黃成澤，韓玲，崔勝云

（延邊大學(xué)長白山生物資源與功能分子教育部重點實驗室，吉林 延吉133002）

5，5′－二硫硝基苯甲酸的電化學(xué)性質(zhì)及在谷胱甘肽測定中的應(yīng)用

黃成澤，韓玲，崔勝云＊

（延邊大學(xué)長白山生物資源與功能分子教育部重點實驗室，吉林 延吉133002）

利用循環(huán)伏安法研究了巰基衍生化試劑5，5′－二硫硝基苯甲酸（DTNB）在玻碳電極上的循環(huán)伏安特性.實驗發(fā)現(xiàn)，DTNB的二硫鍵在玻碳電極上出現(xiàn)了靈敏的陰極還原電流.通過分析酸度、掃描起始電位、還原型谷胱甘肽（GSH）、掃描次數(shù)對DTNB電化學(xué)性質(zhì)的影響，確立了DTNB在電極上各氧化還原峰的歸屬，并給出了電極的反應(yīng)機理.根據(jù)DTNB二硫鍵的還原峰電流隨GSH濃度的增加其線性降低的特性，建立了伏安法靈敏測定GSH含量的分析方法，該方法的測定結(jié)果與常規(guī)光度法相吻合.

5，5′－二硫硝基苯甲酸；還原型谷胱甘肽；循環(huán)伏安法；電化學(xué)分析

0 引言

還原型谷胱甘肽（GSH）在生物細胞內(nèi)分布較廣，其生物學(xué)功能包括抗氧化、助氨基酸吸收、抗衰老、抗癌、提高免疫力等［1－3］.由于生物體內(nèi)GSH含量的變化直接關(guān)系到機體的健康和疾病的發(fā)生，故檢測GSH的含量對疾病的診斷和治療具有重要的意義.目前，電化學(xué)分析方法由于其方法簡單、操作簡便等優(yōu)點被廣泛應(yīng)用于微量和痕量成分的測定.文獻［4－5］采用滴汞電極和化學(xué)

修飾電極的電化學(xué)方法測定了GSH的含量，但由于該方法需對電極進行預(yù)先化學(xué)修飾操作，并且使用有毒的汞作為工作電極，因此給分析工作帶來了諸多不便.近年來，利用各種氧化還原媒介體在固體電極上靈敏的電化學(xué)響應(yīng)來間接測定含巰基化合物的方法受到人們的關(guān)注.Robin等［6］利用鄰二苯酚類物質(zhì)作為電化學(xué)媒介體，通過測定含巰基化合物在玻碳電極表面上與媒介體親電加成產(chǎn)物產(chǎn)生的電化學(xué)響應(yīng)信號的差異，分別靈敏測定了還原型谷胱甘肽、半胱氨酸、同型半胱氨酸等含巰基化合物.Richard等［7］采用 N，N－二乙基對苯二胺作為電化學(xué)媒介體靈敏測定了半胱氨酸等含巰基化合物.

Ellman試劑（5，5′－二硫硝基苯甲酸，DTNB）通常在PBs緩沖溶液中易與巰基化合物發(fā)生衍生化反應(yīng).由于DTNB分子中與2個苯環(huán)相聯(lián)的二硫鍵和苯環(huán)上的硝基皆可在固體電極上具有靈敏的電化學(xué)響應(yīng)，同時DTNB與巰基化合物作用生成的3－羧基－4－硝基苯硫酚（TNBA）也可能具有有別于DTNB的電化學(xué)特性，這為通過測定DTNB與巰基化合物作用前后的電化學(xué)響應(yīng)的差異來確立含巰基化合物的電化學(xué)分析方法提供了可能.Mannino等［8］利用循環(huán)伏安法（玻碳電極，p H＝5的緩沖溶液中）對DTNB的電化學(xué)性質(zhì)進行研究發(fā)現(xiàn)：DTNB在固體電極上出現(xiàn)了2個陰極還原峰，并認(rèn)定該峰為硝基的還原峰；當(dāng)溶液中加入半胱氨酸（Cys）時發(fā)生衍生化反應(yīng)生成TNBA，其硝基陰極還原生成有別于DTNB的靈敏還原電流峰.Mannino等還通過TNBA硝基的還原峰電流與加入的Cys濃度之間的線性關(guān)系，建立了定量測定Cys的電化學(xué)分析方法.Manino的研究為電化學(xué)方法測定巰基化合物提供了新的思路，但對DTNB的電化學(xué)性質(zhì)，如DTNB在固體電極上氧化還原所產(chǎn)生的各峰的歸屬及酸度對電化學(xué)特性的影響，以及其他含巰基化合物的測定方法等未作詳述報道.本文以DTNB為電化學(xué)媒介體，利用其與巰基化合物衍生化反應(yīng)前后的伏安特性的變化來測定含巰基化合物，為電化學(xué)測定含巰基化合物提供新的思路.

1 實驗部分

1.1 儀器

EG＆G M273恒電位儀（美國）；玻碳電極為工作電極；鉑為對電極；Ag｜AgCl為參比電極的三電極體系；酸度調(diào)節(jié)采用p HS－3C型酸度計.CV掃描測定時在起始電位處先靜置30 min，然后再進行CV掃描.

1.2 試劑

還原型谷胱甘肽（GSH）為Sigma公司生產(chǎn)，5，5′－二硫硝基苯甲酸（DTNB）為沃凱試劑，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.0%，GSH針劑為昆明積大制藥有限公司生產(chǎn)，其他試劑均為分析純試劑，實驗用水為3次蒸餾水.

2 結(jié)果與討論

2.1 DTNB的電化學(xué)性質(zhì)

圖1為在PBs緩沖溶液中（p H＝6.8），電位窗口為0.50～－1.5 V（vs.Ag｜AgCl）范圍內(nèi)，采用不同起始電位和掃描方向測得的循環(huán)伏安圖.其中：圖1 A的起始電位為－0.3 V，圖1B的起始電位為0.5 V；圖中箭頭所指為掃描方向，掃描速率為100 m V／s；虛線所示的CV圖為空白溶液（PBs，p H＝6.8）中測定結(jié)果.

圖1 DTNB（1.0×10－4 mol／L）在不同起始電位時和不同電位窗口中的CV圖

圖1 A顯示：DTNB在起始電位（－0.3 V）向負向端掃描時，分別在Epc2＝－0.594 V，Epc3＝－0.910 V，Epc4＝－1.458 V處各出現(xiàn)了1個陰極還原峰電流；當(dāng)電位掃描至CV的正向端時，在Epa1＝0.118 V和Epc1＝0.044 V處各出現(xiàn)1個氧化還原峰.圖1 B顯示：當(dāng)起始電位設(shè)置為0.5 V并向負向端開始掃描時，CV圖中在Epc1＝0.044 V處未出現(xiàn)還原峰，說明對應(yīng)于峰電位Epa1和Epc1的氧化還原電流是由DTNB的陰極還原產(chǎn)物在固體電極上的氧化還原過程所產(chǎn)生的.圖1表明，DTNB在固體電極上至少出現(xiàn)3個陰極還原峰，這可能是DTNB中的還原性基團的陰極還原所致（如二硫鍵或硝基）.

為了進一步探討DTNB在固體電極上的陰極還原峰的歸屬，選擇 HAc＋NaAc（p H＝4.5）緩沖溶液作為支持電解質(zhì)對DTNB進行了CV掃描，結(jié)果見圖2.其中：圖2 A的起始電位為－0.3 V，圖2 B的起始電位為0.5 V；圖中箭頭所指為掃描方向，掃速為100 m V／s；虛線所示的CV圖為空白溶液（p H＝4.5）中測定結(jié)果.

與圖1結(jié)果相比較，圖2中對應(yīng)于Epc2的DTNB陰極還原峰電位明顯正移，峰電流增大；對應(yīng)于Epc3的峰電位處未出現(xiàn)峰型，這使得對應(yīng)于Epc2的還原峰拖尾.同時，對應(yīng)于Epc4的還原電流出現(xiàn)了明顯的峰型，峰電位正移，峰電流增加.圖1和圖2表明：對應(yīng)于Epc2和Epc4的DTNB的陰極還原過程有質(zhì)子參與，而對應(yīng)于Epc3的陰極還原過程無質(zhì)子參與.

為了進一步探討酸度對DTNB電化學(xué)性質(zhì)的影響及DTNB各陰極還原峰的歸屬，以不同p H值的PBs緩沖溶液作為支持電解質(zhì)，分別對DTNB進行了CV掃描，結(jié)果見圖3.

圖3 DTNB（1.0×10－4 mol／L）在不同酸度的PBs緩沖溶液中的CV圖：A為p H＝7.03；B為p H＝6.63；C為p H＝6.21

圖3表明：酸度的提高使對應(yīng)于Epc2的峰電位正移，同時峰電流逐漸增大；對應(yīng)于Epc3的還原峰電流隨酸度的增大逐漸減小；對應(yīng)于Epc1和Epa1的氧化還原峰電流隨酸度的增加而增大.這一結(jié)果與圖1和圖2的分析結(jié)果類似.

DTNB分子骨架中存在硝基和二硫鍵2個還原性基團，在質(zhì)子參與下，二硫鍵陰極還原成巰基，而硝基的陰極還原過程是通過還原生成自由基的分步還原過程［9］，因此酸度的提高有利于二硫鍵的還原.Sqella［10］和 Paik［11］等在研究硝基咪唑和硝基苯的陰極還原中發(fā)現(xiàn)：硝基只在強堿性中產(chǎn)生靈敏的陰極還原電流.

2.2 電極反應(yīng)機理初探

為了進一步探討DTNB在固體電極上的電化學(xué)反應(yīng)機理，分別在PBs和HAc－Na Ac緩沖溶液中對一定濃度的DTNB進行連續(xù)CV掃描，結(jié)果如圖4所示.圖4顯示，隨著掃描次數(shù)的增加，不同酸度下的DTNB其負電位處的陰極還原峰（Epc2，Epc3，Epc4）電流從第 2 圈掃描開始明顯降低，但Epa1和Epc1的氧化還原峰電流和峰型未發(fā)生明顯的變化.這一結(jié)果說明：在第1圈CV掃描過程中，DTNB的陰極還原產(chǎn)物強烈吸附在電極表面上，導(dǎo)致電極的阻抗增加；第2圈掃描開始后，DNBA的陰極還原峰電流明顯降低.Epa1和Epc1的峰型和峰電流未隨掃描次數(shù)的增加而發(fā)生明顯的變化，這說明Epa1和Epc1峰是還原產(chǎn)物TNBA吸附在電極上的氧化還原峰.由上述結(jié)果可推知DTNB在玻碳電極上的氧化還原機理，如圖5所示.

圖4 DTNB（1×10－4 mol／L）在PBs（p H＝6.8）和Hac＋NaAc（p H＝4.2）緩沖溶液中連續(xù)3次掃描的CV圖

圖5 DTNB在玻碳電極上的氧化還原機理

2.3 GSH對DTNB電化學(xué)性質(zhì)的影響及其測定

GSH和DTNB之間發(fā)生二硫鍵的交換反應(yīng)并生成新的產(chǎn)物TNBA.由于產(chǎn)物TNBA的硝基更易在陰極還原，故DTNB在電極上的陰極還原電流和峰型會發(fā)生明顯的變化.圖6 A為在1×10－4mol／L DTNB溶液中依次加入0、1×10－5、2×10－5、3×10－5mol／L GSH 后測得的CV圖；圖6 B為在1×10－4mol／L DTNB溶液中依次加入4×10－5、5×10－5、6×10－5、8×10－5mol／L GSH時測得的CV圖.

圖6表明，DTNB的二硫鍵的還原峰（Epc2）隨著GSH濃度的增加，其峰電流線性降低，這是由于溶液中GSH和DTNB的反應(yīng)導(dǎo)致DTNB的濃度降低所致.而對應(yīng)于TNBA的硝基還原峰（Epc3），當(dāng)加入的GSH濃度相對較小時，其峰電流不發(fā)生線性變化；當(dāng)加入的GSH濃度相對較大時，其峰電流呈線性增加.這是由于在電極表面和溶液中均生成了TNBA，導(dǎo)致兩者還原動力學(xué)過程不同所致.因此，根據(jù)二硫鍵的還原峰（Epc2）的峰電流與溶液中GSH濃度之間的線性關(guān)系可準(zhǔn)確分析測定低含量的GSH.利用該原理測定了臨床用針劑中的GSH含量，其校正曲線和測定結(jié)果見圖7和表1.

圖7表明，在過量的DTNB溶液中其二硫鍵的還原峰電流與加入的GSH濃度呈良好的線性關(guān)系，其線性回歸方程為ip＝47.605－1.979 86CGSH，相關(guān)系數(shù)γ＝0.997 8.表1表明，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定GSH含量的結(jié)果與Uv－vis吸收光譜法相吻合.

圖6 DTNB溶液中加入不同濃度GSH時的CV圖

圖7 在DTNB（1×10－3 mol／L）PBs緩沖溶液中依次加入不同濃度GSH時的二硫鍵的還原電流（A）及還原峰電流與加入的GSH濃度之間的關(guān)系圖（B）

表1 針劑中GSH含量的測定結(jié)果

3 結(jié)論

本文利用循環(huán)伏安法對巰基類衍生化試劑5，5′－二硫硝基苯甲酸（DTNB）的電化學(xué)性質(zhì)進行表征發(fā)現(xiàn)：DTNB在酸性和近中性溶液中，在固體電極上出現(xiàn)靈敏的二硫鍵的還原電流和DTNB還原產(chǎn)物TNBA的還原電流；在過量DTNB的溶液中，DTNB的二硫鍵的還原電流在較寬的濃度范圍內(nèi)隨GSH含量的增加呈線性降低.利用上述結(jié)果建立了靈敏定量測定GSH的電化學(xué)分析方法，用該分析方法測定針劑中GSH含量的結(jié)果與光度法相吻合.雖然DTNB和巰基化合物的交換反應(yīng)無選擇性，但是在電極不經(jīng)任何化學(xué)修飾的條件下，利用媒介體在固體電極上靈敏的電化學(xué)響應(yīng)，即可實現(xiàn)簡便、靈敏地測定具有生物活性功能的巰基化合物，這為電化學(xué)檢測巰基類化合物提供了新的思路.

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Electrochemical properties of 5，5－dithiobis（2－nitrobenzoic acid）and application to the determination of glutathione

HUANG Cheng－ze，HAN Ling，CUI Sheng－yun＊
（KeyLaboratoryofNaturalResourcesoftheChangbaiMountain＆Functional Molecules（YanbianUniversity），MinistryofEducation，Yanji133002，China）

Electrochemical properties of 5，5－dithiobis（2－nitrobenzoic acid）（DTNB）are investigated using glassy carbon electrode with cyclic voltammetry.Sensitive reductive current is observed by reduction of disufulde bond on the electrode.Influences of acidity，initial potential，reduced glutathioe（GSH），cycling number on the cyclic voltammograms of DTNB are also investigated and electrochemical mechanism of DTNB on the glassy carbon electrode are proposed accordingly.Linearly decreasing reduction current of disulfide bond of DTNB with the increasing concentration of GSH are observed.According to the linearship between reduction current and GSH concentration，novel electrochemical detection method of GSH are established.The determination results are consistent with those determined by spectrometric method.

5，5－dithiobis（2－nitrobenzoic acid）；reduced glutathion；cyclic voltammetry；electroanalytical chemistry

O657.1

A

1004－4353（2012）01－0059－05

2012－02－26

＊通信作者：崔勝云（1957—），男，教授，研究方向為生物有機分析.