陶華娟 張艷 郎翠紅

（濰坊市婦幼保健院 遺傳科，山東 濰坊 260011）

1 前 言

染色體不分離和結(jié)構(gòu)不平衡在新生兒中的發(fā)生率為1／200［1］，成為發(fā)育缺陷和先天畸形的主要原因。因此，細(xì)胞遺傳學(xué)分析一直被認(rèn)為是很重要的有創(chuàng)性產(chǎn)前診斷方法。

從1966年首次應(yīng)用孕中期羊水脫落細(xì)胞培養(yǎng)或孕早期絨毛采樣進(jìn)行產(chǎn)前檢測(cè)，到19世紀(jì)70年代常規(guī)應(yīng)用染色體顯帶分析（核型分析）以來，此方法已經(jīng)成為經(jīng)典的產(chǎn)前診斷技術(shù)［2］。核型分析作為一種可靠的方法，可以診斷染色體數(shù)目異常及500萬至1000萬對(duì)堿基對(duì)的結(jié)構(gòu)重排。羊水細(xì)胞核型分析的準(zhǔn)確率為99.4%～99.8%，絨毛膜細(xì)胞核型分析的準(zhǔn)確率為97.5%～99.6%［3］。然而，核型分析的局限性在于必須進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，大多數(shù)臨床實(shí)驗(yàn)室出報(bào)告的時(shí)間為10～14天。

近10年來，21-三體綜合征及其他染色體疾病的無創(chuàng)篩查技術(shù)已有了根本性提高。為了改善孕期管理和緩解孕婦焦慮的情緒，需要一種快速的方法來確診這些疾病，且大量臨床研究表明這些方法能在產(chǎn)前診斷中檢測(cè)出大多數(shù)的染色體異常。因此，將傳統(tǒng)核型分析作為經(jīng)典產(chǎn)前診斷方法保留還是被快速的方法所取代還存在爭(zhēng)議。本文將討論臨床上最常用的3種快速診斷非整倍體染色體疾病的方法：分裂相的原位熒光雜交（iFISH）、熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（QF-PCR）、多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)（MLPA）。

2 方 法

iFISH、QF-PCR、MLPA 和其他一些新的方法可以快速檢測(cè)（約1～2天）最常見的常染色體異常如13-三體（帕塔綜合征）、18-三體（愛德華綜合征）和21-三體（唐氏綜合征），而性染色體異常如特納綜合征（單體X）、克蘭費(fèi)爾特綜合征（XXY）和三倍體，嵌合體和結(jié)構(gòu)重排，包括平衡和不平衡易位、大量的基因缺失和復(fù)制、插入和標(biāo)記染色體等，只有很少一部分能夠在產(chǎn)前檢測(cè)。

2.1 熒光原位雜交技術(shù) 近20年來，熒光原位雜交技術(shù)（FISH）技術(shù)有了很大的發(fā)展。相對(duì)于傳統(tǒng)的核型分析來說，F(xiàn)ISH 能更好地檢測(cè)和分析某些罕見的染色體結(jié)構(gòu)異常，包括微缺失綜合征、隱匿性的或輕微的基因復(fù)制和置換、復(fù)雜的重排和標(biāo)記染色體。它是通過特定的染色體探針來檢測(cè)羊水或絨毛樣本中的分裂間期的細(xì)胞，從而快速（需1～2個(gè)日）診斷常見的非整倍體染色體疾病。通過這種方法，可以避免傳統(tǒng)核型分析中因需要進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)而延誤報(bào)告時(shí)間。大量研究發(fā)現(xiàn)，用于對(duì)分裂間期的細(xì)胞核進(jìn)行FISH 檢測(cè)的商業(yè)化試劑盒的靈敏度和特異度都很高，且在診斷應(yīng)用中也被證實(shí)。許多實(shí)驗(yàn)中心現(xiàn)在都依據(jù)FISH 檢測(cè)結(jié)果，如發(fā)現(xiàn)常見的三體時(shí)，就不需要等細(xì)胞培養(yǎng)后的核型分析結(jié)果了。但是，分裂間期FISH 檢測(cè)方法因使用探針而受到限制，許多罕見的染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目異常均不能被檢出。因此FISH 的結(jié)果有時(shí)有局限性，仍需要核型分析來最終確診。

在產(chǎn)前診斷中應(yīng)用FISH 檢測(cè)的同時(shí)仍需要同時(shí)進(jìn)行傳統(tǒng)的核型分析，因?yàn)槠鋬H能快速診斷非整倍體染色體。

2.2 熒光定量聚合酶鏈反應(yīng) 在歐洲，最常用的快速檢測(cè)非整倍體的產(chǎn)前診斷方法是熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（QF-PCR）。QF-PCR 檢測(cè)的原理是建立在選擇性的短串聯(lián)重復(fù)片段（STRs）基礎(chǔ)上，這些片段是由2～5個(gè)核苷酸組成的基因片段多次重復(fù)形成的。這些片段的多態(tài)性與某一特定位點(diǎn)重復(fù)的數(shù)量不同有關(guān)，進(jìn)而產(chǎn)生了不同長(zhǎng)度的等位基因。STRs很容易通過PCR 擴(kuò)增多態(tài)性片段來檢出，它產(chǎn)生的熒光產(chǎn)物與目標(biāo)片段的數(shù)量是成正比的。QF-PCR可以通過非多態(tài)性釉質(zhì)（AMXY）基因進(jìn)行性別鑒定，可依據(jù)此基因序列的不同來鑒定不同長(zhǎng)度的X-、Y-特定產(chǎn)物，此外，通過分析此基因序列還可以鑒定性染色體數(shù)目異常（47，XXY，47，XYY，48，XXXY）［4，5］。

經(jīng)過最初的實(shí)驗(yàn)室和臨床試驗(yàn)后，QF-PCR 檢測(cè)方法已在幾個(gè)產(chǎn)前診斷中心被常規(guī)使用（主要在歐洲地區(qū)）。它能借助羊水標(biāo)本和計(jì)算機(jī)系統(tǒng)來正確診斷所有正常的染色體核型，13、18、21-三體，雙三體（48，XXY，t21；48，XXY，t18）及非嵌合的性染色體異常，通常在24～48小時(shí)出檢測(cè)報(bào)告，能緩解超過95%的父母因等待核型分析結(jié)果產(chǎn)生的緊張情緒［6，7］。到目前為止，已經(jīng)有超過25萬個(gè)樣本使用QF-PCR 檢測(cè)，雖然不同的中心使用的試劑盒不同，但它的結(jié)果是真實(shí)可靠的，沒有假陽性和假陰性結(jié)果。

目前還沒有關(guān)于QF-PCR 的假陽性報(bào)道，在許多國(guó)家和機(jī)構(gòu)將其作為一種是否終止妊娠的依據(jù)，而不需要等待核型分析的結(jié)果。

2.3 多重連接探針擴(kuò)增技術(shù) 包括QF-PCR 在內(nèi)，多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)（MLPA）是第二種以PCR 為基礎(chǔ)的檢測(cè)非整倍體染色體疾病的方法。它是一種以PCR 為基礎(chǔ)的多樣化的方法，主要是用來決定反應(yīng)管中超過50個(gè)基因的DNA 或RNA 序列的拷貝數(shù)［8］。這個(gè)技術(shù)應(yīng)用廣泛，其中SALSA P095試劑盒是專門用來檢測(cè)產(chǎn)前診斷中常見非整倍體疾病的。

在這個(gè)試劑盒中，13、18、21、X 染色體均分別對(duì)應(yīng)8個(gè)基因座，而Y 染色體對(duì)應(yīng)4個(gè)基因座。正如用QF-PCR 檢測(cè)單位點(diǎn)的結(jié)果需要與相同樣本的基因座結(jié)果相比較，同樣，用MLPA 檢測(cè)單位點(diǎn)的結(jié)果也需要有相應(yīng)的對(duì)照，這個(gè)對(duì)照是指檢測(cè)二倍體DNA 樣本的相同基因座的結(jié)果，最終得出一比率。如果這個(gè)比率接近于1，那么該基因座中DNA的量與對(duì)照組是相同的，即也是二倍體。如果該比率＜0.7或＞1.3，那么該基因座中DNA 的量就會(huì)少于或多于對(duì)照組。故而，依據(jù)8個(gè)（13，18，21和X）或4個(gè)（Y）染色體基因座的結(jié)果就能算出相關(guān)染色體拷貝數(shù)。

與FISH 和QF-PCR 相比，MLPA 不能檢測(cè) 出女性的三倍體。因?yàn)椴还茉谡Ｅ赃€是三倍體女性染色體中，X 染色體和常染色體的Ratio值是相同的。然而，三倍體的女性胎兒均伴有超聲的異常，因此可通過超聲診斷來預(yù)防三倍體患兒的出生。

就像FISH 和QF-PCR，在許多實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)將MLPA 作為決定是否終止妊娠的依據(jù)，而不需要等待核型分析來確診［9］。

3 困難和策略

3.1 絨毛膜絨毛 絨毛存在于不同的細(xì)胞系中：即細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞系和間充質(zhì)核細(xì)胞系，這種現(xiàn)象將影響絨毛的分子生物學(xué)研究。核型分析表明，這些細(xì)胞系之間可能會(huì)出現(xiàn)遺傳差異。

熒光定量PCR（QF-PCR）和核型分析結(jié)果之間的微小差異已有報(bào)道。在大多數(shù)情況下，研究的僅僅是單一的絨毛膜絨毛，而與絨毛膜絨毛相關(guān)的嵌合現(xiàn)象可引起結(jié)果的微小差異［10，11］。

Mann等［12］研究表明，將細(xì)胞滋養(yǎng)層的外層用消化酶去掉后，僅對(duì)從間質(zhì)核細(xì)胞分離出的DNA進(jìn)行MLPA，MLPA 的結(jié)果與核型分析的結(jié)果完全一致。這些核型分析的樣本來源于相同細(xì)胞型分裂中期的細(xì)胞（長(zhǎng)期培養(yǎng)分析）。Kooper等［13］研究了7個(gè)絨毛膜絨毛的MLPA 資料。這些資料表明，不管是短期培養(yǎng)還是長(zhǎng)期培養(yǎng)，核型分析結(jié)果均有差異。然而他們用蛋白酶K 消化整個(gè)絨毛后，導(dǎo)致了來源于滋養(yǎng)層細(xì)胞的DNA 過表達(dá)（在短期培養(yǎng)中）。并且用酶消化法分離了來源于間質(zhì)核的滋養(yǎng)層細(xì)胞，然后分離出來的DNA 進(jìn)行了MLPA 檢測(cè)和核型分析，并且盡量均行短期與長(zhǎng)期細(xì)胞培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)MLPA 的結(jié)果與核型分析的結(jié)果一致。這表明，經(jīng)酶消化產(chǎn)生的細(xì)胞碎片與用于核型分析的碎片結(jié)構(gòu)差不多。

3.2 母細(xì)胞污染 在產(chǎn)前診斷中一個(gè)最常見的現(xiàn)象是母體細(xì)胞的污染。因?yàn)槟阁w的細(xì)胞不能或很難在長(zhǎng)期培養(yǎng)中生長(zhǎng)，因此一般不會(huì)影響核型分析的結(jié)果。然而，在理論上，這一現(xiàn)象可影響分子學(xué)的方法（包括FISH），因?yàn)檫@些檢驗(yàn)用的材料是未經(jīng)培養(yǎng)的細(xì)胞。

包括應(yīng)用QF-PCR，我們希望能夠通過放大的高度多態(tài)性的STRs序列來發(fā)現(xiàn)新的等位基因或者在所有染色體之間非對(duì)稱性的特征型基因。這些序列一般不同于正常的、三體的或者三倍體的序列。所以可依據(jù)這些序列來進(jìn)行檢測(cè)，而不存在誤診的情況。正因?yàn)檫@樣，在生長(zhǎng)緩慢的CVS 培養(yǎng)中，QF-PCR 有助于分別出正常的母體核型來確定所檢測(cè)的細(xì)胞是胎兒來源的細(xì)胞，進(jìn)而排除母體細(xì)胞的過度生長(zhǎng)。

不同于QF-PCR，有人用MLPA（和FISH）研究了單拷貝基因座或染色體區(qū)的拷貝數(shù)，而不是在單位點(diǎn)上的等位基因數(shù)。結(jié)果表明，不會(huì)在女性胎兒中檢測(cè)到母細(xì)胞的污染。在男性胎兒中，僅僅X和Y 基因座的比率異常時(shí)，才懷疑母細(xì)胞污染。事實(shí)上，所有的MLPA 研究均有可能因母細(xì)胞污染而導(dǎo)致誤診。然而，MLPA P095 檢測(cè)嵌合體的最低下限是-20%［13］。因此，從胎兒和母體DNA 混合物獲得的胎兒嵌合的DNA 來行MLPA 檢測(cè)，即使在母體細(xì)胞污染率高達(dá)80%時(shí)，也可能發(fā)現(xiàn)胎兒三體性疾病。

3.3 嵌合現(xiàn)象 嵌合現(xiàn)象在產(chǎn)前診斷技術(shù)中很常見，但診斷有時(shí)比較困難。對(duì)常規(guī)的核型分析來說，嵌合現(xiàn)象的檢測(cè)水平主要是由被分析細(xì)胞的數(shù)量決定的。例如，當(dāng)分析10 個(gè)分裂中期的細(xì)胞時(shí)，有26%的嵌合現(xiàn)象被排除（95%的置信區(qū)間），而當(dāng)分析12 個(gè)時(shí)，23%的嵌合現(xiàn)象被排除（95%的置信區(qū)間）。

大部分分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法能夠檢測(cè)到更低水平的嵌合現(xiàn)象，但仍有不到10%～20%的嵌合現(xiàn)象沒有被檢測(cè)到。就像核型分析一樣，在檢測(cè)2個(gè)或更多細(xì)胞系時(shí)，F(xiàn)ISH、QF-PCR 和MLPA 的靈敏度主要決定于嵌合現(xiàn)象的水平和相關(guān)的染色體。比如，應(yīng)用FISH 技術(shù)，46，XX／45X 的嵌合體能夠很容易的檢測(cè)出來；而對(duì)QF-PCR 和MLPA 來說，當(dāng)異常細(xì)胞系不足20%時(shí)，這些嵌合能夠通過X 染色體標(biāo)志的不平衡等位基因比率來識(shí)別［14］。45，X 和47，XXX 細(xì)胞等比嵌合的現(xiàn)象，不能用QF-PCR 或MLPA 檢測(cè)出來，因?yàn)檫@就像在正常的女性胎兒一樣，這些細(xì)胞產(chǎn)生了相同的等位基因比率。但是，用FISH 則可輕易檢測(cè)。

X 染色體嵌合現(xiàn)象中的一些病例中，分子生物學(xué)與細(xì)胞遺傳學(xué)關(guān)于異常細(xì)胞亞群百分率的差異，可能是由于正常（46，XX 或46，XY）和45，X 細(xì)胞生長(zhǎng)速度不同引起的，因?yàn)榉钦扼w細(xì)胞系生長(zhǎng)普遍比正常細(xì)胞快［15］。性染色體的嵌合體45，X／46，XY，盡管能夠輕易的用分子生物學(xué)方法檢測(cè)到，但是經(jīng)過細(xì)胞培養(yǎng)后常常成為單純的45，X 核型。

上述3種方法中的任何一種，理論上都可以大規(guī)模地應(yīng)用于非整倍性的檢測(cè)，但FISH 因花費(fèi)很高，并且耗時(shí)，故而QF-PCR 和MLPA 成為最通用的檢查手段，后兩者的主要優(yōu)點(diǎn)之一是自動(dòng)操作。目前，在產(chǎn)前診斷中對(duì)非整倍體染色體疾病使用快速檢測(cè)最主要的目的是提高孕期管理，或是為那些超聲顯示無明顯異常的大多數(shù)患者快速提供檢測(cè)結(jié)果，可以短時(shí)間內(nèi)減少焦慮和壓力。

這些快速產(chǎn)前診斷方法的使用在一些國(guó)家中仍有爭(zhēng)議，因?yàn)樽罱恍┭芯堪l(fā)現(xiàn)有些患者的超聲顯示正常且QF-PCR 檢測(cè)沒有發(fā)現(xiàn)的染色體異常，進(jìn)而出現(xiàn)了漏診的情況［16］。

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