李國利 趙 銘 張靈霞 王 倩

解放軍第三〇九醫(yī)院結(jié)核病研究所，北京 100091

分枝桿菌屬內(nèi)菌種繁多，除結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群（mycobacterium tuberculosis complex，MTC）和麻風(fēng)分枝桿菌外，其他的分枝桿菌統(tǒng)稱為非結(jié)核分枝桿菌（nontuberculosis mycobacterium，NTM）。近年來，世界范圍內(nèi)結(jié)核病與非結(jié)核分枝桿菌病發(fā)病率明顯升高。在結(jié)核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）臨床檢驗(yàn)時(shí)，遇到NTM的頻率正在增加。NTM中遇到比例較高的主要有堪薩斯分枝桿菌、鳥分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、海分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌、戈登分枝桿菌、蟾蜍分枝桿菌、偶然分枝桿菌、龜分枝桿菌和膿腫分枝桿菌。我國全國結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查（流調(diào)）結(jié)果表明[1]，2000年第4次流調(diào)NTM分離株占分枝桿菌分離株的11.1%，高于1979年第 1次流調(diào)的4.3%，1984/1985年第 2次流調(diào)的4.2%和第3次流調(diào)的4.9%。特別值得注意的是我國曾發(fā)生過多起NTM爆發(fā)感染。NTM病與結(jié)核病臨床表現(xiàn)相似，難以鑒別；NTM與MTB藥物敏感性差異很大，許多NTM對(duì)抗結(jié)核藥物天然耐藥，其治療方案與結(jié)核病有所不同。分枝桿菌菌種鑒定不僅在流行病學(xué)上有重要意義，而且關(guān)系到臨床的正確診斷和正確治療。

目前，在結(jié)核病臨床實(shí)驗(yàn)室，涂片抗酸染色鏡檢和分枝桿菌分離培養(yǎng)是結(jié)核病病原學(xué)的主要檢測(cè)方法，但由于方法學(xué)的限制即使是涂片或/和培養(yǎng)陽性,也僅說明檢出了抗酸桿菌和分枝桿菌，而難以確定是MTB還是NTM。因此，需要進(jìn)行分枝桿菌菌種鑒定。MTC（包括MTB、牛分枝桿菌、非洲分枝桿菌和田鼠分枝桿菌）和NTM菌群的初步鑒定是進(jìn)一步分枝桿菌菌種鑒定的首要步驟。傳統(tǒng)的MTC與NTM菌群鑒別需通過觀察菌株的菌落形態(tài)、顏色特征，進(jìn)行對(duì)硝基苯甲酸（PNB）培養(yǎng)基上生長(zhǎng)試驗(yàn)，28℃生長(zhǎng)試驗(yàn)，耐熱觸酶試驗(yàn)來完成[2]。操作步驟多，由于涉及到培養(yǎng)而耗時(shí)長(zhǎng)，通常慢生長(zhǎng)分枝桿菌需3～4周，快生長(zhǎng)分枝桿菌需1周。因此，建立簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的MTC與NTM鑒別方法很有必要。本文旨在評(píng)估以免疫層析法檢測(cè)MPT64蛋白鑒別MTC與NTM的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 菌株

21株分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株，其中包括4株結(jié)核分枝桿MTC標(biāo)準(zhǔn)株（MTB、牛分枝桿、非洲分枝桿菌和田鼠分枝桿菌）和17株NTM標(biāo)準(zhǔn)株（堪薩斯分枝桿菌、胃分枝桿菌、海分枝桿菌、鳥分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌、戈登分枝桿菌、次要分枝桿菌、蟾蜍分枝桿菌、土地分枝桿菌、不產(chǎn)色分枝桿菌、龜分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、偶然分枝桿菌、恥垢分枝桿菌、草分枝桿菌和母牛分枝桿菌），來源于中國藥品生物制品檢定所。135株MTB臨床分離株和45株NTM臨床分離株，其中堪薩斯分枝桿菌14株，鳥分枝桿菌3株，胞內(nèi)分枝桿菌7株、瘰疬分枝桿菌5株、戈登分枝桿菌4株、膿腫分枝桿菌6株、偶然分枝桿菌2株，次要分枝桿菌、蟾蜍分枝桿菌、不產(chǎn)色分枝桿菌和金色分株桿菌各1株，來源于本室-80℃保藏菌株。分枝桿菌培養(yǎng)物均經(jīng)抗酸染色檢測(cè)為陽性（+），并已經(jīng)傳統(tǒng)的MTC與NTM菌群鑒別試驗(yàn)和16S～23S rDNA間隔區(qū)測(cè)序[3]分枝桿菌菌種鑒定。

1.2 試劑

MPT64檢測(cè)板來源于杭州創(chuàng)新生物檢控技術(shù)有限公司。

1.3 檢測(cè)方法

將-80℃保藏菌株傳代培養(yǎng)，取適量改良羅氏培養(yǎng)基上新鮮培養(yǎng)物加入到含200 μL緩沖液試管中，加蓋后，用漩渦混合器充分?jǐn)嚢柚苽涑删鷳乙?。?00 μL滴入檢測(cè)板上樣品孔內(nèi)，室溫放置15 min觀察結(jié)果。試劑盒顯示窗左側(cè)條帶為對(duì)照條帶（C），右側(cè)為檢測(cè)條帶（T），對(duì)照和檢測(cè)條帶均顯示紫紅色表示MPT64檢測(cè)陽性，只有對(duì)照條帶顯示紫紅色表示檢測(cè)陰性。若對(duì)照條帶未顯色，表示檢測(cè)結(jié)果無效，需更換試劑重新檢測(cè)。

2 結(jié)果

所有分枝桿菌菌株檢測(cè)均出現(xiàn)對(duì)照條帶，均為有效結(jié)果。

2.1 分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株檢測(cè)結(jié)果

4株MTC標(biāo)準(zhǔn)菌株MPT64檢測(cè)均為陽性，17株NTM標(biāo)準(zhǔn)菌株MPT64檢測(cè)均為陰性。

2.2 分枝桿菌臨床分離株檢測(cè)結(jié)果

135株MTB臨床分離株MPT64檢測(cè)，其中134株為陽性，1株為陰性。45株NTM分離株MPT64檢測(cè)均為陰性。

2.3 特異性、敏感性和準(zhǔn)確度結(jié)果

4株MTC標(biāo)準(zhǔn)菌株和135株MTC臨床分離株中，除1株臨床分離株檢測(cè)陰性外，其余均為陽性，檢測(cè)的敏感性為99.3%（138/139）；17株NTM標(biāo)準(zhǔn)株和45株NTM臨床分離株MPT64檢測(cè)均為陰性，檢測(cè)的特異性為100%（62/62）；對(duì)62株NTM菌株（包括標(biāo)準(zhǔn)株和臨床分離株）、4株MTC標(biāo)準(zhǔn)株和135株MTB臨床分離株菌群鑒定的準(zhǔn)確度為99.5%（200/201）。

3 討論

MTB分泌性蛋白是MTB在早、中期生長(zhǎng)過程中釋放于細(xì)胞外的一組蛋白，游離于菌體周圍或培養(yǎng)基液中。MPT64蛋白是MTB培養(yǎng)早期即分泌至菌體外的一種可溶性蛋白，在MTB分泌性蛋白中所占比例最大，最早在牛分枝桿菌中發(fā)現(xiàn)，稱為MPB64（MPB64與MPT64系同一蛋白，只是依來源不同而命名）。它由RD2區(qū)RV1908基因編碼，ORF為687 bp，編碼228個(gè)氨基酸，相對(duì)分子量為24 000，是MTC的特異性抗原蛋白，只存在于MTC菌株和某些BCG中，在NTM菌株中缺乏該基因[4]，因此檢測(cè)它在分枝桿菌中的有無，可將MTC與NTM相鑒別[5-6]。

本文所采用的免疫層析試劑板內(nèi)置由樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜和吸收墊組成的試劑條。膠體金墊內(nèi)含膠體金標(biāo)記的鼠抗MPB64單克隆抗體A，硝酸纖維素膜上包被固化的鼠抗MPB64單克隆抗體B（檢測(cè)線）和抗鼠免疫球蛋白多克隆抗體（對(duì)照條線）。鼠抗MPB64單克隆抗體A和B識(shí)別MPT64蛋白的不同表位。當(dāng)樣品從檢測(cè)板樣品孔滴下后，由樣品墊吸收擴(kuò)散至膠體金墊，膠體金標(biāo)記的鼠抗MPB64單克隆抗體A被熔解，若樣品中存在MPT64蛋白抗原，則與膠體金標(biāo)記抗體形成免疫復(fù)合物，因毛細(xì)管層析作用而在硝酸纖維素膜上移動(dòng)，被膜上固化的鼠抗MPB64單克隆抗體B捕獲，在膠體金作用下在檢測(cè)線形成紫紅色條帶。反之，若樣本中無MPT64蛋白，則無條帶產(chǎn)生。另一方面，無論樣品中是否存在MPT64蛋白抗原，剩余的膠體金標(biāo)記抗體A在硝酸纖維素膜上繼續(xù)移動(dòng)，被膜上固化的抗鼠免疫球蛋白多克隆抗體捕獲，因膠體金作用而在對(duì)照線產(chǎn)生紫紅色條帶，這顯示了膠體金標(biāo)記抗體在硝酸纖維素膜上的正常移動(dòng)。

本文采用免疫層析法檢測(cè)MPT64蛋白鑒定MTB和NTM，結(jié)果表明其特異性、敏感性和準(zhǔn)確度分別為100%、99.3%和99.5%。在4株MTC標(biāo)準(zhǔn)菌株和135株MTB臨床分離菌株中，138株檢測(cè)陽性，僅1株MTB臨床分離株檢測(cè)陰性，分析其原因可能是由于該菌株MPT64編碼基因Rv1908突變或缺失所致，國內(nèi)外均有報(bào)道[7-9]，與筆者所得結(jié)果一致，所占比例極低。該方法不僅特異性強(qiáng)，敏感性和準(zhǔn)確度高，同時(shí)與傳統(tǒng)的菌群鑒定方法和DNA測(cè)序的分子診斷方法比較操作簡(jiǎn)便、快速，不需特殊儀器設(shè)備，15 min即可報(bào)告結(jié)果，極易在各級(jí)分枝桿菌臨床實(shí)驗(yàn)室普及開展，具有良好的臨床應(yīng)用前景。

[1]全國結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查技術(shù)指導(dǎo)組.2000年全國結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報(bào)告[J].中國防癆雜志，2002，24（2）：65-108.

[2]中國防癆協(xié)會(huì)基礎(chǔ)專業(yè)委員會(huì).結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程[M].北京：中國教育文化出版社，2006：53-55.

[3]李國利，莊玉輝，趙銘，等.16S～23SrDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列分析及其在分枝桿菌鑒定中的應(yīng)用價(jià)值[J].中華結(jié)核及呼吸雜志，2002，25（3）：166-170.

[4]Li H，Ulstrup JC，Jonassen TO，et al.Evidence for absence of the MPB64 Gene in some substrains of mycobacterium bovis BCG[J].Infect Immun，1993，61（5）：1730-1734.

[5]Abe C，Hirano K，Tomiyama T.Simple and rapid identification of the Mycobacterium tuberculosis complex by immunochromatographic assay using anti-MPB64 monoclonal antibodies[J].J Clin Microbiol，1999，37（11）：3693-3697.

[6]Hasegawa N，Miura T，Ishii K，et al.New simple and rapid test for culture confirmation of mycobacterium tuberculosis complex:a multicenter study[J].J Clin Microbiol，2002，40（3）：908-912.

[7]Hirano K，Aono A，Takahashi M，et al.Mutations including IS6110 insertion in the gene encoding the MPB64 protein of capilia TB negative mycobacterium tuberculosis isolates[J].J Clin Microbiol，2004，42（1）：390-392.

[8]何霞，譚首勇，羅明春，等.應(yīng)用MPT64為靶標(biāo)快速檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)的研究[J].廣東醫(yī)學(xué)，2010，31（2）：222-224.

[9]張?jiān)毫迹绦由?，譚耀駒.分泌蛋白在痰液及培養(yǎng)液中鑒定結(jié)核分枝桿菌符合群的應(yīng)用研究[J].現(xiàn)代醫(yī)院，2011，11（2）：17-19.