戴紹春

胡韶山2HU Shaoshan

李 博1LI Bo

聲動力療法促腦膠質(zhì)瘤凋亡的實驗研究

戴紹春1DAI Shaochun

胡韶山2HU Shaoshan

李 博1LI Bo

目的探討聲動力療法對荷瘤鼠腦膠質(zhì)瘤組織的促凋亡作用及其治療機制。材料與方法 74只Wistar大鼠于右側(cè)尾狀核處接種C6膠質(zhì)瘤細胞，制作顱內(nèi)膠質(zhì)瘤模型，行增強MRI篩選荷瘤鼠。依MRI結(jié)果分為對照組、血卟啉甲醚組（HMME組）、超聲組和聲動力組（SDT組），每組16只。聲動力參數(shù)為1.0MHz、1.0W/cm2、60s超聲輻照和5mg/kg血卟啉甲醚。治療后24h行TUNEL染色檢測膠質(zhì)瘤細胞凋亡率，電鏡檢測凋亡形態(tài)學(xué)改變，免疫組化檢測蛋白GFAP、S-100、Bcl-2/Bax、Caspase-3、Caspase-9、Fas/Fas-L表達和Cyt c釋放，并記錄4組大鼠生存期。結(jié)果74只Wistar大鼠共68只成瘤，成瘤率為91.89%。與對照組[（3.20±0.72）%]比較，SDT組[（30.60±1.60）%]及超聲組[（14.50±0.80）%]凋亡率顯著提高（P＜0.05），HMME組[（3.60±0.51）%]無明顯凋亡發(fā)生（P＞0.05）；SDT組荷瘤鼠生存期長達（46.3±3.1）d，較對照組 [（31.1±2.1）d]顯著延長（P＜0.05），超聲組 [（32.4±2.3）d]、HMME 組[（30.1±3.0）d]生存期較對照組無明顯變化（P＞0.05）。電鏡檢測到SDT組、超聲組膠質(zhì)瘤細胞核固縮，染色質(zhì)邊集，線粒體腫脹；免疫組化顯示GFAP、S-100、Bax、Caspase-3、Caspase-9呈高表達，Bcl-2、Fas-L呈低表達和Cyt c釋放，F(xiàn)as表達無明顯變化。結(jié)論聲動力療法對荷瘤鼠膠質(zhì)瘤有促凋亡治療作用，并與線粒體內(nèi)源性凋亡途徑密切相關(guān)。

神經(jīng)膠質(zhì)瘤；超聲療法；聲動力療法；細胞凋亡；大鼠

由于腦膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)率及死亡率較高，其治療是當今神經(jīng)外科的一大難題。聲動力療法（sonodynamic therapy, SDT）是近年來興起的抗腫瘤治療方法[1]，用于腦膠質(zhì)瘤的治療取得了一定成果[2]，但多數(shù)研究局限于體外細胞水平，用于動物實驗研究少見報道。本實驗擬采用膠質(zhì)瘤原位荷瘤鼠動物模型，采用一定參數(shù)的超聲波結(jié)合血卟啉甲醚（hematoporphyrin monomethyl ether,HMME）進行治療，以檢測凋亡的發(fā)生，探討治療效果及作用機制，為臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

1.1.1 儀器 IX-70相差倒置顯微鏡（日本Olympus公司），賽福瑞多功能超生治療儀（Selfridges，北京賽福瑞德公司），磁共振掃描儀（德國Siemens，3.0T）。

1.1.2 試劑 RPMI-1640培養(yǎng)基（Sigma公司），新生小牛血清（杭州四季青公司），免疫組化試劑盒（武漢博士德公司），TUNEL試劑盒（Roche），DAB顯色試劑盒（江蘇碧云天公司），血卟啉甲醚（深圳康美公司）。

1.2 實驗動物及細胞 74只清潔級雄性Wistar大鼠，體重約200～250g，購自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院動物實驗中心（許可證號：黑動字第80050/011），于25℃、濕度＞40%的飼養(yǎng)室飼養(yǎng)，每天給予飼料及飲用水。C6膠質(zhì)瘤細胞系由中科院北京生物研究所提供，培養(yǎng)于含10%滅活新生小牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)液中，置于37℃、5% CO2飽和濕度孵箱內(nèi)孵育。

1.3 方法

1.3.1 動物模型制作 當C6膠質(zhì)瘤細胞達對數(shù)生長期時，調(diào)整細胞濃度至5×109/ml以備接種。74只Wistar大鼠用10%水合氯醛麻醉（4ml/kg），固定于立體定向儀上。在前囟后1.0mm、矢狀縫右側(cè)3.0mm處，用牙科鉆鉆一直徑1.0mm的小孔，不傷及硬腦膜，將連接于定位儀上的微量注射器的針尖調(diào)節(jié)至觸及硬腦膜，進針6mm，后退1mm，使針尖距硬腦膜5mm。將10 μl細胞懸液緩慢注入腦內(nèi)，注射時間為10min，留針5min后緩慢退針。用骨蠟封閉骨孔，生理鹽水沖洗術(shù)野，縫合皮膚，切口消毒，常規(guī)分籠飼養(yǎng)。術(shù)后每天觀察動物生存狀態(tài)。

1.3.2 增強MRI篩選荷瘤鼠及分組 為確保成瘤率，74只Wistar大鼠于接種后15d腹腔注射釓噴酸葡胺注射液（5mg/kg），行MRI俯臥橫斷位、冠狀位、矢狀位掃描及增強掃描。T1WI采用自旋回波（SE）序列；T2WI采用快速自旋回波（FSE）序列。依據(jù)MRI成瘤結(jié)果，實驗完全隨機分組，分為對照組、HMME組、超聲組、聲動力組（SDT組），每組16只。

1.3.3 SDT治療 超聲波參數(shù)固定為頻率1.0MHz、聲強1.0W/cm2、時間60s。每組隨機抽取8只荷瘤鼠于接種C6膠質(zhì)瘤細胞處開窗約2～3mm，超聲探頭與腦組織之間以生理鹽水充填后照射。超聲組照射后避光飼養(yǎng)24h；SDT組于超聲照射前1h腹腔注射HMME（5mg/kg），照射后避光飼養(yǎng)24h；HMME組單純給予HMME（5mg/kg）并避光飼養(yǎng)24h。對照組常規(guī)飼養(yǎng)24h，不給予治療。治療后各組荷瘤鼠行左心室4%多聚甲醛灌注，取完整腦進行檢測。

1.4 觀察指標 ①觀察荷瘤鼠一般狀態(tài)，包括精神面容、食欲、體重、活動量、有無偏癱、抽搐等；②增強MRI篩選荷瘤鼠：觀察荷瘤鼠膠質(zhì)瘤組織有無增強，并測量腫瘤的大??；③采用TUNEL試劑盒及電鏡，檢測聲動力治療后24h各組膠質(zhì)瘤組織細胞凋亡率；④透射電鏡觀察聲動力治療后24h各組膠質(zhì)瘤細胞的超微結(jié)構(gòu)改變；⑤采用免疫組化檢測凋亡相關(guān)蛋白GFAP、S-100、Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9表達和Cyt c釋放；⑥記錄荷瘤鼠生存時間：4組大鼠治療后每組8只繼續(xù)飼養(yǎng)，直至死亡。記錄生存時間及死亡日期，以自然死亡為標準。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 10.0軟件，計量資料組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較行Newman-Keuls檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般狀態(tài) 對照組荷瘤鼠接種C6膠質(zhì)瘤細胞2d后，各組大鼠恢復(fù)正常覓食及飲水；4d后大鼠體重開始上升，活動度、興奮度開始提高，17d左右出現(xiàn)活動度、興奮度下降等病態(tài)表現(xiàn)；超聲組和SDT組大鼠于治療后第10天活動度、興奮度開始下降；第13天覓食、飲水開始減少，體重下降，皮毛不整，其中6只荷瘤鼠出現(xiàn)偏癱；HMME組大鼠治療前后一般狀態(tài)無明顯變化，與對照組表現(xiàn)相同。

2.2 造模結(jié)果 增強MRI結(jié)果顯示，74只大鼠中有68只成瘤，成瘤率為91.89%。

2.3 增強MRI篩選荷瘤鼠 MRI顯示腫瘤位于鼠腦右側(cè)基底節(jié)區(qū)，T1WI呈低信號占位，腫瘤呈圓形或橢圓形，邊界清晰，腫瘤直徑約（8.0±0.3）mm，增強MRI掃描T1WI顯示腫瘤不均勻強化（圖1），灶周有水腫帶出現(xiàn)、中線無明顯偏移。

圖1 Wistar大鼠腦膠質(zhì)瘤MRI增強掃描。A.接種前；B.接種后15d

圖2 TUNEL染色檢測荷瘤鼠腫瘤組織細胞凋亡情況（×400）。A. 對照組；B. HMME組；C. 超聲組；D. SDT組。C、D中可見細胞凋亡，胞質(zhì)內(nèi)可見棕色顆粒

2.4 凋亡率 SDT組凋亡率達（30.60±1.60）%，明顯高于其他三組（q＝39.9、31.8、18.5,P＜0.05）（圖 2）；超聲組凋亡率為（14.50±0.80）%，顯著高于對照組[（3.2±0.72）%]及 HMME 組 [（3.6±0.51）%]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（q＝21.4、20.7,P＜0.05）；HMME組凋亡率與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（q＝8.12,P＞0.05）。

2.5 凋亡形態(tài)學(xué)改變 透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)超聲組膠質(zhì)瘤細胞核固縮，核染色質(zhì)邊集，線粒體腫脹和空泡化；SDT組細胞核嚴重固縮，染色質(zhì)進一步邊集化，大量殘留線粒體空泡化，而HMME組和對照組無明顯改變（圖3）。

圖3 電鏡下SDT后荷瘤鼠腫瘤細胞的超微結(jié)構(gòu)改變（×10 000）。A. 對照組；B. HMME組；C. 超聲組；D. SDT組。A、B中細胞膜及核膜完整，細胞器結(jié)構(gòu)清晰；C、D中膠質(zhì)瘤細胞核固縮，核染色質(zhì)邊集，線粒體腫脹和空泡化

2.6 GFAP及S-100蛋白表達 4組荷瘤鼠腫瘤組織內(nèi)均有GFAP、S-100陽性表達，腫瘤細胞胞質(zhì)內(nèi)有棕黃色染色（圖4），表明經(jīng)立體定向儀接種C6細胞大鼠腦膠質(zhì)瘤動物模型的腫瘤標本為膠質(zhì)源性腫瘤。

圖4 荷瘤鼠腫瘤組織中蛋白GFAP和S-100的表達（×400）。A、B分別示GFAP表達細胞及S-100表達細胞胞質(zhì)內(nèi)見棕色染色顆粒

2.7 凋亡相關(guān)蛋白表達 超聲組和SDT組荷瘤鼠腫瘤組織細胞胞質(zhì)內(nèi)可見棕黃色顆粒，均有Cyt-c、Bax、Caspase-3、Caspase-9表達上調(diào)，Bcl-2、Fas-L表達下調(diào)，但Fas表達無明顯變化。SDT組上述蛋白表達更為明顯，見圖5。

圖5 免疫組化半定量分析荷瘤鼠腫瘤組織凋亡蛋白的表達。與對照組及HMME組比較，*P＜0.05

2.8 荷瘤鼠存活時間 SDT組荷瘤鼠生存時間為（46.3±3.1）d，較其他三組明顯延長（q=41.2、31.8、18.5,P＜0.05），超聲組、HMME組生存期分別為（32.4±2.3）d、（30.1±3.0）d，與對照組 [（31.1±2.1）d]比較無明顯延長，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（q=18.1、17.2,P＞0.05）。

3 討論

聲動力療法由日本學(xué)者梅春晉一郎于1989年提出[1]，通過聲敏劑和超聲波的協(xié)同作用抑制腫瘤生長，此后拓展到膠質(zhì)瘤的治療中。血卟啉甲醚是提取自血液的一種有機光敏物質(zhì)，能與癌細胞蛋白結(jié)合或被癌組織中的巨噬細胞吞噬，在腫瘤組織中選擇性潴留，同時也可被電磁輻射激活，誘發(fā)一系列氧化反應(yīng)，從而殺傷癌細胞。HMME是第二代聲敏劑，還具有光毒反應(yīng)小、代謝快等優(yōu)點[3,4]。超聲波具有深度聚焦、穿透力強、對周圍組織損傷小等優(yōu)點，適用于不宜切除的腦重要功能區(qū)的腫瘤及不能耐受手術(shù)患者的治療。因此，本實驗采用HMME和超聲波對腦膠質(zhì)瘤的治療作用進行在體研究。

MRI增強掃描T1WI序列腫瘤實質(zhì)明顯強化，瘤周可見水腫帶。MRI顯示大鼠腦腫瘤具備了人腦惡性膠質(zhì)瘤的影像特征：不規(guī)則形狀且明顯不均勻強化的實體性腫瘤、瘤周圍組織水腫[3,4]。腫瘤的強化取決于血-腦屏障的破壞程度，瘤周水腫始于血-腦屏障破壞區(qū)，一些血漿和大分子滲透到細胞間隙中，造影劑隨之外滲并在腫瘤周圍聚集，引起強化并導(dǎo)致瘤周水腫的形成。GFAP和S-100是酸性蛋白，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要由膠質(zhì)細胞，特別是星形膠質(zhì)細胞合成和分泌，作用于神經(jīng)元及其生長環(huán)境，是膠質(zhì)細胞與神經(jīng)元之間相互作用的橋梁，也是星形膠質(zhì)細胞激活的標志之一[5]。MRI表現(xiàn)及免疫組化GFAP和S-100蛋白表達均表明動物模型腫瘤組織具有膠質(zhì)原性，與人類腦膠質(zhì)瘤有高度近似性，適用于SDT的在體研究[4]。

在篩選的聲動力條件下，透射電鏡觀察到SDT組治療后24h胞核固縮、碎裂及空泡化；TUNEL染色發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤細胞胞質(zhì)內(nèi)高表達的棕色顆粒，凋亡率達（30.60±1.60）%，表明聲動力療法對動物體內(nèi)的腦膠質(zhì)瘤具有明顯的促凋亡作用，與細胞水平結(jié)果接近[2,6]；同時生存期明顯延長為（46.3±3.1）d，治療作用明顯。盡管凋亡率偏低，但細胞的程序性死亡對腫瘤的治療意義重大[7-10]，為SDT應(yīng)用于膠質(zhì)瘤的臨床治療提供實驗基礎(chǔ)。

細胞凋亡是細胞的一種基本生物學(xué)現(xiàn)象，在多細胞生物去除不需要的或異常的細胞中發(fā)揮必要作用。它在生物體進化、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定以及多個系統(tǒng)的發(fā)育中發(fā)揮重要作用。細胞凋亡是一個主動過程,它涉及一系列蛋白的激活、表達及調(diào)控。SDT對腫瘤的促凋亡機制目前尚無統(tǒng)一結(jié)論。許多因素影響SDT的作用機制，如不同的超聲波作用參數(shù)、不同聲敏劑的作用和不同生物組織類型。多數(shù)學(xué)者認為在SDT過程中產(chǎn)生的活性氧是SDT的主要凋亡機制[11-13]。這種氧化對癌細胞的破壞主要通過破壞癌細胞的脂質(zhì)和細胞膜，導(dǎo)致膜通透性增強、線粒體膨脹、溶酶體酶釋放等損傷、癌細胞內(nèi)蛋白質(zhì)變性等最終導(dǎo)致細胞凋亡或壞死[14-16]。細胞凋亡有2個獨立的途徑：一是外部的死亡受體途徑，一是內(nèi)部的線粒體凋亡途徑，這2個途徑存在交叉，并在激活Caspase水平進行會聚。細胞凋亡通過Caspase級聯(lián)而激活。一旦下游的Caspase-3激活，即可啟動細胞凋亡，Caspase的激活發(fā)生在細胞形態(tài)改變前幾小時。免疫組化SDT組胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)Bax高表達棕色顆粒和Bcl-2低表達棕色顆粒。Bax/Bcl-2比值升高，說明Bcl-2、Bax參與調(diào)節(jié)SDT誘導(dǎo)的凋亡；SDT組膠質(zhì)瘤細胞胞質(zhì)內(nèi)Caspase-3、Caspase-9、Cyt c高表達棕色顆粒也說明啟動了內(nèi)源性線粒體途徑被啟動，線粒體受到損傷，釋放凋亡因子，激活Caspase-9、Caspase-3，誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細胞凋亡。而Fas表達無明顯變化，F(xiàn)as-L在胞質(zhì)中呈低表達，表明荷瘤鼠膠質(zhì)瘤組織凋亡與外源性凋亡途徑不相關(guān)。

綜上所述，荷瘤鼠體內(nèi)研究表明在篩選參數(shù)下，SDT能夠抑制腫瘤細胞增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡，延長荷瘤鼠生存時間，對膠質(zhì)瘤具有一定的治療作用，并與線粒體內(nèi)源性凋亡途徑密切相關(guān)，但凋亡率偏低。聲敏劑的靶向沉積、貯留時間延長及超聲波條件進一步的優(yōu)化可能提高凋亡率。隨著研究的深入，必將推動SDT在臨床上早日應(yīng)用。

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Experimental Study in the Apoptosis of Brain Glioma by Sonodynamic Therapy

PurposeTo investigate the apoptotic effect and mechanisms to C6 glioma cells by sonodynamic therapy (SDT) in vivo.Materials and MethodsSeventy-four tumor-bearing rats were established by inoculating C6 glioma cells into right caudate nucleus of Wistar rats with stereotactic technique and selected by enhanced MRI. The rats were completely randomized and divided into control group, hematoporphyrin monomethyl ether (HMME) group, ultrasound group and SDT group, 16 rats in each group. The parameters of SDT was ultrasound under 1.0 MHz, 1.0 W/cm2, 60s and HMME of 5mg/kg. After 24 hours by SDT treatment or not, apoptotic rate was determined by TUNEL staining, morphological change was observed by the transmission electron microscope (TEM), protein expression of GFAP, S-100, Bcl-2/Bax, Caspase-3, Caspase-9, Fas/Fas-L and cytochrome (Cyt c)were detected by immunohistochemistry. The rats survival time in four groups was also recorded.ResultsThe SDT group showed the highest apoptotic rate of(30.60±1.60)% (P＜0.05), then the ultrasound group of (14.50±0.80)% (P＜0.05),and no signi fi cant apoptosis was observed in the HMME group when compared to the control group. The long survival time of (46.3±3.1) days was presented in the SDT group (P＜0.05), and no obvious change was displayed in survival time in the other three groups. Morphological characteristic changes of apoptosis including nuclear chromatin margination, aggregation and condensation were observed by TEM in SDT group. The expressions of the GFAP, S-100, Caspase-9, Caspase-3, Bax were upregulated and release of Cyt c, Bcl-2 and Fas-L were down-regulated, and Fas was constant in tumor-bearing rats in the SDT group compared to the other three groups.ConclusionSDT has an obviously therapeutic effect to C6 glima cells in ratsin vivo,and is closely associated with the mitochondrial signal apoptosis pathway..

Glioma; Ultrasonic therapy; Sonodynamic therapy; Apoptosis; Rats

10.3969/j.issn.1005-5185.2012.12.013

1. 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院超聲科黑龍江哈爾濱 150040

2. 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)外科黑龍江哈爾濱 150001

胡韶山

Department of Neurosurgery, the Second Af fi liated Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150001, China

Address Correspondence to：HU ShaoshanE-mail： shaoshanhu@hotmail.com

中國圖書資料分類法分類號R739.41

2012-10-31

2012-11-20

中國醫(yī)學(xué)影像學(xué)雜志2012年 第20卷 第12期：924-927，931

Chinese Journal of Medical Imaging 2012 Volume 20(12)： 924-927, 931

（責任編輯 張春輝）