張慧娟，Wally Yokoyama，張暉

1(江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫，214122)2(美國農(nóng)業(yè)部西部研究所，加利福尼亞，阿爾巴尼，94710)

動(dòng)脈粥樣硬化是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致人類死亡的主要原因之一，它的作用機(jī)制并不清楚，但是各式各樣的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜑槲覀兘徊搅私鈩?dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)理提供了很好的平臺(tái)。兔子、大鼠、小鼠倉鼠、豬及其非人類的靈長類動(dòng)物都已經(jīng)被用于動(dòng)脈粥樣硬化的研究［1］。盡管沒有一種動(dòng)物模型與人體內(nèi)脂質(zhì)代謝過程完全吻合，但是大部分動(dòng)物模型都對(duì)高脂高膽固醇的喂食有很好的反應(yīng)。敘利亞金倉鼠(Mesocricetus auratus)具有膽固醇酯轉(zhuǎn)移酶和與人體相似的脂蛋白組成，以及對(duì)高脂高膽固醇飼料的敏感性，已經(jīng)被廣泛用于脂質(zhì)代謝的研究［2-4］。

膳食蛋白可降低人體內(nèi)膽固醇含量以防止動(dòng)脈粥樣疾病得到越來越多的重視［5］。許多研究表明，膳食蛋白及其酶解產(chǎn)物具有降低膽固醇活性的作用。如:大豆蛋白及其酶解產(chǎn)物［6-8］;牛乳球蛋白及其酶解產(chǎn)物等［9］;向日葵蛋白及其水解產(chǎn)物等［10］。Yang等報(bào)道了大米蛋白降低膽固醇的作用［11］，但是對(duì)于糙米蛋白及其酶解產(chǎn)物的降低膽固醇的作用鮮有報(bào)道。

糙米是去掉外殼后的全米粒，它含有皮層、糊粉層和胚芽等。與精米相比較，它含有更豐富的維生素、礦物質(zhì)及膳食纖維。本實(shí)驗(yàn)以敘利亞金倉鼠為動(dòng)物模型，以酪蛋白為對(duì)照組，研究糙米蛋白及其水解產(chǎn)物對(duì)動(dòng)物脂質(zhì)代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要材料

黃油，Odell公司;玉米油，Sunny Select公司;魚油，Sigma公司;膽固醇，Sigma公司;纖維素，Dyete公司;酪蛋白，Dyete公司;玉米淀粉，Buffalo公司;DL-蛋氨酸，ICN公司;酒石酸氫膽堿，Dyete公司;L-賴氨酸，GNC公司;L-脯氨酸，Sigma公司;維他命混合物，Dyete公司;無機(jī)鹽混合物，Dyete公司;Tirtonx-100，Calbiochem公司;甘油三酯試劑盒，Genzyme公司;總膽固醇試劑盒，Wako Chemicals公司;游離膽固醇試劑盒，Wako Chemicals公司;總膽汁酸試劑盒，Diazyme公司。

1.1.2 主要儀器

日立L-8800氨基酸分析儀，日立公司;MACRO cube CNS定氮儀，Elementar analysensyteme公司;Agilent 1100高效液相色譜儀，Agilent公司;快速脂肪提取儀，Dionex公司;Nanodrop 2000 C分光光度計(jì)，Thermo Scientific公司;冷凍干燥機(jī)，Labconco公司;CRP離心機(jī)，Beckman公司;恒溫水浴鍋，Rechert公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 糙米蛋白的制備及其酶解

取1 g糙米提取淀粉后的殘?jiān)?，加?0 mL去離子水，用0.5 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值至8.5，在50℃，300 r/min的條件下反應(yīng)2h。然后離心(3 000×g)20 min，取上清液，用0.1mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH至3.8。離心(3 000×g)20 min，沉淀物冷凍干燥。將制備所得蛋白，用Alcalase2.4 L試劑進(jìn)行酶解。酶解條件為:50℃，pH 8.5，攪拌速度300 r/min，酶解度達(dá)到18%時(shí)停止酶解反應(yīng)。將所得產(chǎn)物冷凍干燥，備用。

1.2.2 糙米蛋白基本成分分析

蛋白質(zhì)含量的測(cè)定:MACRO cube CNS定氮儀。

脂肪含量的測(cè)定:Dionex脂肪測(cè)定儀。

灰分含量的測(cè)定:AOAC 923.03。

膳食纖維含量的測(cè)定:AOAC 935.53。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及其喂食

雄性敘利亞金倉鼠購于Charles River實(shí)驗(yàn)室(Kingston Colony，Laboratory Area K62，Wilmington，MA)。動(dòng)物到達(dá)后，喂食Chow(Purina Rodent Laboratory Chow)并置于20～22℃，相對(duì)濕度為60%，12 h燈照，12 h黑暗的環(huán)境下。1周后，稱重，并隨機(jī)分組。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為3組，分別為酪蛋白對(duì)照組(C)、糙米蛋白組(RBP)、糙米蛋白酶解物組(BRPH)。用這3種飼料喂食倉鼠3周，喂食期間，每周稱其體重，每周喂食2次。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的飼料組成如表1。

表1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的飼料組成 g

1.2.4 動(dòng)物解剖

將倉鼠禁食12 h，然后麻醉窒息死亡。腹部解剖，用含有K3EDTA溶液的注射器心臟取血，然后取出肝臟和其他器官，冷凍干燥，備用。

1.2.5 肝臟中脂肪的提取及總膽固醇(TC)和游離膽固醇(FC)含量的測(cè)定

肝臟中脂肪的提取使用Dionex快速脂肪提取儀，過程如下:將約0.5 g冷凍干燥后的肝臟樣品與少量沙子混合，放于盛有沙子的提取容器內(nèi)，然后用沙子封頂，密封提取容器。將裝有樣品的提取容器放在儀器上，在60℃，2175psig條件下進(jìn)行，用3∶2(體積比)的乙醚和異丙醇溶液提取。提取結(jié)束后，在37℃條件下，用氮?dú)飧稍镏梁阒?，稱重計(jì)算脂肪含量。然后將干燥的脂肪溶于V(三氯甲烷)∶V(甲醇)=5∶2溶液，取0.55 mL容易轉(zhuǎn)移至新的試管中，加入2.2 mL，1%Triton X-100的氯仿溶液，混合均勻后，37℃，氮?dú)飧稍?。在干燥后的試管中加? mL去離子水，充分混合后在37℃恒溫水浴鍋內(nèi)靜置1 h。分別使用 FC試劑盒(Wako Chemicals公司)和TC試劑盒(Wako Chemicals公司)進(jìn)行TC和FC含量的測(cè)定。

1.2.6 倉鼠糞便的分析及其脂肪、TC、FC和膽汁酸含量的測(cè)定

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)束的前3 d，收集動(dòng)物糞便，冷凍干燥，研磨，-20℃保存?zhèn)溆?。倉鼠糞便中脂肪的提取及TC和FC含量的測(cè)定同1.2.5。

1.2.7 倉鼠糞便的膽汁酸含量的測(cè)定

根據(jù)Van Der Meer R等的方法進(jìn)行了倉鼠糞便中膽汁酸的提取和測(cè)定［12］。將干燥的糞便約50 mg和1 mL叔丁醇-水(1∶1，體積比)加入到 eppendorf試管內(nèi)，在漩渦振蕩器上混合10 s，然后放入37℃水浴振蕩器內(nèi)15 min，再次用漩渦振蕩器混合10s，最后在10 000×g速度下離心2 min，取出上清液，用Diazyme膽汁酸試劑盒進(jìn)行膽汁酸含量測(cè)定。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理

所有的數(shù)據(jù)表示為平均值±SE，數(shù)據(jù)之間的顯著性分析通過Minitab 15軟件(Minitab INC.，State college，PA，USA)的 one-way ANOVA進(jìn)行分析，其置信區(qū)間為P＜0.05。數(shù)據(jù)之間的相關(guān)性是pearson系數(shù)，通過SPSS軟件得到。

2 結(jié)果與討論

2.1 糙米蛋白基本成分分析(表2)

表2 糙米蛋白的基本組成

2.2 糙米蛋白及其酶解產(chǎn)物對(duì)倉鼠進(jìn)食量、體重及器官重量的影響

從表3可以看出，實(shí)驗(yàn)期間，倉鼠的體重增加量與肝臟重量呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)關(guān)系(r=0.991，P＜0.05)。與對(duì)照組相比較，喂食含有BRPH的倉鼠，進(jìn)食量增加了2%，而體重卻顯著降低(P＜0.05)，降低了12%，體重增加量降低了大約58%;但是BRP飼料組對(duì)倉鼠體重影響不顯著，同時(shí)，喂食BRPH飼料的倉鼠，肝臟重量降低了28.8%，但是BRP飼料組使倉鼠肝臟重量有所降低(9%)，但是未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著性的水平。對(duì)于BRPH飼料組，倉鼠的附睪脂肪分別與倉鼠體重和腹膜后脂肪呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.884，P＜0.01;r=0.874，P＜0.01)。BRP飼料組降低了倉鼠腹膜后脂肪含量，但是增加了其附睪脂肪含量。與對(duì)照組相比較，BRP飼料組對(duì)倉鼠脂肪總量無顯著影響。

表3 不同飼料對(duì)倉鼠進(jìn)食量和體重的影響

2.3 糙米蛋白及其酶解產(chǎn)物對(duì)倉鼠肝臟總脂肪含量的影響

從圖1可以看出，與對(duì)照組相比較，喂食糙米蛋白及其酶解產(chǎn)物后的倉鼠，其肝臟總脂肪含量分別降低了9%和14%。這就說明糙米蛋白可以調(diào)節(jié)倉鼠的脂質(zhì)代謝，糙米蛋白酶解產(chǎn)物則具有更好的效果，這可能是由于酶解后的低分子肽段更易于肝臟調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝。

2.4 糙米蛋白及其酶解產(chǎn)物對(duì)倉鼠肝臟TC和FC的影響

肝臟在膽固醇的合成及運(yùn)輸方面起著重要的作用，肝臟中膽固醇的含量也是影響動(dòng)脈粥樣硬化的一個(gè)重要指標(biāo)。圖2顯示出不同飼料組中倉鼠肝臟TC和FC的含量。從圖2可以看出，與對(duì)照組對(duì)比，BRP和BRPH飼料組可以顯著降低倉鼠肝臟中的膽固醇含量(P＜0.05)，降低量分別為22%和51%。這說明糙米蛋白可以降低肝臟中膽固醇的含量，但是經(jīng)過Alcalase2.4L酶解后的產(chǎn)物，其作用更為顯著。BRP和BRPH飼料組對(duì)倉鼠肝臟游離膽固醇的含量影響不顯著，因此，BRP和BRPH飼料組使倉鼠肝臟中游離膽固醇和總膽固醇的比例增加，分別為對(duì)照組的1.2倍和1.8倍。

圖1 不同飼料組對(duì)倉鼠肝臟總脂肪含量的影響

圖2 不同飼料組對(duì)倉鼠肝臟TC和FC含量的影響

2.5 糙米蛋白及其酶解產(chǎn)物對(duì)倉鼠糞便中總脂肪含量的影響

從圖3可以看出，與對(duì)照組相比較，糙米蛋白和糙米蛋白酶解物可以增加倉鼠糞便中脂肪含量，其增加量分別為98%和120%。這可能是糙米蛋白及其酶解產(chǎn)物中的不易被消化的蛋白相當(dāng)于膳食纖維的功能，促進(jìn)了糞便中脂肪含量的增加。

圖3 不同飼料組對(duì)倉鼠糞便中脂肪含量的影響

2.6 糙米蛋白及其酶解產(chǎn)物對(duì)倉鼠肝臟倉鼠糞便中TC和FC含量的影響

從圖4可以看出，與酪蛋白相比較，糙米蛋白及其酶解產(chǎn)物對(duì)糞便中TC及FC排出量有顯著影響。糙米蛋白及其酶解產(chǎn)物可以顯著提高糞便中TC含量，其增加量分別為66%和68%，它們還提高糞便中FC含量，增加量分別為60%和48%。

圖4 不同飼料組對(duì)倉鼠糞便中TC和FC含量的影響

2.7 糙米蛋白及其酶解產(chǎn)物對(duì)倉鼠肝臟倉鼠糞便中膽汁酸含量的影響

從圖5可以看出，與對(duì)照組相比較，BRP飼料組使倉鼠糞便中膽汁酸的含量增加了27%，但是未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著增加。BRPH對(duì)倉鼠糞便中膽汁酸含量無顯著影響。這可能是由于糙米蛋白更容易結(jié)合膽汁酸，促進(jìn)其排出體外。一些研究已經(jīng)表明大豆蛋白的消化性低于酪蛋白，其不易被消化的部分可能會(huì)結(jié)合膽汁酸，促進(jìn)膽汁酸排出體外［13］。

圖5 不同飼料組對(duì)倉鼠糞便中膽汁酸含量的影響

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)以酪蛋白為對(duì)照組，研究了糙米蛋白及其酶解產(chǎn)物對(duì)敘利亞金倉鼠體重、進(jìn)食量及其器官重量;肝臟總脂肪含量、TC和FC含量以及倉鼠糞便中成分的影響。膳食蛋白及其酶解產(chǎn)物的降低膽固醇的機(jī)理尚不清楚，但是有一些機(jī)制已經(jīng)被提出。機(jī)制1:膳食蛋白結(jié)合膽汁酸，使膽酸排出體外，促進(jìn)膽固醇向膽汁酸的轉(zhuǎn)化，從而降低肝臟中膽固醇的含量;機(jī)制2:在小腸內(nèi)膽固醇必須與膽汁酸和磷脂等結(jié)合，形成膠束結(jié)構(gòu)才能被小腸上皮細(xì)胞吸收，膳食蛋白有可能會(huì)破壞膽固醇的膠束結(jié)構(gòu)，使膽固醇聚集，從而阻止了膽固醇的吸收;機(jī)制3:膳食蛋白可以直接促進(jìn)脂肪的排出。從本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果來看:BRP和BRPH飼料組都可以破壞膽固醇的膠束結(jié)構(gòu)，促進(jìn)膽固醇的排出;同時(shí)它們還可以促進(jìn)脂肪的排出。盡管BRP和BRPH飼料組對(duì)倉鼠糞便中膽汁酸的排出無顯著影響，但是BRPH飼料可使糞便中膽汁酸的排出量有所增加。同時(shí)，還有研究表明，無異黃酮大豆蛋白可能降低與膽固醇代謝有關(guān)的酶(HMG-CoA還原酶)和與膽固醇吸收有關(guān)的酶(LDL-R)的mRNA表達(dá)量［14］，因此我們?cè)诤罄m(xù)實(shí)驗(yàn)中將會(huì)進(jìn)行與膽固醇代謝有關(guān)的基因的mRNA表達(dá)的研究。

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