xì)胞培養(yǎng)基，PBS沖洗細(xì)胞2次，胰酶消化5分鐘，離心，棄上清，10%FCS的DMEM重懸細(xì)胞，反復(fù)吹打均勻，光鏡下用計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，取5×104個(gè)細(xì)胞于24孔板中的 Transwell(小孔內(nèi)徑8 μm)上室，取500 μl含10%FCS的DMEM于Transwell下室，將含Transwell小室的24孔板置于37℃、含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，6小時(shí)后取出，用棉簽擦去小室濾膜上層細(xì)胞，移行并粘附到濾膜下層面的細(xì)胞以瑞士姬姆薩染色液染色3～10分鐘，自來(lái)水沖洗，于低倍顯微鏡下(×10)觀察到移行的細(xì)胞核呈紫紅色，隨機(jī)觀察5個(gè)視野，計(jì)數(shù)移行細(xì)胞數(shù)，取均值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4RT-PCR檢測(cè) TRIzol一步法提取細(xì)胞總RNA，各取1 μg RNA 按 TaKaRa RNA PCR Kit說(shuō)明書行cDNA合成及PCR擴(kuò)增，同時(shí)以β-actin為內(nèi)參照?；駻nnexin A2引物序列如下(975 bp)：5＇-AAATGTCTACTGTTCACGAAATCC-3＇(正義鏈);5＇-GTGTCGGGCTTCAGTCATC-3＇(反義鏈)。對(duì)照基因β-actin 引物序列如下(250 bp)：5＇-ACTCTTCCAGCCTTCCTTCC-3＇(正義鏈);5＇-CATACTCCTGCTTGCTGATCC-3＇(反義鏈)。

1.2.5細(xì)胞轉(zhuǎn)染 pSilencer-Annexin A2載體購(gòu)于美國(guó)Ambion生物工程公司。Annexin A2轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)下游94～113 bp的21個(gè)堿基為目標(biāo)片段。應(yīng)用陽(yáng)離子脂質(zhì)體Lipofectamine2000將Annexin A2沉默載體分別轉(zhuǎn)染到高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系A(chǔ)549和95D中，G418篩選2周后出現(xiàn)穩(wěn)定表達(dá)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的單細(xì)胞克隆株，分別命名為 A549-siAnnexin A2和 95D-siAnnexin A2。

1.2.6Western blot 將全細(xì)胞提取物進(jìn)行SDSPAGE、轉(zhuǎn)膜、抗體結(jié)合及顯色。分離膠濃度為12%;一抗分別為抗 Annexin A2，mTOR和 β-actin抗體。經(jīng)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育后，按ECL試劑盒說(shuō)明書曝光處理。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用單因素方差分析及Post Hoc組間比較，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05時(shí)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

圖1 四種肺腺癌細(xì)胞中金屬蛋白酶的表達(dá)Fig．1 Expression of MMP in lung adenocarcinoma cells

2.1四種肺腺癌細(xì)胞中金屬蛋白酶的表達(dá)和細(xì)胞移行能力 四種肺腺癌細(xì)胞系的金屬蛋白酶的表達(dá)(圖1)，可見肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和95D中MMP-9的活性明顯高于95C和SPC-1-A細(xì)胞系(P＜0.01)。Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)表明(圖2)，肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和95D的遷移數(shù)目高于95C和SPC-1-A細(xì)胞系(P＜0.05)。

圖2 四種肺腺癌細(xì)胞遷移數(shù)目Fig．2 Cell migration numbers in lung adenocarcinoma cells

圖3 四種肺腺癌細(xì)胞中Annexin A2 mRNA的表達(dá)Fig．3 Expression of Annexin A2 mRNA in lung adenocarcinoma cells

2.2四種肺腺癌細(xì)胞中Annexin A2 mRNA及蛋白的表達(dá) 應(yīng)用RT-PCR和Western blot分析檢測(cè)顯示，高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系A(chǔ)549和95D中Annexin A2 mRNA(圖3)及蛋白(圖4)表達(dá)均明顯高于低轉(zhuǎn)移細(xì)胞系95C和SPC-1-A(P＜0.01)。

2.3沉默載體psilencer-Annexin A2轉(zhuǎn)染后A549和95D細(xì)胞的移行能力 Western blot分析顯示(圖5)，沉默載體psilencer-Annexin A2轉(zhuǎn)染后的A549-si和95D-si細(xì)胞中Annexin A2的表達(dá)較空載體(psilencer-blank)轉(zhuǎn)染的對(duì)照組A549-blk、95D-blk顯著下降(P＜0.01)。進(jìn)一步觀察這兩個(gè)細(xì)胞模型的細(xì)胞遷移能力，Transwell遷移模型的結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖6)：與正?？召|(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)照組比較，Annexin A2沉默后，兩細(xì)胞系的遷移數(shù)目降低(P＜0.05)。

圖4 四種肺腺癌細(xì)胞中Annexin A2蛋白的表達(dá)Fig．4 Expression of Annexin A2 protein in lung adenocarcinoma cells

2.4肺腺癌細(xì)胞中mTOR蛋白的表達(dá) 應(yīng)用Western blot分析表明(圖7)，與低轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞系相比較，在高轉(zhuǎn)移潛能的肺癌細(xì)胞中p-mTOR呈明顯高表達(dá)(P＜0.01)，而T-mTOR表達(dá)無(wú)明顯差異。Annexin A2基因表達(dá)被沉默后，細(xì)胞中p-mTOR表達(dá)也明顯下降(P＜0.01)。

圖6 沉默載體psilencer-Annexin A2轉(zhuǎn)染后，A549和95D細(xì)胞的遷移數(shù)目Fig．6 Cell migration numbers in A549 and 95D cells after psilencer-Annexin A2 transfection

圖7 肺腺癌細(xì)胞中mTOR蛋白的表達(dá)Fig．7 Expression of mTOR in lung adenocarcinoma cells

3 討論

具有局部浸潤(rùn)和遠(yuǎn)距離轉(zhuǎn)移能力是惡性腫瘤最重要的特點(diǎn)，也是惡性腫瘤致命的主要原因之一。因此，Annexin A2與惡性腫瘤這方面特性的關(guān)系的研究受到格外重視。Annexin A2與某些S100家族成員、組織型纖溶酶原激活物(tissue-type plasminogen activator，t-PA)、纖溶酶原(Plasminogen，PLG)及腱糖蛋白 C(Tenascin.C，TN-C)等相互作用［4］，使他們?cè)谀[瘤細(xì)胞表面共區(qū)域化，介導(dǎo)tPA依賴的纖溶酶的產(chǎn)生，激活蛋白酶前體，活化基質(zhì)金屬蛋白酶、細(xì)胞外基質(zhì)的重塑及蛋白質(zhì)水解、新血管形成，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移［5-7］。

我們分析了四種肺腺癌細(xì)胞系中基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9的表達(dá)，MMP-9是細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶家族中最重要的成員，可以直接參與對(duì)基底細(xì)胞膜的水解，影響細(xì)胞的粘附和轉(zhuǎn)移能力。結(jié)果表明肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和95D中MMP-9的活性明顯高于95C和SPC-1-A細(xì)胞系。同時(shí)，Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和95D的遷移數(shù)目高于95C和SPC-1-A細(xì)胞系。上述結(jié)果證實(shí)，A549和95D細(xì)胞系具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)移潛能。另外，Annexin A2基因在高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系A(chǔ)549和95D中均呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。這些高表達(dá)的Annexin A2在細(xì)胞表面作為PLG和t-PA的共同受體，加速了PLG的生成，PLG通過(guò)促進(jìn)金屬蛋白酶(MMPs)和潛在生長(zhǎng)因子(Latent growth factor，LGF)的活化、膜蛋白的水解、細(xì)胞外基質(zhì)的降解等加速血管生成，促進(jìn)腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。進(jìn)一步應(yīng)用RNA干擾的方法抑制了Annexin A2基因的表達(dá)，使A549和95D細(xì)胞的遷移能力顯著下降。以上結(jié)果說(shuō)明Annexin A2具有促肺癌細(xì)胞增殖和侵襲的作用，從而促進(jìn)肺癌的發(fā)生和發(fā)展。

哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是一個(gè)289 kD的高度保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，屬于 PI3K相關(guān)激酶家族(Ptdlns3K-related kinase family)。mTOR對(duì)細(xì)胞的代謝、生長(zhǎng)、增殖、生存和細(xì)胞骨架運(yùn)動(dòng)等生物過(guò)程的調(diào)節(jié)起著重要的調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)mTOR信號(hào)通路參與了腫瘤的形成、血管新生、胰島素抵抗、脂肪形成、T淋巴細(xì)胞激活等過(guò)程［8］。由于與腫瘤密切相關(guān)，mTOR成為腫瘤治療的一個(gè)重要靶點(diǎn)。雷帕霉素是mTOR的特異性抑制劑，可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，與其他的化療藥物聯(lián)合應(yīng)用有望獲得更好的治療效果，但只有mTOR通路在腫瘤中起到重要作用時(shí)，該類藥物才會(huì)表現(xiàn)較好的療效［9］。磷酸化的mTOR(p-mTOR)是mTOR在信號(hào)通路中的激活狀態(tài)。因此本實(shí)驗(yàn)選取p-mTOR作為研究指標(biāo)，結(jié)果顯示，在高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系中p-mTOR呈明顯高表達(dá);在沉默了 Annexin A2表達(dá)后，細(xì)胞中 p-mTOR的活性明顯受到抑制。二者表達(dá)的密切相關(guān)提示了Annexin A2可能是通過(guò)激活了細(xì)胞內(nèi)的mTOR信號(hào)通路，參與了肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的發(fā)生，但具體的分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究闡明。

綜上所述，本研究結(jié)果提示Annexin A2在肺癌轉(zhuǎn)移過(guò)程中起關(guān)鍵作用，為闡明腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移分子機(jī)制、分子靶向治療及預(yù)后評(píng)估方面，提供了新思路。抑制其表達(dá)或阻斷其介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路將有可能為抗腫瘤治療提供一些較為理想的思路。隨著基因剔除和剔減技術(shù)的興起，人們正在進(jìn)一步揭示Annexin A2與腫瘤發(fā)展進(jìn)程的相關(guān)性，但其在腫瘤的發(fā)生、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移過(guò)程中的具體作用機(jī)制尚有待于進(jìn)一步探索和拓展。相信隨著該基因與惡性腫瘤發(fā)展關(guān)系的深入研究，它有望被開發(fā)為用于肺癌及其轉(zhuǎn)移的早期檢測(cè)、輔助診斷及治療的靶分子。

1 Chasserot-Golaz S，Vitale N，Umbrecht-Jenck E et al．Annexin 2 promotes the formation of lipid microdomains required for calciumregulated exocytosis of dense-core vesicles［J］.Mol Biol Cell，2005;16(3)：1108-1119.

2 Huang Y，Jin Y，Yan C H et al．Involvement of Annexin A2 in p53 induced apoptosis in lung cancer［J］.Mol Cell Biochem，2008;309(1-2)：117-123.

3 Zhao P，Zhang W，Tang J et al．Annexin II promotes invasion and migration of human hepatocellular carcinoma cells in vitro via its interaction with HAb18G/CD147［J］.Cancer Sci，2010;101(2)：387-395.

4 Hou Y，Yang L，Mou M et al．Annexin A2 regulates the levels of plasmin，S100A10 and Fascin in L5178Y cells［J］.Cancer Invest，2008;26(8)：809-815.

5 章藹然，潘 寧，侯穎春et al.膜聯(lián)蛋白A2與惡性腫瘤發(fā)展進(jìn)程的關(guān)系［J］.細(xì)胞生物學(xué)雜志，2008;30(3)：307-311.

6 Semov A，Moreno M J，Onichtchenko A et al．Metastasis-associated protein S100A4 induces angiogenesis through interaction with Annexin II and accelerated plasmin formation［J］.J Biol Chem，2005;280(21)：20833-20841.

7 Mackie E J.Molecules in focus：tenascin-C［J］.Int J Biochem Cell Biol，1997;29(10)：1133-1137.

8 Laplante M，Sabatini D M.mTOR signaling at a glance［J］.J Cell Sci，2009;122(20)：3589-3594.

9 Chan S，Scheulen M E，Johnston S et al．Phase II study of temsirolimus(CCI-779)，a novel inhibitor of mTOR，in heavily pretreated patients with locally advanced or metastatic breast cancer［J］.J Clin Oncol，2005;23(23)：5314-5322.