高天慧 段芳齡 劉明月 李曉燕 戚麟

腫瘤疫苗作為手術(shù)及放療、化療的輔助治療常用來(lái)改善宿主的免疫狀態(tài)，調(diào)動(dòng)機(jī)體的免疫反應(yīng)，殺滅殘留在體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞。但是由于放療、化療的毒副作用及癌癥本身，患者的免疫系統(tǒng)往往處于抑制狀態(tài)，同時(shí)腫瘤抗原性弱，腫瘤細(xì)胞表達(dá)的MHC-I類分子減少或缺如，不能有效地將腫瘤抗原提呈給CD+8T細(xì)胞，因此，單純用腫瘤抗原進(jìn)行免疫治療，往往不能誘導(dǎo)有效的抗腫瘤免疫反應(yīng)。本研究采用新城疫病毒(Newcastle Disease Virus，NDV)losota株來(lái)修飾H22肝癌細(xì)胞，并將NDV修飾的H22肝癌細(xì)胞可溶性抗原(NDV-H22抗原)與免疫增強(qiáng)劑β-欖香烯共包于脂質(zhì)體中，以期得到更進(jìn)一步的抗瘤效應(yīng)，為臨床抗肝癌治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 BalB/c純系小鼠，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)為SYXK(豫)2005-0012，4-6周齡，體重16～18 g，健康，清潔級(jí)飼養(yǎng)，60只，雌雄各半;小鼠 H22肝癌細(xì)胞由BalB/c小鼠腹腔傳代，引自河南省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所;新城疫病毒losota株由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)學(xué)院微生物教研室盧中華教授惠贈(zèng)。大豆卵磷脂(PC)，上海油脂一廠;膽固醇(CH)，日本株式會(huì)社;十八烷氨(SA)，sigma;牛血清白蛋白，B1B公司;新生小牛血清，天津正江高新技術(shù)開(kāi)發(fā)公司;淋巴細(xì)胞分離液，上海勁馬生物科技有限公司;β-欖香烯，大連金港制藥有限公司。Beckman高速低溫離心機(jī)，Beckman公司;Eppendorf高速低溫離心機(jī)C5417R，Eppendorf公司;CO2培養(yǎng)箱，美國(guó)A1SCO;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海玻璃儀器二廠;倒置顯微鏡，日本OLYMPUS;酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，第四軍醫(yī)大學(xué)。

1.2 方法

1.2.1 新城疫病毒修飾H22肝癌細(xì)胞及可溶性抗原的制備參照文獻(xiàn)[1]進(jìn)行。

1.2.2 脂質(zhì)體的制備及包封率測(cè)定 參照我所建立的方法[1-3]略加改進(jìn)。

1.2.3 瘤苗的治療實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 分組 將60只 BalB/c小鼠隨機(jī)分為為3組，每組再分為兩部分，一部分用于觀察生存期，另一部分用來(lái)檢測(cè)淋巴細(xì)胞對(duì)H22肝癌細(xì)胞的體外殺傷效應(yīng)。第1組為脂質(zhì)體包裹NDV修飾的H22抗原組(LVAg組)，第2組為脂質(zhì)體共包裹β-欖香烯和H22抗原組(LEAg組)，第3組為脂質(zhì)體共包裹β-欖香烯和NDV-H22抗原組(LEVAg組)。

1.2.3.2 免疫治療程序 第1天各小鼠腹腔接種H22肝癌細(xì)胞1.1×106個(gè)/0.1 ml，24 h后腹腔接種各種疫苗0.1 ml，每毫升疫苗含3×107個(gè)H22肝癌細(xì)胞所含的抗原，第一次免疫后一周強(qiáng)化免疫一次。

1.3 淋巴細(xì)胞對(duì)H22肝癌細(xì)胞的體外殺傷試驗(yàn)

1.3.1 脾淋巴細(xì)胞懸液的制備 第二次免疫后4 d，將用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞毒作用的小鼠取出，常規(guī)腹部消毒，無(wú)菌取脾，DHanks沖洗，玻璃勻漿器勻漿后過(guò)200目金屬網(wǎng)，淋巴細(xì)胞分離液分離、制備淋巴細(xì)胞，用培養(yǎng)液調(diào)至5×105個(gè)/100 μ1。

1.3.2 脾淋巴細(xì)胞對(duì)H22肝癌細(xì)胞的體外殺傷試驗(yàn) 參照黃永年[4]等的方法進(jìn)行。

1.4 小鼠生存期的觀察 每天記錄各組小鼠存活數(shù)量，從接種之日起，連續(xù)觀察50 d，存活＞50 d者，認(rèn)為長(zhǎng)期存活。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS 11.5軟件，應(yīng)用方差分析ONEWAY-ANOVA對(duì)生存期和淋巴細(xì)胞毒活性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 KCl法提取的可溶性抗原的蛋白含量 每106個(gè) H22肝癌細(xì)胞所抽提的蛋白為107μg，每106個(gè)NDV修飾后H22肝癌細(xì)胞所抽提的蛋白為119 μg。

2.2 脂質(zhì)體的包封率 脂質(zhì)體對(duì)LVAg、LEAg、LEVAg的包封率分別39.45%，44.38%和39.45%，對(duì)β-欖香烯的包封率為81.36%。

2.3 不同免疫治療的效應(yīng)觀察

2.3.1 不同的免疫治療對(duì)BalB/c小鼠生存期的影響 對(duì)荷瘤小鼠分別用不同的疫苗制劑間隔1周進(jìn)行連續(xù)兩次的免疫后，LVAg組、LEAg組和LEVAg組的平均生存期分別為(35.2±5.5)d、(37.8±3.7)d和(45.8±3.8)d，3組間差異有顯著性(F=15.823，P＜0.001)，其中，LEVAg組的平均生存期長(zhǎng)于LVAg組(P＜0.001)和LEAg組(P＜0.001)，而后二者之間差異無(wú)顯著性(P=0.197)。

2.3.2 不同免疫治療組小鼠脾淋巴細(xì)胞體外殺傷H22肝癌細(xì)胞活性觀察 在效靶比為50:1時(shí)，LVAg組、LEAg組和LEVAg組的脾淋巴細(xì)胞毒活性分別為:(30.0±2.8)、(29.0±1.5)和(46.4±1.9)，3組間差異有顯著性(F=210.105，P＜0.001)，其中，LEVAg組的脾淋巴細(xì)胞毒活性強(qiáng)于LVAg組(P＜0.001)和LEAg組(P＜0.001)，而后二者之間差異無(wú)顯著性(P=0.322)。

3 討論

脂質(zhì)體包裹可增加抗原的顆粒性，較可溶性抗原更易被抗原提呈細(xì)胞吞噬和提呈[5]。巨噬細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)體具有優(yōu)先攝取，脂質(zhì)體包裹的抗原可經(jīng)巨噬細(xì)胞的MHC-Ⅰ途徑激活T細(xì)胞，發(fā)揮主要的抗瘤作用，同時(shí)又可經(jīng)MHC-Ⅱ途徑激活CT細(xì)胞，T細(xì)胞(包括Th細(xì)胞)被激活后釋放細(xì)胞因子，一方面促進(jìn)激活的T細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，另一方面促進(jìn)B細(xì)胞產(chǎn)生體液免疫，促進(jìn)機(jī)體的抗瘤免疫作用。

病毒用于抗腫瘤免疫治療最初源于“病毒異種化作用”的概念，即通過(guò)使腫瘤細(xì)胞表面帶有外來(lái)病毒相關(guān)抗原，增強(qiáng)其免疫原性，易于為宿主的免疫系統(tǒng)識(shí)別。NDV是禽類的一種副粘液病毒，對(duì)癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的親和力，可在癌細(xì)胞內(nèi)大量復(fù)制，而對(duì)正常細(xì)胞影響不大[6]。體外實(shí)驗(yàn)中，NDV致敏可顯著增加DC-CIK對(duì)于胃癌細(xì)胞株的殺傷力[7]。在臨床研究中，NDV修飾的自體腫瘤細(xì)胞疫苗能改善晚期結(jié)腸癌患者的生存[8]。

欖香烯為脂溶性的非細(xì)胞毒性的廣譜抗腫瘤藥物，同時(shí)又具有免疫增強(qiáng)作用。欖香烯能改變或增強(qiáng)腫瘤抗原的免疫原性，誘發(fā)或促進(jìn)機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫排斥作用[9]。此外，欖香烯能顯著提高荷瘤小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬率及吞噬指數(shù)，增強(qiáng)CONA誘導(dǎo)的小鼠脾細(xì)胞的增殖，增加NK細(xì)胞的活性[10]。

本研究用NDV修飾脂質(zhì)體瘤苗，以增強(qiáng)腫瘤抗原的免疫原性，更易為宿主識(shí)別，同時(shí)用免疫增強(qiáng)劑欖香烯來(lái)刺激機(jī)體免疫反應(yīng)，獲得了最強(qiáng)的抗瘤免疫效應(yīng)，顯著高于單用NDV修飾脂質(zhì)體瘤苗和單用欖香烯修飾脂質(zhì)體瘤苗，提示二者的協(xié)同增效作用。免疫效應(yīng)的增強(qiáng)可能源于欖香烯的免疫增強(qiáng)作用，NDV的抗原異源化作用，以及脂質(zhì)體包裹后的抗原提呈的作用的加強(qiáng)。共包裹欖香烯和NDV修飾的脂質(zhì)體肝癌瘤苗有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值，為抗肝癌治療提供有效的補(bǔ)充手段，值得臨床進(jìn)一步研究。

[1]高天慧，段芳齡，劉明月.NDV修飾對(duì)H22肝癌細(xì)胞脂質(zhì)體瘤苗免疫作用影響的觀察.中華腫瘤防治雜志，2011，18(3):180-182.

[2]高天慧，段芳齡，高海玲，等.脂質(zhì)體瘤苗抗小鼠H22腹水型肝癌作用研究.胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志，2005，14(4):366-368.

[3]高天慧，段芳齡，周云，等.β-欖香烯對(duì)脂質(zhì)體瘤苗抗小鼠H22肝癌的免疫增強(qiáng)作用.中國(guó)誤診學(xué)雜志，2005，12(5):3409-3411.

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