周文麗 朱樑

一、背景

終末期肝?。╡nd stage liver disease，ESLD）指各種原因如肝炎、肝硬化、肝癌、藥物性肝損傷和自身免疫肝病等導(dǎo)致肝功能極度減退甚至衰竭的一種病理狀態(tài)。它是很多肝臟疾病的終末狀態(tài)，預(yù)后較差，在發(fā)展中國(guó)家的發(fā)病率逐年上升[1]。目前治療肝癌或終末期肝病的理想方案是肝移植[2]，但是供肝不足和免疫排斥是目前移植的兩大難題[3],因此尋找其他高效的替代治療措施顯得尤為重要。近年來干細(xì)胞生物學(xué)研究取得了很多進(jìn)展，能為細(xì)胞移植和生物人工肝提供充足的高活力的肝細(xì)胞，這為ESLD的治療帶來了希望。

目前可用于ESLD治療的細(xì)胞主要包括雙能干細(xì)胞（如肝母細(xì)胞和卵圓細(xì)胞）、多能干細(xì)胞（pluripotent stem cells，PSCs）、由干細(xì)胞分化而來的肝細(xì)胞、人原代肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞株等。但隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)了一些細(xì)胞在細(xì)胞治療方面的局限性，如卵圓細(xì)胞缺乏特異性的表面標(biāo)記、體外擴(kuò)增能力較差，人原代肝細(xì)胞來源有限、壽命較短等。因此研究者將目光轉(zhuǎn)向了PSCs。PSCs目前沒有一個(gè)明確和統(tǒng)一的定義,常指具有分化成多種細(xì)胞潛能的干細(xì)胞系細(xì)胞。廣義的PSCs包括胚胎干細(xì)胞（human embryonic stem cells ，hESCs）、誘導(dǎo)多分化潛能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）以及間充質(zhì)干細(xì)胞等；狹義的PSCs主要指hESCs和iPSCs，這也是本文討論的重點(diǎn)。

hESCs來源于植入前囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，具有體外無限增殖能力且能在特定條件下分化為多類成體組織或胚外組織的細(xì)胞群體[4-5]。Rambhatla等[6]首次報(bào)道了hESCs直接分化產(chǎn)生肝細(xì)胞樣細(xì)胞(hepatocyte-like cells,HLCs) ，此后很多實(shí)驗(yàn)室建立了不同的實(shí)驗(yàn)方案以生成HLCs。胚胎小體（embryoid body，EB）形成可使hESCs分化成包括肝細(xì)胞在內(nèi)的很多類細(xì)胞。然而由于EB分化的不可控性，現(xiàn)在人們廣泛采用單層細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)使hESCs直接分化為肝細(xì)胞，該方法能從hESCs高效獲得HLCs 或肝細(xì)胞[7]。Yamanaka等[10]采用體外基因轉(zhuǎn)染技術(shù)從24個(gè)基因中篩選出Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4等4個(gè)參與維持細(xì)胞多分化潛能的轉(zhuǎn)錄因子，隨后成功地將成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)成iPSCs[8-9]。隨著研究的深入，目前已逐漸建立了iPSCs向肝細(xì)胞分化的有效模型。

hESCs和iPSCs技術(shù)的發(fā)展為肝再生醫(yī)學(xué)開辟了新紀(jì)元，PSCs能分化為成熟的肝細(xì)胞，可用于細(xì)胞移植和生物人工肝等細(xì)胞治療，這也意味著用于該領(lǐng)域的細(xì)胞必須穩(wěn)定、可靠、安全。Payne等[11]發(fā)現(xiàn)在體外內(nèi)胚層和中胚層細(xì)胞以不合適的比例混合使組織穩(wěn)定性下降最終導(dǎo)致腫瘤生成。亦有研究表明在細(xì)胞移植治療小鼠模型中iPSCs對(duì)腫瘤的形成有重要影響[12]。HLCs移植后腫瘤的形成，主要原因是對(duì)肝細(xì)胞分化的過程和影響因素認(rèn)識(shí)不清，因此深入研究肝細(xì)胞分化將有利于提高細(xì)胞治療的細(xì)胞純度和肝細(xì)胞功能，降低移植后腫瘤的發(fā)生率。此外，近年來采用直接分化的方法能產(chǎn)生具有肝細(xì)胞功能的HLCs，但仍然存在一些細(xì)胞分化培養(yǎng)相關(guān)的問題，如HLCs培養(yǎng)一段時(shí)間后去分化和死亡；實(shí)驗(yàn)室分別采用自己建立的分化方案而導(dǎo)致分化微環(huán)境各不相同。在干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化過程中，組織微環(huán)境起著極為重要的作用，建立標(biāo)準(zhǔn)的ESCs和iPSCs培養(yǎng)規(guī)范，改善和優(yōu)化培養(yǎng)微環(huán)境，對(duì)保證生物醫(yī)學(xué)研究的準(zhǔn)確性和真實(shí)性，最終利用這些細(xì)胞進(jìn)行臨床應(yīng)用具有重要意義。培養(yǎng)基的配方（包括各類生長(zhǎng)因子及激素等的添加）、基質(zhì)材料對(duì)細(xì)胞支持、動(dòng)態(tài)培養(yǎng)方式與其他肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的共同培養(yǎng)等均為肝細(xì)胞分化微環(huán)境的重要因素，本文對(duì)PSCs向肝細(xì)胞的分化微環(huán)境研究進(jìn)行綜述。

二、PSCs向肝細(xì)胞分化的微環(huán)境

ESCs和iPSCs常用的分化方法分為三類：無血清和富血清培養(yǎng)基、與細(xì)胞共培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染肝臟特異性基因。早期ESCs和iPSCs采用懸浮培養(yǎng)形成EB，能為肝臟內(nèi)胚層(hepatic endoderm，HE)分化和成熟提供微環(huán)境，最終可以形成含3個(gè)胚層的細(xì)胞群,其特點(diǎn)是具有空間三維結(jié)構(gòu)，與胚胎發(fā)育過程相近[4]。但由于細(xì)胞增殖的不可控性和操作難度大而逐漸被新的分化方法所取代。近年來普遍采用PSCs直接分化的方法產(chǎn)生具有肝細(xì)胞功能的肝臟內(nèi)胚層或肝細(xì)胞樣細(xì)胞，值得提出的是iPSCs的分化絕大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室都采用ESCs的分化誘導(dǎo)條件。

在多種細(xì)胞因子的作用下，hESCs 先分化得到限定性內(nèi)胚層細(xì)胞（definitive endoderm cells，DE），進(jìn)一步分化為肝細(xì)胞等內(nèi)胚層細(xì)胞，此后肝誘導(dǎo)分化使細(xì)胞表達(dá)成熟肝細(xì)胞相關(guān)基因。肝臟細(xì)胞增殖和功能分化過程中,肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor,HGF)、制 瘤 素 (oncostatin M,OSM)、激活素和糖皮質(zhì)激素,Wnt,Notch 都起著重要的作用。D’Amour等[13]用富含Activin 培養(yǎng)基成功誘導(dǎo)肝細(xì)胞分化,Cai等[14]采用單層誘導(dǎo)結(jié)合FGF-4和BMP-2 誘導(dǎo)hESCs 獲得HLCs，用OSM進(jìn)一步誘導(dǎo)肝細(xì)胞分化成熟。Hay等[7]采用三階段培養(yǎng)方法，用Wnt3和Activin A直接誘導(dǎo)hESCs 向DE的分化，在肝誘導(dǎo)分化第三階段添加HGF 和OSM促進(jìn)肝細(xì)胞成熟，使hESCs直接分化成HLCs的效率達(dá)到90﹪。此外，一些研究團(tuán)隊(duì)亦在致力于誘導(dǎo)分化培養(yǎng)方案的改良。Shirahashi等[15]對(duì)mESC和hESC定向分化為肝細(xì)胞過程中的生長(zhǎng)和分化誘導(dǎo)條件進(jìn)行了比較、優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)在Ⅰ型膠原包被條件下利用添加有20﹪胎牛血清、胰島素和地塞米松的IMDM培養(yǎng)基有利于肝細(xì)胞的分化。Momose等[16]發(fā)現(xiàn)與膠原和明膠相比，細(xì)胞外基質(zhì)能顯著誘導(dǎo)肝細(xì)胞特異性基因的表達(dá)提高細(xì)胞色素P450代謝的活性。Tuleuov等[17]開發(fā)了新的高效細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和骨生發(fā)蛋白與纖連蛋白、I型膠原混合后點(diǎn)到玻片上作為細(xì)胞培養(yǎng)載體，此后加入肝星狀細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞分化明顯提高。從近年大量干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化的研究不難發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞分化受到多種細(xì)胞因子不同程度的調(diào)控，其中成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（fibroblast growth factors，F(xiàn)GFs）和骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morpho-genetic proteins，BMPs）家族因子在肝細(xì)胞的增殖和定向分化具有重要調(diào)控作用；明確各種細(xì)胞因子在肝細(xì)胞分化中的作用，改良分化培養(yǎng)基配方和改善細(xì)胞培養(yǎng)支持系統(tǒng)將可提高肝細(xì)胞誘導(dǎo)分化效率和肝細(xì)胞功能。

某些基因表達(dá)改變也在PSCs誘導(dǎo)肝細(xì)胞分化和再生中起著重要作用。肝細(xì)胞核因子4a(hepatocyte nuclear factor 4a,HNF4α)是肝細(xì)胞分化成熟的重要轉(zhuǎn)錄因子，上調(diào)hESCs HNF4α表達(dá)后可明顯增強(qiáng)載脂蛋白、醛縮酶B、苯丙氨酸羥化酶、TFN和視黃醇結(jié)合蛋白等基因表達(dá)[18]。Razvan等[19]發(fā)現(xiàn)肝前體細(xì)胞轉(zhuǎn)染Hnf4α ，F(xiàn)oxa2和C/ebpα后培養(yǎng)1周，誘導(dǎo)的細(xì)胞呈現(xiàn)肝細(xì)胞的上皮表型，并對(duì)與肝細(xì)胞功能相關(guān)的基因和蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)白蛋白的分泌能達(dá)到正常原代肝細(xì)胞水平，糖原儲(chǔ)備能力增強(qiáng)，但尿素生成能力與原代肝細(xì)胞相比較差。最近有研究報(bào)道大鼠成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)Gata4,Hnf1α and Foxa3和失活 p19Arf后能直接產(chǎn)生有功能的HLCs，且不會(huì)逆轉(zhuǎn)成肝前體細(xì)胞，采用該細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞移植，能使幾乎半數(shù)乙酰水解酶缺陷（人體中稱為遺傳性酪氨酸血癥）肝衰竭小鼠模型存活，且細(xì)胞移植兩個(gè)月后沒有腫瘤形成[20]。由此可見，通過調(diào)控PSCs向肝細(xì)胞分化過程中特定基因的表達(dá)，對(duì)肝細(xì)胞的分化和培養(yǎng)亦具有重要意義。

三、人肝臟發(fā)育對(duì)肝細(xì)胞分化研究的啟示

胚胎發(fā)育早期，胚層分化并形成3個(gè)胚層：外胚層、中胚層和內(nèi)胚層。內(nèi)胚層能夠分化形成肝臟、胰腺、甲狀腺和肺等；中胚層參與了肝臟間質(zhì)的形成。當(dāng)內(nèi)胚層開始分化時(shí)（人妊娠3～4周），內(nèi)胚層和中胚層的組織發(fā)生相互作用，肝憩室形成。這個(gè)階段的細(xì)胞稱為肝母細(xì)胞，開始檢測(cè)到CK19 和肝細(xì)胞抗原1（HepPar1）表達(dá)[21]。中胚層和隔間質(zhì)分泌的FGFs和BMPs在誘導(dǎo)肝細(xì)胞分化發(fā)育中發(fā)揮重要作用[22]；Wnt信號(hào)通路在此階段能發(fā)揮抑制作用以維持前腸的完整性，在肝臟初始誘導(dǎo)發(fā)育中具有重要作用[23-24]。肝臟內(nèi)胚層增厚形成圓錐狀的上皮，此后肝母細(xì)胞離開內(nèi)胚層上皮而遷移穿透隔間質(zhì)的基膜。一旦肝芽（liver bud）長(zhǎng)入肝間質(zhì)中，肝母細(xì)胞形態(tài)發(fā)生劇烈變化，失去上皮細(xì)胞的形態(tài)，在一系列的細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子作用下發(fā)生肝細(xì)胞的增殖和分化[25]。大約孕6周時(shí)，膽管清晰可見并和消化道連通，肝臟結(jié)構(gòu)更加明顯，肝血竇明顯增多。孕7～8周時(shí)CK14出現(xiàn)于肝母細(xì)胞胞漿中，其分化成肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞[21]。很多因子參與了肝臟的分化成熟，如Wnt3,HNF-1α,HNF-1β,FoxA2,HNF-4α1,HNF-6和LRH-1等參與了肝細(xì) 胞 的 分 化[7,26-28]；Wnt,HNF-1β,FoxA2,HNF-6,Sox9,and OC-2等參與了膽管細(xì)胞的分化[29]。肝細(xì)胞 (α-fetoprotein+/albumin+) 和膽管細(xì)胞 (CK-19+) 逐漸成熟，發(fā)生形態(tài)改變并逐漸具備功能，這一過程一直持續(xù)到出生后的幾周內(nèi)。

在肝臟分化成熟的發(fā)育過程中，很多因子參與肝臟的分化成熟，它調(diào)控了肝臟發(fā)育的多個(gè)階段和重要事件。目前廣泛采用的直接誘導(dǎo)分化體系絕大多數(shù)正是基于肝臟胚胎發(fā)育過程中生長(zhǎng)因子的時(shí)空變化而設(shè)計(jì)分化方案。進(jìn)一步深入研究人肝臟發(fā)育對(duì)誘導(dǎo)肝細(xì)胞分化具有重要指導(dǎo)意義，可根據(jù)正常肝臟體內(nèi)發(fā)育的規(guī)律，應(yīng)用肝臟發(fā)育所需的生長(zhǎng)因子設(shè)計(jì)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)PSCs定向高效分化為肝細(xì)胞，為臨床ESLD進(jìn)行細(xì)胞治療等應(yīng)用提供大量?jī)?yōu)質(zhì)高效的肝細(xì)胞。以Wnt3a為例，該信號(hào)通路在hESC向肝細(xì)胞分化過程中對(duì)維持肝細(xì)胞的功能具有重要作用。Wnt/β-catenin信號(hào)通路參與了胚胎向中胚層和內(nèi)胚層的發(fā)育，以及內(nèi)胚層向肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞分化過程[7,30-32]，基于這些理論很多實(shí)驗(yàn)室的肝細(xì)胞直接分化方案中Wnt3a均作為分化培養(yǎng)基中的重要成分，并獲得了形態(tài)和功能都較好的肝細(xì)胞或HLCs。

四、干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化的3D培養(yǎng)

目前世界上多數(shù)實(shí)驗(yàn)室采用2D支持系統(tǒng)進(jìn)行肝細(xì)胞的分化，大量研究表明2D培養(yǎng)亦能產(chǎn)生表達(dá)形態(tài)學(xué)、生物功能和肝細(xì)胞類似的細(xì)胞。但2D分化培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)分化產(chǎn)生的細(xì)胞存在生存期較短、肝細(xì)胞功能低下等問題。此外，自然狀態(tài)下肝臟是在三維的環(huán)境下生長(zhǎng)，采用3D培養(yǎng)系統(tǒng)有利于提高細(xì)胞基質(zhì)和因子之間的相互作用，穩(wěn)定肝細(xì)胞的表型和功能。目前常用的3D培養(yǎng)生物材料一類是天然基質(zhì)材料如膠原、透明質(zhì)酸，但這類材料化學(xué)和物理特性不穩(wěn)定，存在倫理和安全問題等。另一類是合成高分子聚合物如聚羥基乙酸、聚乳酸、聚氨酯等，這類材料大部分為生物材料，機(jī)械特性和物理特性差異較大，生物反應(yīng)特性和可降解性也各不相同，在組成、結(jié)構(gòu)等方面的設(shè)計(jì)更加靈活以適應(yīng)不同的需要?？山到馍锔叻肿幽艽龠M(jìn)組織再生，這類材料能運(yùn)輸營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)行物質(zhì)代謝，有利于大分子的轉(zhuǎn)運(yùn)，因此能有效控制細(xì)胞接種的效率。Levenberg等[33]利用聚羥基乙酸和聚乳酸共聚合形成的可降解生物支架材料對(duì)hESC分化進(jìn)行了研究,在activin A或胰島素樣生長(zhǎng)因子1的誘導(dǎo)下hESC高表達(dá)甲胎蛋白和白蛋白。Hay等[34]通過微陣列實(shí)驗(yàn)挑選出6個(gè)最有利于肝細(xì)胞的分化的polymer，進(jìn)而通過驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)與2D的人工基質(zhì)膠matrigel培養(yǎng)相比，高分子聚氨酯134（polyurethane 134）能提高肝臟功能基因表達(dá)、增強(qiáng)細(xì)胞的藥物代謝能力。這些新的細(xì)胞分化培養(yǎng)材料的應(yīng)用，為提供穩(wěn)定產(chǎn)量的肝細(xì)胞奠定了基礎(chǔ)。此外，研究者近年來對(duì)3D培養(yǎng)材料不斷改進(jìn)，采用了復(fù)合、修飾和改性的方法，如材料復(fù)合、對(duì)材料進(jìn)行尺寸和形狀特征修飾、在生物材料表面固定蛋白質(zhì)或者多肽進(jìn)行表面修飾等，以獲得能支持肝細(xì)胞分化的良好生物材料。

其他新的3D培養(yǎng)材料和技術(shù)也陸續(xù)出現(xiàn)。Miki等[35]發(fā)現(xiàn)3D動(dòng)力灌注系統(tǒng)誘導(dǎo)肝細(xì)胞分化，能顯著改善代謝能力、肝臟特異性基因和蛋白表達(dá)、肝細(xì)胞功能。Schmelzer等[36]采用3D灌注培養(yǎng)體系亦發(fā)現(xiàn)，和常規(guī)的2D培養(yǎng)相比，分化所得的肝細(xì)胞特性更加穩(wěn)定，能顯著提高細(xì)胞色素氧化酶P450的表達(dá)，增加白蛋白的分泌和降低甲胎蛋白的水平。肝細(xì)胞的動(dòng)態(tài)培養(yǎng)比靜態(tài)培養(yǎng)有著更多優(yōu)點(diǎn)，它能模擬肝臟循環(huán)保證氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的輸送，在灌流系統(tǒng)中流體機(jī)械應(yīng)力的存在能促進(jìn)肝細(xì)胞球形聚集體的形成并重建與體內(nèi)局部相似的微環(huán)境，因此能夠提高肝細(xì)胞生存時(shí)間和改善肝細(xì)胞功能。

五、總結(jié)

PSCs能分化成穩(wěn)定成熟的肝細(xì)胞，可用于細(xì)胞移植、生物人工肝等，近年來該領(lǐng)域發(fā)展較快，但肝細(xì)胞的體外分化始終是制約臨床應(yīng)用的重要因素。目前本實(shí)驗(yàn)室亦在從事PSCs向肝細(xì)胞分化的研究工作，具有較高的分化效率，分化所得的肝細(xì)胞能表達(dá)肝細(xì)胞相關(guān)基因和蛋白，但細(xì)胞活性和功能與人原代肝細(xì)胞相比依然有差距。因此如何提高干細(xì)胞向肝細(xì)胞的分化效率并獲得高活性的肝細(xì)胞是包括筆者課題在內(nèi)的很多干細(xì)胞研究工作者的焦點(diǎn)問題。在干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化過程中，組織微環(huán)境起著極為重要的作用，體外培養(yǎng)過程中微環(huán)境的變化能使肝細(xì)胞喪失正常表型和肝特異性功能，合適的微環(huán)境能提高細(xì)胞分化的效率和改善細(xì)胞功能。因此改善細(xì)胞分化的微環(huán)境如改良分化培養(yǎng)基的配方，改善基質(zhì)材料對(duì)細(xì)胞支持，采用動(dòng)態(tài)培養(yǎng)方式，與其他細(xì)胞共同培養(yǎng)等，對(duì)高效獲得有功能的肝細(xì)胞并利用其進(jìn)行生物醫(yī)學(xué)研究和臨床應(yīng)用具有重要意義。

1 Yang JD,Roberts LR.Hepatocellular carcinoma: A global view[J].Nat Rev Gastroenterol Hepatol,2010,7(8):448-458.

2 Miro JM,Laguno M,Moreno A,et al.Management of end stage liver disease (ESLD): what is the current role of orthotopic liver transplantation (OLT)?[J].J Hepatol,2006,44(1 Suppl):S140-145.

3 Haridass D,Narain N,Ott M.Hepatocyte transplantation:waiting for stem cells[J].Curr Opin Organ Transplant,2008,13(6):627-632.

4 Reubinoff BE,Pera MF,Fong CY,et al.Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro[J].Nat Biotechnol,2000,18(4):399-404.

5 Thomson JA,Itskovitz-Eldor J,Shapiro SS,et al.Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts[J].Science,1998,282(5391):1145-1147.

6 Rambhatla L,Chiu CP,Kundu P,et al.Generation of hepatocyte-like cells from human embryonic stem cells[J].Cell Transplant,2003,12(1):1-11.

7 Hay DC,Fletcher J,Payne C,et al.Highly efficient differentiation of hESCs to functional hepatic endoderm requires ActivinA and Wnt3a signaling[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2008,105(34):12301-12306.

8 Takahashi K,Tanabe K,Ohnuki M,et al.Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors[J].Cell,2007,131(5):861-872.

9 Park IH,Zhao R,West JA,et al.Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors[J].Nature,2008,451(7175):141-146.

10 Sullivan GJ,Hay DC,Park IH,et al.Generation of functional human hepatic endoderm from human induced pluripotent stem cells[J].Hepatology,2010,51(1):329-335.

11 Payne CM,Samuel K,Pryde A,et al.Persistence of functional hepatocyte-like cells in immune-compromised mice[J].Liver Int,2011,31(2):254-262.

12 Miura K,Okada Y,Aoi T,et al.Variation in the safety of induced pluripotent stem cell lines[J].Nat Biotechnol,2009,27(8):743-745.

13 D’Amour KA,Agulnick AD,Eliazer S,et al.Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm[J].Nat Biotechnol,2005,23(12):1534-1541.

14 Cai J,Zhao Y,Liu Y,et al.Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional hepatic cells[J].Hepatology,2007,45(5):1229-1239.

15 Shirahashi H,Wu J,Yamamoto N,et al.Differentiation of human and mouse embryonic stem cells along a hepatocyte lineage[J].Cell Transplant,2004,13(3):197-211.

16 Momose Y,Matsunaga T,Murai K,et al.Differentiation of monkey embryonic stem cells into hepatocytes and mRNA expression of cytochrome p450 enzymes responsible for drug metabolism: comparison of embryoid body formation conditions and matrices[J].Biol Pharm Bull,2009,32(4):619-626.

17 Tuleuova N,Lee JY,Lee J,et al.Using growth factor arrays and micropatterned co-cultures to induce hepatic differentiation of embryonic stem cells[J].Biomaterials,2010,31(35):9221-9231.

18 Li J,Ning G,Duncan SA.Mammalian hepatocyte differentiation requires the transcription factor HNF-4alpha[J].Genes Dev,2000,14(4):464-474.

19 Iacob R,Rudrich U,Rothe M,et al.Induction of a mature hepatocyte phenotype in adult liver derived progenitor cells by ectopic expression of transcription factors[J].Stem Cell Res,2011,6(3):251-261.

20 Huang P,He Z,Ji S,et al.Induction of functional hepatocyte-like cells from mouse fibroblasts by defined factors[J].Nature,2011,475:386-389.

21 Haruna Y,Saito K,Spaulding S,et al.Identification of bipotential progenitor cells in human liver development[J].Hepatology,1996,23(3):476-481.

22 Duncan SA,Watt AJ.BMPs on the road to hepatogenesis[J].Genes Dev,2001,15(15):1879-1884.

23 McLin VA,Rankin SA,Zorn AM.Repression of Wnt/betacatenin signaling in the anterior endoderm is essential for liver and pancreas development[J].Development,2007,134(12):2207-2217.

24 Gadue P,Huber TL,Paddison PJ,et al.Wnt and TGF-beta signaling are required for the induction of an in vitro model of primitive streak formation using embryonic stem cells[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2006,103(45):16806-16811.

25 Tanimizu N,Miyajima A.Molecular mechanism of liver development and regeneration[J].Int Rev Cytol,2007,259:1-48.

26 Battle MA,Konopka G,Parviz F,et al.Hepatocyte nuclear factor 4alpha orchestrates expression of cell adhesion proteins during the epithelial transformation of the developing liver[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2006,103(22):8419-8424.

27 Coffinier C,Gresh L,Fiette L,et al.Bile system morphogenesis defects and liver dysfunction upon targeted deletion of HNF1beta[J].Development,2002,129(8):1829-1838.

28 Fayard E,Auwerx J,Schoonjans K.LRH-1: an orphan nuclear receptor involved in development,metabolism and steroidogenesis[J].Trends Cell Biol,2004,14(5):250-260.

29 Lemaigre FP.Mechanisms of liver development: concepts for understanding liver disorders and design of novel therapies[J].Gastroenterology,2009,137(1):62-79.

30 Rozga J,Jeppsson B,Bengmark S.Portal branch ligation in the rat.Reevaluation of a model[J].Am J Pathol,1986,125(2):300-308.

31 Decaens T,Godard C,de Reynies A,et al.Stabilization of beta-catenin affects mouse embryonic liver growth and hepatoblast fate[J].Hepatology,2008,47(1):247-258.

32 Ober EA,Verkade H,Field HA,et al.Mesodermal Wnt2b signalling positively regulates liver specification[J].Nature,2006,442(7103):688-691.

33 Levenberg S,Huang NF,Lavik E,et al.Differentiation of human embryonic stem cells on three-dimensional polymer scaffolds[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2003,100(22):12741-12746.

34 Hay DC,Pernagallo S,Diaz-Mochon JJ,et al.Unbiased screening of polymer libraries to define novel substrates for functional hepatocytes with inducible drug metabolism[J].Stem Cell Res,2011,6(2):92-102.

35 Miki T,Ring A,Gerlach J.Hepatic differentiation of human embryonic stem cells is promoted by three-dimensional dynamic perfusion culture conditions[J].Tissue Eng Part C Methods,2011,17(5):557-568.

36 Schmelzer E,Triolo F,Turner ME,et al.Three-dimensional perfusion bioreactor culture supports differentiation of human fetal liver cells[J].Tissue Eng Part A,2010,16(6):2007-2016.