林志榮 劉祖國(guó)

1971年，Davanger和Evensen[1]觀察到在中央角膜上皮創(chuàng)傷愈合過(guò)程中存在由角膜緣往角膜中央移動(dòng)的色素性上皮細(xì)胞線，據(jù)此首次提出了角膜緣是角膜上皮細(xì)胞更新來(lái)源的假設(shè)。此后，大量實(shí)驗(yàn)證據(jù)均證實(shí)角膜上皮干細(xì)胞存在于角膜緣，包括上皮向心性遷移，角膜緣處干細(xì)胞標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)等。目前，角膜緣干細(xì)胞和存在及基本作用已被公認(rèn)。角膜緣是位于角膜與鞏膜交界處，寬約1mm的特殊區(qū)域，裂隙燈下可見(jiàn)垂直角膜邊緣的含色素嵴狀隆起，上下方角膜緣處尤甚。角膜緣處的上皮細(xì)胞層數(shù)達(dá)10～12層，排列不規(guī)則，深層基底部細(xì)胞為一層小圓柱狀或立方形細(xì)胞，與基底膜緊密相貼，核漿比大，胞核呈卵圓形。此處的基底膜向下突起，形成非均一的乳頭樣上皮結(jié)構(gòu)，即Vogt柵欄。角膜緣干細(xì)胞即位于Vogt柵欄的基底層。Vogt柵欄中的基底膜、血管、神經(jīng)、黑色素細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞，以及其他與角膜緣干細(xì)胞間接或直接作用的成分和細(xì)胞因子等，共同構(gòu)成了角膜緣干細(xì)胞的基質(zhì)微環(huán)境（microenvironment）。角膜緣干細(xì)胞（limbal stem cells，LSCs）屬單能干細(xì)胞，其分化水平低，細(xì)胞周期長(zhǎng)，擁有無(wú)限自我更新能力，在特定應(yīng)激狀態(tài)下可高度增殖，這些特性的維持高度依賴于正常微環(huán)境成分的保護(hù)和調(diào)控。LSCs定向分化產(chǎn)生一定數(shù)量可快速分裂的前體細(xì)胞，又稱過(guò)渡放大細(xì)胞（transient amplifying cells，TACs）。TACs在向角膜中央移行的同時(shí)分裂為終末分化角膜上皮細(xì)胞，形成復(fù)層化角膜上皮，處于最表層的上皮細(xì)胞則逐漸凋亡脫落。此種上皮更新是維持角膜透明性及正常視功能的基礎(chǔ)[2]。

各種原因造成角膜緣干細(xì)胞損傷或是基質(zhì)微環(huán)境異常時(shí)產(chǎn)生的病理狀態(tài)稱為角膜緣干細(xì)胞功能障礙（limbal stem cell deficiency，LSCD），以角膜上皮結(jié)膜化為主要特征。LSCD實(shí)際上包括一大類疾病，可分為原發(fā)性及繼發(fā)性。原發(fā)性LSCD多為角膜緣發(fā)育異常，如先天性無(wú)虹膜癥，先天性皮膚紅色角化癥；繼發(fā)性LSCD臨床多見(jiàn)，為物理化學(xué)因素或自身免疫異常引起的角膜緣干細(xì)胞和微環(huán)境破壞，如機(jī)械損傷、化學(xué)燒傷和Stevens Johnson綜合征等。缺損的角膜緣干細(xì)胞及微環(huán)境無(wú)法維持正常的角膜上皮更替，造成持續(xù)反復(fù)的上皮愈合不良，繼而引起基質(zhì)炎癥甚至潰瘍穿孔，最終產(chǎn)生角膜新生血管和上皮結(jié)膜化。其中，角膜上皮結(jié)膜化是診斷LSCD的最特異指標(biāo)，裂隙燈下表現(xiàn)為角膜出現(xiàn)表淺或深層新生血管及纖維血管翳，熒光素呈點(diǎn)狀著染，有時(shí)可見(jiàn)角膜緣嵴狀突起的減少或消失。活體角膜上皮結(jié)膜化的確定目前依賴于印跡細(xì)胞學(xué)或局部活檢，通過(guò)特定標(biāo)志物檢測(cè)杯狀細(xì)胞或結(jié)膜上皮細(xì)胞[3]。近年來(lái)活體激光共聚焦顯微鏡[4]及眼前節(jié)光學(xué)相干斷層掃描技術(shù)[5]等無(wú)創(chuàng)、快速的方法也逐漸應(yīng)用于LSCD的診斷，顯示了良好的應(yīng)用前景。

正確的診斷及對(duì)角膜緣受累范圍、缺損程度的準(zhǔn)確評(píng)估是制定LSCD治療策略的基礎(chǔ)。局部性LSCD與全周性LSCD，單眼LSCD與雙眼LSCD的治療策略顯然不同。然而，許多臨床上診斷為L(zhǎng)SCD的患者，其印跡細(xì)胞檢查杯狀細(xì)胞并不一定呈陽(yáng)性。這種情況常見(jiàn)于某些嚴(yán)重的化學(xué)傷，瘢痕性類天皰瘡或Stevens Johnson綜合征的患者[6]。故LSCD的準(zhǔn)確診斷實(shí)際上面臨一定的困難，尤其是在嘗試?yán)脽o(wú)創(chuàng)檢查的情況下。有學(xué)者提出可尋找特征性更好的LSCD陽(yáng)性指標(biāo)等設(shè)想，但未見(jiàn)報(bào)道。另外，印跡細(xì)胞學(xué)的結(jié)果無(wú)法反映干細(xì)胞受損程度，對(duì)制定治療策略的指導(dǎo)意義有限。因此，目前國(guó)內(nèi)對(duì)LSCD的診斷及處理仍基于其臨床特點(diǎn)，LSCD的預(yù)防、診斷及有效治療仍是眼科臨床工作中的棘手問(wèn)題之一。

長(zhǎng)期以來(lái)，LSCD的治療效果很不理想，目前仍無(wú)針對(duì)LSCD的有效治療藥物，手術(shù)仍是治療角膜緣干細(xì)胞功能障礙的惟一手段。自1989年Kenyon等[7]首次應(yīng)用角膜緣組織移植治療LSCD以來(lái)，許多學(xué)者對(duì)移植的方式和效果進(jìn)行了大量研究及改良，使這類疾病的預(yù)后有了明顯改善。這些術(shù)式[8]按手術(shù)治療的作用對(duì)象可分為恢復(fù)干細(xì)胞基質(zhì)微環(huán)境和角膜緣干細(xì)胞移植兩大類。

一、恢復(fù)干細(xì)胞基質(zhì)微環(huán)境

干細(xì)胞基質(zhì)微環(huán)境是維持干細(xì)胞功能的基礎(chǔ)。相當(dāng)一部分患者的角膜緣干細(xì)胞本身并無(wú)損害，而基質(zhì)微環(huán)境在各種因素影響下發(fā)生功能障礙。當(dāng)此種功能障礙較輕時(shí)，可行手術(shù)改善或恢復(fù)基質(zhì)微環(huán)境。目前常用的手術(shù)方式為角膜表層清創(chuàng)聯(lián)合羊膜移植術(shù)。實(shí)際上，單純角膜表層清創(chuàng)后，少數(shù)病例可恢復(fù)正常的角膜上皮更新，若聯(lián)合羊膜移植則預(yù)后更佳。該術(shù)式多應(yīng)用于局限性LSCD。盡管羊膜移植并不直接提供健康干細(xì)胞，但它可減輕急性期炎癥從而降低LSCD的發(fā)生機(jī)率，且可通過(guò)羊膜中的各種活性成份促進(jìn)角膜緣殘留干細(xì)胞功能的恢復(fù)，故可扭轉(zhuǎn)一部分的局限性LSCD。Anderson等[9]對(duì)17只局限性LSCD患眼進(jìn)行了角膜表層清創(chuàng)聯(lián)合羊膜移植，平均隨訪26個(gè)月；Kheirkhah等[10]對(duì)11只不同受累程度的LSCD患眼施行表層角膜切除術(shù)后，再進(jìn)行無(wú)縫線羊膜移植術(shù)，平均隨訪14個(gè)月。兩項(xiàng)研究中所有患眼均獲得了光滑穩(wěn)定的角膜上皮面，角膜原有混濁及新生血管明顯減輕，大部分病例視力提高。少數(shù)大范圍LSCD的患者經(jīng)分階段手術(shù)切除不同部位的角膜血管翳并移植羊膜，亦獲得了良好的角膜透明度。盡管目前仍不清楚何種范圍及程度內(nèi)的LSCD可被此類手術(shù)逆轉(zhuǎn)，但這些結(jié)果至少說(shuō)明，某些局限性LSCD不一定需要進(jìn)行干細(xì)胞移植，患眼殘存的干細(xì)胞可能在某些條件下被重新激活繼續(xù)發(fā)揮功能。

二、角膜緣干細(xì)胞移植術(shù)

(一)自體角膜緣干細(xì)胞移植

植片由結(jié)膜瓣及對(duì)應(yīng)角膜緣組成，故又稱為結(jié)膜角膜緣移植（conjunctival limbal autograft，CLAU）。CLAU主要用于單眼LSCD患者，如化學(xué)傷，部分翼狀胬肉等，是治療LSCD的首選術(shù)式。由于是從自體對(duì)側(cè)眼取材，移植后不存在免疫排斥，植片的長(zhǎng)期成活率很高，且較異體植片能更好地恢復(fù)干細(xì)胞功能及角膜透明度[11]。但長(zhǎng)期以來(lái)，取材范圍的大小一直未能獲得共識(shí)。多大范圍的植片既能有效恢復(fù)術(shù)眼的角膜緣活力，又不會(huì)破壞取材眼的正常功能。最早的CLAU采用鼻、顳側(cè)角膜緣各120°的取材范圍。由于取材范圍較大，供眼易發(fā)生如上皮下混濁、假性胬肉、絲狀角膜炎甚至角膜緣功能進(jìn)行性衰竭等并發(fā)癥。迄今已有若干臨床報(bào)告[12-13]分析了不同范圍植片CLAU及是否聯(lián)合羊膜移植的效果，平均移植成功率超過(guò)80﹪。目前認(rèn)為，180°范圍以內(nèi)的取材不會(huì)影響供眼的正常角膜緣功能，而小于90°的植片將使術(shù)眼移植成功率明顯下降。Kheirkhah等[14]報(bào)道對(duì)一例完全性LSCD患眼施行60°范圍植片的CLAU聯(lián)合羊膜移植術(shù)，術(shù)眼的角膜緣功能亦得到恢復(fù)，矯正視力由0.05提高到0.2，這是目前報(bào)道的最小有效植片。實(shí)際上，由于人眼角膜緣干細(xì)胞的密度及功能狀態(tài)在角膜緣的不同部位存在一定差異，故移植相同范圍的鼻顳側(cè)角膜緣來(lái)源的植片與上下方來(lái)源植片的預(yù)后可能有所不同。Sangwan等[15]則報(bào)道將取材范圍縮小至角膜緣2 mm×2 mm范圍的板層，并將該板層剪為8～10個(gè)碎片，將碎片均勻種植于羊膜上后再覆蓋在角膜表面的技術(shù)。此種技術(shù)簡(jiǎn)單易于操作，術(shù)后療效較為滿意。

自體角膜緣干細(xì)胞移植已逐漸成為較可靠且成熟的治療方式，但對(duì)于取材眼實(shí)為亞臨床狀態(tài)的患者，則CLAU可能造成亞健康眼角膜緣功能的下降甚至衰竭。因此，必須重視術(shù)前對(duì)取材眼角膜緣的評(píng)估。患眼的活動(dòng)性炎癥可能會(huì)降低CLAU的成功率，術(shù)前應(yīng)盡量控制炎癥或待炎癥穩(wěn)定后手術(shù)。

(二)異體角膜緣干細(xì)胞移植

對(duì)于雙眼患病及其他各種無(wú)法提供自體健康角膜緣組織的LSCD病例，只能進(jìn)行異體角膜緣干細(xì)胞移植。按植片的特點(diǎn)，可分為以下幾種。

1.活體親屬的結(jié)膜角膜緣移植（living-related conjunctival limbal allograft，lr-CLAL）：lr-CLAL的植片構(gòu)成與CLAU相同。植片取材于活體親屬角膜緣，因供受體HLA抗原較接近，排斥反應(yīng)的機(jī)率相對(duì)較低，但仍需一定的免疫抑制劑支持。Wylegala等[16]回顧分析了26只行l(wèi)r-CLAL的患眼，發(fā)現(xiàn)lr-CLAL的成功率總體略低于CLAU而高于非活體親屬來(lái)源的異體植片移植，隨訪6年后，其中14只患眼獲得一定的視力提高，7眼發(fā)生排斥。對(duì)lr-CLAL而言，供受體HLA匹配程度越高，其成功率越高。但即使HLA配型相符，仍可能存在移植失敗。

2.環(huán)形異體角膜緣移植（keratolimbal allograft，KLAL）：植片為360°環(huán)狀板層，由小部分鞏膜、全周角膜緣以及極周邊透明角膜部分組成，不包括結(jié)膜。KLAL可提供最充足的干細(xì)胞支持，術(shù)后早期成功率與CLAU相當(dāng)。目前KLAL多聯(lián)合羊膜移植術(shù)，并加用局部或全身免疫抑制劑。KLAL術(shù)后并發(fā)癥相對(duì)CLAU較多，主要是免疫排斥、青光眼等[17]。隨著隨訪時(shí)間的延長(zhǎng)，中遠(yuǎn)期移植成功率逐漸下降，主要原因仍是免疫排斥反應(yīng)[16]。即使長(zhǎng)期系統(tǒng)應(yīng)用環(huán)孢素A、他克莫司等免疫抑制劑，KLAL的遠(yuǎn)期預(yù)后仍不夠理想。免疫排斥并不是使KLAL遠(yuǎn)期成功率下降的惟一因素，嚴(yán)重的干眼、慢性炎癥、眼瞼及瞼緣的異常、高眼壓狀態(tài)等均可影響KLAL的預(yù)后[18]，故術(shù)前須對(duì)患眼進(jìn)行詳細(xì)評(píng)估，在術(shù)前或術(shù)后進(jìn)行合理的藥物控制，如應(yīng)用人工淚液及抗炎藥物等。此外，KLAL對(duì)一些特殊病例甚至無(wú)效。先天性無(wú)虹膜癥雖為KLAL的適應(yīng)證，但有報(bào)道發(fā)現(xiàn)手術(shù)治療與保守治療的最佳矯正視力遠(yuǎn)期結(jié)果卻無(wú)統(tǒng)計(jì)差異[19]，可能因?yàn)橄忍煨詿o(wú)虹膜癥者多合并其他眼內(nèi)異常，進(jìn)行角膜緣移植術(shù)后易出現(xiàn)的高眼壓、脈絡(luò)膜脫離和玻璃體積血等，極大影響了視力。

對(duì)于需要眼表重建的LSCD病例，常進(jìn)行KLAL聯(lián)合穿透性角膜移植（penetrating keratoplasty，PK）手術(shù)，但手術(shù)的時(shí)機(jī)存在爭(zhēng)議。部分學(xué)者[20]認(rèn)為，由于PK術(shù)的成功與正常的上皮更新、穩(wěn)定的淚膜等關(guān)系密切，若不先恢復(fù)角膜緣功能，則持續(xù)上皮缺損等將使PK術(shù)成功率明顯下降，即應(yīng)先進(jìn)行KLAL，再二期進(jìn)行PK術(shù)。另一部分學(xué)者[21]認(rèn)為，由于分期手術(shù)中使用的角膜緣植片和角膜植片往往來(lái)源于不同供體，總體排斥機(jī)率明顯上升，且二期PK術(shù)后往往可誘使角膜緣植片發(fā)生排斥，故應(yīng)進(jìn)行同期聯(lián)合手術(shù)。目前對(duì)手術(shù)時(shí)機(jī)的選擇標(biāo)準(zhǔn)尚需更多臨床研究數(shù)據(jù)的支持。史偉云等[22]回顧分析了進(jìn)行了KLAL同時(shí)聯(lián)合PK術(shù)的23只嚴(yán)重堿燒傷患眼數(shù)據(jù)，隨訪2年后約65﹪的患眼視力獲得一定提高，而48﹪的患眼則發(fā)生了不同程度的排斥。盡管低于國(guó)外報(bào)道的排斥率，但KLAL的總體排斥率仍然較高，并發(fā)癥較多。

3.帶鞏膜大植片穿透性角膜移植（corneoscleral transplantation，CST）：植片由全角膜、全周角膜緣及一定寬度的全層鞏膜組成。在某些眼表大范圍嚴(yán)重感染或融解時(shí)，角膜及角膜緣均受累及，角膜往往融解或變薄，單純進(jìn)行角膜緣干細(xì)胞移植或穿透性角膜移植無(wú)法解決問(wèn)題。此時(shí)，可應(yīng)用CST進(jìn)行治療。植片鞏膜部直接縫合于近角膜緣的鞏膜植床表面。此種手術(shù)雖然提供了完整的角膜和角膜緣組織，但其排斥機(jī)率很高，程度重且發(fā)生快，對(duì)免疫抑制劑不敏感，故成功率遠(yuǎn)不及KLAL及CLAU。史偉云等[22-23]報(bào)道發(fā)生排斥的時(shí)間多為術(shù)后2周至1月，免疫排斥反應(yīng)可累及植片及睫狀體等部位，造成明顯視力下降、后彈力層褶皺、角膜緣組織充血、低眼壓和淺前房等表現(xiàn)。相對(duì)而言，KLAL聯(lián)合PK術(shù)并發(fā)癥較少，預(yù)后較好。

4.帶角膜緣大植片板層角膜移植（largediameter lamellar keratoplasty，LDLK）：植片為角膜和角膜緣的前板層。當(dāng)發(fā)生LSCD且角膜部深基質(zhì)未受累時(shí)，如某些堿燒傷、蠶食性角膜潰瘍等，可進(jìn)行帶角膜緣的板層角膜移植術(shù)，又稱全板層角膜移植術(shù)。2000年，Vajpayee等[24]對(duì)9只嚴(yán)重化學(xué)傷的患眼進(jìn)行了LDLK，平均隨訪6個(gè)月，患者的癥狀、上皮修復(fù)、矯正視力及淚膜狀態(tài)等均得到一定改善，且無(wú)一例發(fā)生復(fù)發(fā)新生血管或植片排斥,但無(wú)更長(zhǎng)時(shí)間隨訪數(shù)據(jù)。后續(xù)的許多報(bào)道均顯示了LDLK的優(yōu)越性[25]。對(duì)于一些大范圍眼表淺層損傷，包括累及角膜1/2面積以上的蠶食性角膜潰瘍等，LDLK顯示了良好的治療效果。由于LDLK術(shù)未涉及內(nèi)皮，且為一次手術(shù)，故與KLAL聯(lián)合PK術(shù)等相比，排斥機(jī)率明顯降低。臨床報(bào)道眼表重建效果較好，術(shù)后并發(fā)癥多為免疫排斥及角膜基質(zhì)層混濁。

(三)體外擴(kuò)增角膜緣上皮細(xì)胞移植（ex vivo cultured limbal epithelial transplantation，CLET）

1997年P(guān)ellegrini等[26]首次報(bào)道在2例單眼堿燒傷患者的角膜表面接種體外培養(yǎng)的自體角膜緣上皮細(xì)胞，揭開了體外擴(kuò)增上皮細(xì)胞移植的序幕。它是一類從自體對(duì)側(cè)健眼，活體親屬眼或新鮮尸眼的健康角膜緣上皮部取材，將獲得的含干細(xì)胞組織塊在實(shí)驗(yàn)室條件下直接培養(yǎng)或進(jìn)行單細(xì)胞分離與擴(kuò)增，使干細(xì)胞生長(zhǎng)于特定載體上，最后與載體一起回植于患眼受損角膜緣的新興技術(shù)。由于取材的組織中真正干細(xì)胞的含量?jī)H為極少數(shù)，其余大部分細(xì)胞為分化程度較高的前體細(xì)胞和上皮細(xì)胞，故嚴(yán)格而言，此種治療方法應(yīng)稱為體外擴(kuò)增角膜緣上皮細(xì)胞移植，但目前尚有學(xué)者沿用“體外擴(kuò)增角膜緣干細(xì)胞移植”的表述。與傳統(tǒng)移植相比，CLET具有明顯的優(yōu)勢(shì)，如所需角膜緣組織范圍?。? mm×2 mm）不致影響供眼的角膜緣干細(xì)胞功能，來(lái)源靈活并可多次取材等，極大緩解了角膜緣移植手術(shù)供體來(lái)源匱乏的矛盾；擴(kuò)增的細(xì)胞植片中不含朗格漢斯細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞等抗原呈遞細(xì)胞，植片發(fā)生免疫排斥反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)大大降低。但同時(shí)有費(fèi)用相對(duì)昂貴和細(xì)胞植片長(zhǎng)期轉(zhuǎn)歸仍不明確等問(wèn)題。近年亦有體外擴(kuò)增結(jié)膜上皮細(xì)胞[27]、口腔黏膜上皮甚至毛囊細(xì)胞[28]等非角膜緣來(lái)源者用于全周LSCD治療的報(bào)道，為CLET開辟了更廣闊的供體組織來(lái)源。

理論上講，CLET適用于各種全周或局部LSCD，以及一些角膜緣較大范圍切除后（如角膜緣腫瘤切除等）。但在一些較特殊的局部干細(xì)胞功能障礙患者中，若其他治療方式療效已足夠好，則CLET不作為首選術(shù)式。例如，翼狀胬肉患者應(yīng)用單純的自體結(jié)膜移植的有效率已達(dá)79﹪～96﹪；一些局部LSCD患者，應(yīng)用SECT或羊膜移植有逆轉(zhuǎn)可能，上述情況下應(yīng)用CLET并不能提高療效，還增加了治療成本。目前，CLET多應(yīng)用于物理化學(xué)損傷所致全周LSCD，Stevens Johnson綜合征及眼瘢痕性類天皰瘡等。其中以全周LSCD的治療成功率最高。但目前尚無(wú)大樣本的隨機(jī)對(duì)照臨床實(shí)驗(yàn)研究CLET與傳統(tǒng)角膜緣移植術(shù)在療效方面的優(yōu)劣。

體外擴(kuò)增干細(xì)胞的質(zhì)量與供體眼角膜緣有關(guān)，活體來(lái)源角膜緣組織塊的體外增殖能力要好于尸眼來(lái)源[29]。另外，由于干細(xì)胞的存活及功能發(fā)揮需要基質(zhì)微環(huán)境的調(diào)控，故角膜緣干細(xì)胞的體外擴(kuò)增需要一定的載體提供類似支持。組織塊法培養(yǎng)的干細(xì)胞載體目前主要包括3T3成纖維細(xì)胞層、羊膜，或是二者的綜合。若通過(guò)單個(gè)懸浮細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增，則除了上述幾種載體，還包括各種特殊載體材料，如纖維蛋白膜和交聯(lián)膠原蛋白等，部分特殊材料的效果可與羊膜載體相當(dāng)[30]。羊膜及3T3細(xì)胞均能促進(jìn)有效干細(xì)胞的增殖并維持其“干性”(stemness)，3T3細(xì)胞與去上皮羊膜聯(lián)合使用，能使擴(kuò)增細(xì)胞的ABCG2、p63等干細(xì)胞標(biāo)志物持續(xù)表達(dá)時(shí)間明顯延長(zhǎng)[31]。羊膜易于獲得，一定時(shí)間后可自動(dòng)降解，厚度適中，是目前應(yīng)用最廣泛的載體。但不同的羊膜預(yù)處理方法對(duì)其擴(kuò)增性能有一定影響，深低溫保存的羊膜可能使干細(xì)胞發(fā)生形態(tài)及表型異常[32]。在干細(xì)胞擴(kuò)增完成后，移植的手術(shù)方法多為將干細(xì)胞-載體復(fù)合體以細(xì)胞面朝向淚膜的方式縫合至已切除結(jié)膜血管翳的角膜緣基質(zhì)處，或是將擴(kuò)增的無(wú)載體復(fù)層上皮片以基底細(xì)胞朝向角膜基質(zhì)面的方式直接放置于相同位置而不使用縫線。另外，將植片按特定大小形態(tài)切割，可移植于特定角度受累的不完全性LSCD患眼。

組織塊培養(yǎng)擴(kuò)增后的細(xì)胞群是否是真正意義上的角膜緣干細(xì)胞一直存在爭(zhēng)議。絕大多數(shù)研究報(bào)道指出[33]，擴(kuò)增后的表層細(xì)胞群表達(dá)了上皮的分化標(biāo)志物角蛋白3和12，而基底部細(xì)胞則是角蛋白3陰性，角蛋白19、整合素及p63等干細(xì)胞標(biāo)志物陽(yáng)性。這說(shuō)明擴(kuò)增后的基底部細(xì)胞多為干細(xì)胞而非角膜上皮表型。然而，正常組織中的干細(xì)胞僅占2﹪～9﹪，擴(kuò)增細(xì)胞群中干細(xì)胞比例理論上應(yīng)較低，故上述研究中的基底部細(xì)胞很可能不全是干細(xì)胞。盡管ABCG2及p63作為較特異的干細(xì)胞標(biāo)志物逐漸被廣泛應(yīng)用，但在目前仍無(wú)干細(xì)胞絕對(duì)標(biāo)志物的情況下，對(duì)擴(kuò)增細(xì)胞群進(jìn)行準(zhǔn)確的細(xì)胞表型鑒定存在困難。Kolli等[34]發(fā)現(xiàn)，在以羊膜為載體的干細(xì)胞組織塊培養(yǎng)后，離原始組織塊越遠(yuǎn)的擴(kuò)增細(xì)胞，ABCG2、p63的表達(dá)越弱，而分化標(biāo)志物CK3的表達(dá)越強(qiáng)。在同一塊植片上，不同位置的細(xì)胞分化程度不一致，若將分化程度較高的細(xì)胞群用于移植手術(shù)中，有可能影響疾病轉(zhuǎn)歸。

盡管存在各種爭(zhēng)議，體外擴(kuò)增干細(xì)胞移植術(shù)的效果卻是明確的。術(shù)后長(zhǎng)期隨訪均顯示角膜上皮層角蛋白表達(dá)正常且無(wú)杯狀細(xì)胞。然而，移植的干細(xì)胞是否長(zhǎng)期存活，角膜上皮的正?；謴?fù)是否全部源于外來(lái)的干細(xì)胞植片卻并不清楚。Daya等[35]對(duì)10只進(jìn)行擴(kuò)增干細(xì)胞移植且LSCD成功緩解的患眼進(jìn)行了眼表細(xì)胞基因來(lái)源分析，發(fā)現(xiàn)平均隨訪9個(gè)月后，檢測(cè)到的角膜表面細(xì)胞DNA均與受體本身DNA吻合，提示修復(fù)的角膜上皮層幾乎來(lái)自受體本身而非植片上的干細(xì)胞。這說(shuō)明擴(kuò)增干細(xì)胞移植的中長(zhǎng)期作用機(jī)制可能不是直接提供干細(xì)胞，而是通過(guò)提供較健康的龕環(huán)境，使得受體本身的干細(xì)胞數(shù)量與功能逐漸得到恢復(fù)。

上述各種移植術(shù)式各有優(yōu)缺點(diǎn)和適應(yīng)證。由于各報(bào)道中LSCD病例的特點(diǎn)有所不同，如供體角膜緣的質(zhì)量，LSCD的原發(fā)病因，植床的炎癥或免疫狀態(tài)，具體術(shù)式及合并術(shù)式，既往手術(shù)史以及隨訪時(shí)間等，給合理分析帶來(lái)了困難。從這個(gè)角度講，目前多數(shù)相關(guān)報(bào)道均有相應(yīng)的局限性。但不可否認(rèn)的是近20年來(lái)關(guān)于角膜緣干細(xì)胞移植的研究已經(jīng)取得了眾多成果并仍在繼續(xù)深入。在中國(guó)，由于供體眼球來(lái)源相對(duì)匱乏，體外擴(kuò)增角膜緣干細(xì)胞移植則顯示了良好的應(yīng)用前景。

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