鐘華林 唐安洲 謝利紅

鼻咽癌是我國南方比較常見的惡性腫瘤之一，占頭頸部腫瘤發(fā)病率的首位，目前放射治療是鼻咽癌的主要治療手段。感音神經性聾是鼻咽癌放療后常見的并發(fā)癥，其發(fā)病機理尚未明確，目前多數學者認為放療后感音神經性聾與放射線引起的耳蝸損傷有關[1～3]。而鼻咽癌放射治療后感音神經性聾除與耳蝸的損傷有關外，是否也有蝸神經核損傷，目前尚未見相關報道。本研究以豚鼠為動物模型，用60Coγ射線對豚鼠耳顳部進行照射，通過觀察放療后豚鼠ABR和蝸神經核形態(tài)學以及凋亡相關蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase 3)在蝸神經核中的表達，初步探討60Co照射對蝸神經核的影響，為放療引起的感音神經性聾的中樞病變機制提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1動物分組 48只白色紅目豚鼠，體重250～300克，耳鏡檢查耳道通暢，鼓膜完整，無中耳感染，耳廓反應靈敏，雌雄不拘。隨機分為對照組(8只)與實驗組(40只)，實驗組于60Coγ射線照射后1、4、7、14、30 d(每個時間點8只豚鼠)行ABR檢查后立即處死，心臟灌流固定后取出耳蝸核，行HE及免疫組化染色。對照組不進行60Coγ射線照射，行ABR測試后，取耳蝸核行HE及免疫組化染色，方法同實驗組。

1.2方法

1.2.160Coγ射線照射方法 豚鼠經1%戊巴比妥鈉(3.5 ml/Kg)腹腔注射麻醉后固定于自制固定板上，用GWXJ80型60Co遠距離治療機對豚鼠右側耳顳部做一次性40 Gy60Coγ射線照射，輻射深度2.0 cm，照射范圍為2 cm×2 cm，自制鉛板遮蓋非照射部位。

1.2.2聽性腦干反應檢測 對照組與實驗組于實驗前、實驗組于各時間點分別行雙耳聽性腦干反應檢測。將豚鼠置于屏蔽室內，將針形正極插入顱頂正中皮下(兩側外耳道連線中點)斜向前約0.5 cm，負極置于兩側乳突，地極置于嘴唇脂肪墊；測試儀器用美國 TDT系統(tǒng)，聲刺激為短聲，最大強度90 dB SPL，頻率10次/秒,耳機固定于距外耳道口0.5 cm處，帶通濾波300～3 000 Hz，觀察時程20 ms，疊加次數1 024次。以引出波Ⅲ的最低刺激強度確定反應閾。

1.2.3心臟灌注及組織切片 各組豚鼠完成ABR測試后，將豚鼠心臟灌流固定后，斷頭取出腦干，放置于4 %多聚甲醛磷酸緩沖液中固定24小時，常規(guī)脫水石蠟包埋,耳蝸核的定位按Voitenko等[4]制定的豚鼠腦干立體定位圖譜,將蠟塊修剪后沿面神經根平面向后做切片，片厚5 μm，行HE染色及免疫組化染色。

1.2.4HE染色 石蠟切片依次經二甲苯和梯度酒精脫蠟至水，蘇木素液染5分鐘，1%鹽酸酒精分化，返藍，1%伊紅染1分鐘，蒸餾水沖洗，常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封片。

1.2.5免疫組織化學染色 石蠟切片脫蠟至水，用pH6.0的0.01 mol/L的檸檬酸鹽緩沖液煮沸修復抗原10分鐘，3%H2O2室溫20分鐘，山羊血清封閉20分鐘，加Caspase 3一抗(1:100)4 ℃孵育過夜，加通用二抗，室溫下孵育10分鐘，加三抗室溫下孵育10分鐘，DAB顯色，蘇木素復染，常規(guī)脫水、透明、封片。陰性對照染色切片用PBS 代替一抗，其他實驗步驟一樣。Caspase 3的陽性表達為細胞漿呈棕黃色染色。通過IPP6圖像分析軟件計算其灰度值，灰度值越低，表示細胞陽性表達越強。

1.3統(tǒng)計學方法 所有實驗數據通過SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，多組均數比較采用單因素方差分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1ABR測試結果 實驗組豚鼠60Coγ射線照射后1、4、7、14、30 d ABR反應閾均升高,其中，照射后4、7、14、30 d的ABR反應閾與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，實驗組各時間點ABR波I、II、III潛伏期及I-II、II-III、I-III波間期延長,與對照組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(表1)。

2.2耳蝸核HE染色結果 光學顯微鏡下見對照組豚鼠耳蝸核神經細胞數目較多,染色均勻, 胞漿豐富，尼氏體正常,胞核和胞漿無明顯有皺縮，膠質細胞正常(圖1a)。實驗組豚鼠耳蝸核在60Coγ射線照射后1、4、7 d神經元細胞數目及染色改變不明顯，但14 d出現神經細胞腫脹,胞漿減少，著色淺淡,胞核皺縮，尼氏體減少,膠質細胞增生，數量增多(圖1b)，30 d上述改變更加明顯(圖1c)。

2.3耳蝸核組織Caspase 3免疫組化染色表達結果 對照組豚鼠耳蝸核神經元未見明顯陽性表達，實驗組豚鼠耳蝸核神經元Caspase 3呈現較強陽性表達，60Coγ射線照射后不同時間點耳蝸核神經細胞的Caspase 3灰度值與對照組比較差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)(表2、圖2)。

表1 實驗組與對照組ABR 各波潛伏期(ms)、波間期(ms) 及反應閾( dB SPL) 比較

注：*與對照組比較,P<0.05

圖1 對照組及實驗組14、30天豚鼠耳蝸核HE染色結果a 對照組耳蝸核神經元胞漿豐富，尼氏體正常(箭頭)；b 照射后14天耳蝸核神經元胞漿減少著色淺淡，尼氏體減少(箭頭)；c 照射后30天 耳蝸核胞漿減少著色淺淡，尼氏體減少(箭頭)(HE×400)

圖2 實驗組及對照組豚鼠耳蝸核Caspase 3的表達a 對照組Caspase 3無明顯陽性表達；b 照射后4天Caspase 3陽性表達 (箭頭)；c 照射后7天Caspase 3陽性表達(箭頭)(免疫組化×400)

組別灰度值對照組172.33±17.81實驗組 照射后1 d136.37±24.42* 照射后4 d94.67±15.33* 照射后7 d91.40 ± 11.71* 照射后14 d110.80±4.23* 照射后30 d123.56±32.56*

注：*與對照組比較，P<0.05

3 討論

放射治療是鼻咽癌等頭頸部惡性腫瘤的主要治療手段，放射治療后導致感音神經性聽力下降是其常見的并發(fā)癥。吳湘萍[ 5]對33例鼻咽癌患者行鼻咽癌常規(guī)放療，在放療結束6個月后行ABR檢測，發(fā)現患者ABR波I、II、III潛伏期及I-III波間期均延長，表現為感音神經性聽力下降且呈慢性進行性進展，而且不可逆，認為第Ⅷ對顱神經至橋腦水平可能受到損害。Lau等[ 6]發(fā)現鼻咽癌患者放療后1個月，其ABR波Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、V潛伏期延長，認為波Ⅱ潛伏期延長可能與腦干耳蝸核的損傷有關。秦嶺等[ 7]也報道48例鼻咽癌患者放療前后ABR的變化,其放療前ABR正常，但放療后ABR波I、III、V潛伏期均延長,也認為放療對外周聽神經和腦干都產生了損害。

范靜平等[ 8 ]用60Co γ射線對豚鼠耳顳部進行40 Gy的一次性照射后24小時，豚鼠ABR反應閾稍有提高。在放療導致感音神經性聽力下降的動物研究中，多數學者認為是由于射線導致了耳蝸毛細胞、螺旋神經節(jié)細胞及血管紋的損傷[9～11]，60Coγ射線照射后超微結構顯示內外毛細胞排列紊亂、缺失，螺旋神經節(jié)細胞萎縮或消失，發(fā)生細胞凋亡，血管紋萎縮。目前對于放療后感音神經性聽力損失的動物實驗研究多局限在內耳方面，對于射線是否引起腦干耳蝸核的損傷目前尚未見報導。研究[ 12]認為豚鼠ABR各波均有一個主要發(fā)生源,即波Ⅰ為第Ⅷ神經，波Ⅱ為耳蝸核，波Ⅲ為上橄欖核，波Ⅳ為外側丘系。本研究中發(fā)現60Coγ射線照射后4、7、14、30 d豚鼠的ABR 反應閾升高,波I、II、III潛伏期及I-II、II-III、I-III波間期延長，因而，認為波II潛伏期及II-III波間期延長可能與60Coγ射線照射引起耳蝸核的損傷有關，隨著60Coγ射線照射后時間的延長，ABR 反應閾升高更明顯，波I、II、III波潛伏期及I-II、II-III、I-III波間期延長更加明顯，提示聽力損害更加嚴重。

目前大多數研究者認為神經的損傷與細胞凋亡蛋白Caspase 3表達有關[13，14]，在正常細胞中Caspase 3以無活性的前體形式合成與儲存，當細胞進入凋亡過程中，激活Caspase 3，形成Caspase 3自我放大級聯反應，進而裂解 DNA損傷細胞。Caspase 3是細胞凋亡中的關鍵蛋白酶，本研究發(fā)現實驗組豚鼠耳蝸核在60Coγ射線照射后1、4、7 d神經元細胞數目及染色改變不明顯，但照射后14天出現神經細胞腫脹,胞漿減少著色淺淡,胞核皺縮，尼氏體減少,膠質細胞增生，數量增多，照射后30天上述改變更加明顯，Caspase 3表達明顯增強，提示60Coγ射線照射可導致耳蝸核神經元的損傷，Caspase 3表達上調可能與耳蝸核細胞的損傷有關。另外，實驗組豚鼠在60Coγ射線照射后14天耳蝸核神經元才出現形態(tài)學改變，但耳蝸核神經元Caspase 3在60Coγ射線照射后1天就開始呈現較強表達，而且照射后4天開始ABR反應閾也升高，提示60Coγ射線照射后耳蝸核神經元形態(tài)學改變可能遲于ABR及分子生物學的改變。60Coγ射線照射引起耳蝸核損傷可能與以下因素有關：①射線直接損傷耳蝸核神經元；②耳蝸損傷繼發(fā)性引起耳蝸核神經元的變性，即間接引起耳蝸核的損傷；③血管損傷導致耳蝸核神經元缺血壞死。本研究的結果提示60Coγ射線照射不僅可引起耳蝸的病變[ 11]，也可能會導致腦干耳蝸核的病變，放射治療后導致感音神經性聽力下降可能是多方面因素共同作用的結果。本研究僅提示了60Coγ射線照射對耳蝸核形態(tài)結構造成了損害,但還有許多問題須進一步的探討和完善,如延長照射后觀察時間、耳蝸損傷與耳蝸核損傷的關系、使用Caspase 3抑制劑等是否可以保護射線對腦干耳蝸核的損傷均有待進一步研究。

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