李小俠，陶正明 ，吳志剛 ，林新春，范傳潁

（1.浙江省亞熱帶作物研究所，浙江 溫州 325005；2.溫州醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，浙江 溫州 325035；3.亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地，浙江 杭州 311300）

浙南忍冬屬藥材rbcL基因序列分析

李小俠1，2，陶正明1，2，吳志剛1，林新春3，范傳潁1，2

（1.浙江省亞熱帶作物研究所，浙江 溫州 325005；2.溫州醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，浙江 溫州 325035；3.亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地，浙江 杭州 311300）

目的：分析浙南忍冬屬藥用植物葉綠體rbcL基因序列，探討其差異。方法：Primer Premier 5.0設(shè)計引物，用于rbcL基因PCR擴增，ClustalX1.83進行序列全比對。MEGA 4.0分析轉(zhuǎn)換值、顛換值等；以七子花Heptacodium miconioides為外類群，鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）和最大簡約法（Maximun Parsimony，MP）進行聚類分析（models：p-distance）；自展法（Bootstrap）檢驗各分支可信度。結(jié)果：5種忍冬屬藥材rbcL基因片段長度在1143～1167 bp之間，手工校正后長度為1137 bp，保守位點1126個，變異位點11個，簡約信息位點6個，堿基轉(zhuǎn)換和顛換分別為3和2，比值為1.6；MP和NJ兩種方法所得結(jié)果幾乎一致，均將5種忍冬屬藥材分為兩大支，黃褐毛忍冬與忍冬為第一大支，紅腺忍冬、華南忍冬和灰氈毛忍冬為第二大支。結(jié)論：rbcL基因能夠從分子水平揭示5種忍冬屬藥材的差異，為忍冬屬藥材鑒定以及系統(tǒng)發(fā)育提供重要參考依據(jù)。

忍冬屬；rbcL；序列分析；聚類分析

忍冬屬（LoniceraLinn）植物隸屬于忍冬科，為直立或攀援狀灌木，落葉或常綠、半常綠，全世界約有200種，中國有98種分布。其中忍冬Lonicera japonicaThunb.為《中國藥典》[1]中金銀花的唯一基原植物；灰氈毛忍冬Lonicera macranthiodesHand-Mazz.、紅腺忍冬Lonicera hypoglaucaMiq.、華南忍冬Lonicera confusa（Sweet） DC.以及黃褐毛忍冬Lonicera fulvotomentosaHsuetS.C.Cheng.為山銀花4種基原植物。由于金銀花與山銀花在外形上較為相似，市場上常有不法商販將山銀花冒充金銀花以高價出售，嚴重干擾了中藥材質(zhì)量，為此，近幾年學(xué)者針對金銀花和山銀花形態(tài)學(xué)以及化學(xué)成分等方面進行了研究[2-5]。但從分子水平尋找兩類藥材區(qū)別的報道較為罕見。陳大霞等[6]利用SRAP技術(shù)僅對灰氈毛忍冬自然群體遺傳多樣性進行了報道，王曉明等[7]、楊飛等[8]利用ISSR、RAPD技術(shù)對金銀花進行了遺傳多樣性研究，朱穎等[9]利用ITS序列對部分忍冬屬植物進行了系統(tǒng)發(fā)育研究，取得良好結(jié)果，但對藥典收錄的5種忍冬屬藥材僅限忍冬和華南忍冬兩種。迄今，對于藥典收錄的5種忍冬屬藥材分子水平差異以及系統(tǒng)發(fā)育等研究鮮見報道，特別是浙南地區(qū)分布有忍冬屬多種藥材資源，栽培歷史已久，但鮮見對其進行研究報道。

由于葉綠體基因組較小、單親遺傳，且不受基因的重疊、缺失及假基因的干擾，有獨立的遺傳路線，不依賴于其他任何數(shù)據(jù)即可構(gòu)建分子系統(tǒng)樹[10]，因此，葉綠體基因組逐漸成為分子進化和分子系統(tǒng)學(xué)研究的焦點。編碼核糖體1，5-二磷酸羧化酶的rbcL基因在植物葉綠體基因組中相對保守，是分子系統(tǒng)學(xué)研究中普遍應(yīng)用的基因之一，目前已成功應(yīng)用于屬間和屬內(nèi)種間系統(tǒng)關(guān)系的研究[11]。本研究從分子水平對5種忍冬屬藥材rbcL基因進行分析鑒定，以期為浙南地區(qū)忍冬屬藥材的品種鑒定提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 實驗材料來自5種藥用忍冬屬植物，野外采集其植物葉片，迅速用硅膠干燥備用，所有樣本均經(jīng)浙江省亞熱帶作物研究所陶正明副研究員鑒定（詳見表1）。

表1 實驗樣本

1.2 DNA制備 采用CTAB法提取DNA，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。DNA濃度檢測儀測定其濃度和純度，統(tǒng)一稀釋至20 ng/μL，備用。

1.3 rbcL片段的獲取 Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物，擴增rbcL基因片段，引物序列為：rbcLF：5’-TATCTTAGCGCCATTCCGAGTA-3’；rbcL-R：5’-CGCGGATAATTTCATTACCTTC-3’，并由上海Songon生物公司合成序列。

PCR擴增體系為：體系總體積20μL，其中10×Buffer（with Mg2+）2μL，dNTP（2.5μmol/L）1.6μL，Taq（5 U/μL）0.2μL，Primer（10μmol/L）1μL，DNA模板（20 ng/μL）3μL。PCR擴增程序：1個循環(huán)的94 ℃預(yù)變性3 min；35個循環(huán)的94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃復(fù)性60 s；最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。取PCR產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，2000 DL Marker為分子標(biāo)記物，經(jīng)檢測，目的條帶合格（見圖1），將其送華大基因公司純化并測序，測序方式使用兩端測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析 使用SEQMAN對rbcL序列進行編輯和拼接。ClustalX1.83比對序列，手工去除兩端測序不準(zhǔn)確堿基，將校正后序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫（GenBank Acc.No.見表1）。MEGA 4.0分析堿基序列，以七子花為外類群，鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）和最大簡約法（Maximun-Parsimony，MP）構(gòu)建5種忍冬屬藥材聚類圖（models：pdistance），Bootstrap檢驗聚類圖各分支可信度，重復(fù)次數(shù)設(shè)為1000。

圖1 rbcL基因片段的擴增

2 結(jié)果

2.1 堿基分析 5種忍冬屬藥材rbcL基因片段長度在1143～1167 bp之間，最長序列為華南忍冬，共測得1167個堿基，最短序列為忍冬，測得1143個堿基，二者長度僅相差24個堿基。經(jīng)手工去除兩端測序不準(zhǔn)確堿基后長度為1137 bp。

MEGA 4.0分析5個忍冬屬藥材rbcL序列堿基含量情況（見表2），其中黃褐毛忍冬含堿基T少于其余品種；堿基A的含量華南忍冬為25.50，略低于其余種；堿基C的含量屬忍冬最少，為24.98，其次為黃褐毛忍冬，其余種為25.15；堿基G的含量則是忍冬和黃褐毛忍冬的多于其余種；由以上數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，堿基含量變異主要體現(xiàn)在忍冬、黃褐毛忍冬與其余種之間。GC含量值差異不大，整體穩(wěn)定在45.6%左右。堿基轉(zhuǎn)換和顛換分別為3、2，二者比值為1.6，小于臨界值2.0，表明rbcL在這5個忍冬屬間相當(dāng)保守，適用于系統(tǒng)發(fā)育方面的研究。

表2 堿基組成

ClustalX1.83進行序列比對后，獲得保守位點1126個，變異位點11個，簡約信息位點6個，說明rbcL基因在這5個忍冬屬藥材中是相當(dāng)保守的。變異的11個位點在整個序列中的分布不平衡（見圖2），根據(jù)堿基變異情況，大致將整條rbcL片段分成3個區(qū)域：第一個區(qū)域為1～310 bp處，為保守區(qū)，此區(qū)域只有第144位發(fā)生一個堿基變異；第二個區(qū)域為311～582 bp處，此區(qū)域為高度變異區(qū)，在這個區(qū)域的272個堿基中，發(fā)生變異的有9個，占所有變異堿基的82%；第三個區(qū)域為583～1137 bp處，此區(qū)域只在第1050位點處發(fā)生一個堿基變異。由此看出，堿基變異的發(fā)生具有一定的不均衡性。

圖2 變異位置示意圖（1137 bp）

圖3 基于rbcL序列構(gòu)建的NJ（a）、MP（b）聚類圖

2.2 聚類分析 基于5種忍冬屬rbcL序列形成的遺傳相似系數(shù)，使用鄰接法（NJ）和最大簡約法（MP）兩種方法來構(gòu)建其聚類圖，以七子花為外類群，利用1000次重復(fù)抽樣，兩種聚類圖個分支可信度均超過50%（見圖2）。MP和NJ所得結(jié)果幾乎一致，均將5種忍冬屬藥材分為兩大支，黃褐毛忍冬與忍冬為第一大支，其分支支持率分別是57%（NJ）和81%（MP），第二大分支包括兩個組，華南忍冬單獨為一組，其分支支持率分別為97%（NJ）和79%（MP），紅腺忍冬和灰氈毛忍冬為一組，NJ和MP 對其分支支持率均為79%。

3 討論

3.1 山銀花4種基原植物關(guān)系

3.1.1 紅腺忍冬、灰氈毛忍冬、華南忍冬：2010版《中國藥典》定義山銀花植物來源有4種，即紅腺忍冬、灰氈毛忍冬、華南忍冬以及黃褐毛忍冬。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，紅腺忍冬與灰氈毛之間序列完全相同，無堿基變異，二者與華南忍冬僅在第144 bp處出現(xiàn)堿基替代。據(jù)李建軍等[4]對山銀花性狀研究：紅腺忍冬、灰氈毛忍冬、華南忍冬花的萼筒均呈橢圓形，花絲均無毛，華南忍冬萼筒有毛，與其余二者相反；華南忍冬密被糙毛及腺毛，與灰氈毛忍冬和紅腺忍冬疏毛形成對比；灰氈毛忍冬腺毛較少，與紅腺忍冬和華南忍冬多腺毛形成對比。以上形態(tài)學(xué)特征表明，紅腺忍冬與灰氈毛忍冬之間差異很小，二者與華南忍冬有一定差別。由NJ和MP產(chǎn)生的聚類圖將3者聚為一支的支持率達到97%（NJ）、79%（MP），且支內(nèi)進一步分出兩支，華南忍冬單獨為一支。3條序列的堿基差異以及進化樹的特征從分子水平揭示了這一形態(tài)學(xué)特點。但由于葉綠體基因本身相當(dāng)保守，致使rbcL基因序列幾乎無差別，不能深度區(qū)分紅腺忍冬、灰氈毛忍冬、華南忍冬較近的親緣關(guān)系，因此，對于這三者的進一步鑒定應(yīng)該在應(yīng)用rbcL序列鑒別的同時結(jié)合形態(tài)學(xué)以及其他分子標(biāo)記技術(shù)進行綜合分析。

3.1.2 黃褐毛忍冬：經(jīng)rbcL序列分析，黃褐毛忍冬與紅腺忍冬、灰氈毛忍冬、華南忍冬之間產(chǎn)生的變異堿基有8個，基于5種忍冬屬藥材rbcL序列生成的聚類圖來看，忍冬和黃褐毛忍冬以57%（NJ）和81%（MP）的支持率聚為一支，其余種聚為一支，表明黃褐毛忍冬與山銀花其余3個基原植物間差異明顯。據(jù)李建軍等[4]報道，黃褐毛忍冬萼筒呈倒卵狀橢圓形，山銀花其余種呈橢圓形；黃褐毛忍冬腺毛有兩種類型，一種較長大，一種較多小，與其余山銀花腺毛特征差異明顯[1]。相關(guān)文獻[12]報道，黃褐色毛忍冬生長適應(yīng)性強，具有花多且大、產(chǎn)量較高、其化學(xué)成分和藥理作用均與正品金銀花相似，藥理學(xué)研究也表明，黃褐毛忍冬總皂苷對實驗性肝損傷具有保護作用[13]，同時黃褐毛忍冬是2010版《中國藥典》新收錄的山銀花植物來源。鑒于以上現(xiàn)象，建議浙南地區(qū)引種黃褐毛忍冬，一方面增加浙南地區(qū)忍冬屬藥材多樣性水平，另一方面可進一步研究黃褐毛忍冬藥用價值，以緩解因金銀花價格高、產(chǎn)量低、需求大等造成的市場壓力。

3.2 金銀花基原植物 傳統(tǒng)的金銀花原植物有多種，但2005版《中國藥典》明確提出忍冬為金銀花唯一植物來源，并規(guī)定木犀草苷成分為金銀花的有效成分，與山銀花進行了區(qū)別。為此，金銀花與山銀花的鑒別成為中藥材行業(yè)的熱點。有學(xué)者通過形態(tài)學(xué)差異區(qū)別二者，金銀花的直徑大于山銀花；顏色呈淡黃色，而山銀花顏色呈黃棕色或紅棕色；金銀花顯微結(jié)構(gòu)顯示其單細胞非腺毛有兩種，一種為厚壁，一種為薄壁，而山銀花均為厚壁非腺毛[4]。熊艷等[14]利用HPLC指紋圖譜對金銀花和山銀花進行了研究，發(fā)現(xiàn)二者成分的相對含量存在明顯差別。本實驗所測得的金銀花及山銀花rbcL序列表明，忍冬與紅腺忍冬、灰氈毛忍冬、華南忍冬之間變異堿基9個，與黃褐毛忍冬間變異堿基5個，這從DNA水平揭示了金銀花與山銀花之間的差異，MP以及NJ聚類圖表明忍冬與山銀花原植物黃褐毛忍冬親緣關(guān)系較近，與其余種親緣關(guān)系較遠。有文獻[12]報道，黃褐色毛忍冬化學(xué)成分和藥理作用均與正品金銀花相似，這一結(jié)論在本實驗聚類圖中也得到印證。

3.3 rbcL序列分析在本實驗中的意義 由于葉綠體rbcL基因是其遺傳物質(zhì)DNA的一部分，在忍冬屬植物中具穩(wěn)定性，不隨季節(jié)的改變而變化，因此rbcL基因序列差別作為鑒別忍冬屬藥材提供了可靠的分子標(biāo)記。在本實驗中，rbcL能夠從DNA水平區(qū)別金銀花與山銀花藥材基原植物，為金銀花與山銀花的鑒別以及忍冬屬植物系統(tǒng)發(fā)育提供了重要分子學(xué)依據(jù)。但由于葉綠體序列的高度保守性及本實驗采樣的局限性，利用rbcL序列將5種忍冬屬藥材精確鑒別尚需要結(jié)合其他分子標(biāo)記及更全面的采樣進行深入分析。

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RbcL sequence analysis ofLonicerain the South of Zhejiang province

LI Xiaoxia*，TAO Zhengming，WU Zhigang，LIN Xinchun，F(xiàn)AN Chuanyin.
*Institute of Subtropical Crop in Zhejiang Province，Wenzhou，325005.School of Pharmacy，Wenzhou Medical College，Wenzhou，325005

Objective:To identify differentLonicerain the South of Zhejiang province by ribulose 1，5-bisphosphate carboxylase large(rbcL)gene analysis.Methods:The primers designed by Primer Premier 5.0 to amplify the rbcL. ClustalX sequenced the rbcL gene. MEGA computed the value of transitional pairs and transversional pairs. The system diagram of genetic relationship was constructed by Neighbor-Joining and Maximun Parsimony， the out-group wasHeptacodium miconioides. Bootstrap evaluated reliability of diagram.Results:1143～1167 bp nucleotide were sequenced in rbcL fromLonicraplant，and remaining 1137 bp after revision，the conserved site，varible site and Parsim-Information site were 1126 bp，11 bp and 6 bp respectively. The value of the transitional pairs and transversional pairs was 3 and 2. The Si/Sv was 1.6. Both NJ and MP could divideLonicerainto two groups，one was theLonicerajaponicaandLonicera fulvotomentosa，the other was theLonicera macranthiodes，LonicerahypoglaucaandLonicera confusa.Conclusion:The rbcl gene plays an important role in identifing the differentLoniceraplant.

Lonicera；rbcL；sequence analysis；cluter analysis

R282.12

A

1000-2138（2012）06-0549-04

2012-06-18

李小俠（1986-），女，陜西寶雞人，碩士生。

陶正明，副研究員，Email:zmtao2002@yahoo.com.cn。

丁敏嬌）

·論 著·