周 麗， 王興國(guó)， 張康逸， 劉元法

（江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122）

甘油磷脂酰膽堿的分離純化研究

周 麗， 王興國(guó)， 張康逸， 劉元法＊

（江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122）

甘油磷脂酰膽堿（GPC）是磷脂酰膽堿（PC）分子上的兩個(gè)脂肪酰基完全被水解掉的產(chǎn)物。為得到較純的甘油磷酸膽堿，作者通過(guò)粉末磷脂水解獲得GPC混合物，然后從3種離子交換樹(shù)脂中篩選出D113樹(shù)脂作為分離甘油磷酸膽堿的主要樹(shù)脂，研究了其對(duì)甘油磷酸膽堿的吸附作用與解吸過(guò)程，解吸液通過(guò)特定的陰離子交換樹(shù)脂的進(jìn)一步純化，所得產(chǎn)品經(jīng)過(guò)HPLC分析，GPC的干基質(zhì)量分?jǐn)?shù)為97.11%。

甘油磷酸膽堿；離子交換；分離

甘油磷酸膽堿（GPC）是磷脂酰膽堿（PC）分子上的兩個(gè)脂肪酰基完全被水解掉的產(chǎn)物，是一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)和磷脂前體，可用于醫(yī)藥行業(yè)，以改善老年人的認(rèn)知能力和提高青少年的記憶力，其結(jié)構(gòu)式如下：

其中，R的結(jié)構(gòu)式為—CH2CH2N＋（CH3）3。由于磷脂組成復(fù)雜，其水解產(chǎn)物的組成也十分的復(fù)雜，因而導(dǎo)致甘油磷酸膽堿（GPC）的分離比較困難。

20世紀(jì)早期，國(guó)外出現(xiàn)了關(guān)于GPC的報(bào)道，但都不夠詳細(xì)，而國(guó)內(nèi)則鮮有報(bào)道。目前所采用的方法主要有：冷卻結(jié)晶法、有機(jī)溶劑萃取法、硅膠柱層析法、離子交換樹(shù)脂法等。Christopher等人［1，2］將含GPC的溶液去除水分后加入乙醇或其他適當(dāng)?shù)娜軇┦蛊淙芙?，冷卻使GPC結(jié)晶，脫溶后得產(chǎn)品。此結(jié)晶法對(duì)原料純度要求較高，對(duì)實(shí)際生產(chǎn)沒(méi)有太大意義。Brockerhoff等人［3］以蛋黃卵磷脂為原料，溶解于乙醚中，四丁基氫氧化銨甲醇溶液作為催化劑，反應(yīng)液用甲醇和乙醚依次洗滌。孫清瑞［4］等以大豆磷脂為原料，采用同樣的方法制備出GPC，該法產(chǎn)率雖高，但所得產(chǎn)品純度較低。Reichling等人［5］將粗磷脂的反應(yīng)液通過(guò)硅膠柱，采用甲苯和甲醇混合溶劑作為洗脫劑，但所得產(chǎn)品中混有硅酸，且硅膠柱層析法成本較高，回收率較低，不利于大規(guī)模的生產(chǎn)。Song等［6，7］先將GPC轉(zhuǎn)化為鋅鹽從混合物中沉淀，去除鋅鹽后通過(guò)樹(shù)脂純化得到產(chǎn)品，然而該法回收率較低，且產(chǎn)生大量的廢水。Tronconi等人［8］采用離子交換樹(shù)脂法從粗磷脂的水解產(chǎn)物中成功分離出GPC，該方法所得產(chǎn)品純度較高，并可以同時(shí)分離出副產(chǎn)品。幾種方法進(jìn)行比較，可以看出離子交換樹(shù)脂法工藝簡(jiǎn)單，成本較低，可以應(yīng)用于工藝生產(chǎn)，且副產(chǎn)品可以提高產(chǎn)品價(jià)值。作者以離子交換樹(shù)脂為分離介質(zhì)，采用柱層析法，有效的從大豆粉末磷脂分解產(chǎn)物中分離出高純GPC。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

層析柱（D30 mm×500 mm，D25 mm×300 mm，D15 mm×300 mm），HL－2恒流泵：上海滬西分析儀器廠有限公司產(chǎn)品，RE－52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品，Waters1525高效液相色譜儀，蒸發(fā)光檢測(cè)器（ELSD），大豆粉末磷脂：天津市博帥工貿(mào)有限公司產(chǎn)品，離子交換樹(shù)脂D001、D113、D318、001×4：江蘇蘇青集團(tuán)產(chǎn)品，液相色譜用甲醇（色譜純），其他試劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樹(shù)脂的處理根據(jù)各樹(shù)脂型號(hào)的不同，先進(jìn)行適當(dāng)?shù)奶幚?，抽濾去水后用無(wú)水甲醇浸泡。

1.2.2 樣品制備與處理稱取大豆粉末磷脂50 g于250 m L的三頸燒瓶中，加入200 m L甲醇，于55℃水浴中加熱攪拌1.5 h，室溫下過(guò)濾，將濾液置于冰箱中冷凍靜置過(guò)夜，過(guò)濾出上清液。加入一定量的甲醇鈉作為催化劑，于35℃無(wú)水條件下攪拌1.5 h，靜置沉淀，所得濾液作為過(guò)柱原液。

1.2.3 靜態(tài)吸附率和解吸率的測(cè)定準(zhǔn)確稱取經(jīng)預(yù)處理的樹(shù)脂2 g于150 m L具塞三角瓶中，加入1.2.2中的反應(yīng)液50 m L，靜態(tài)吸附24 h后，測(cè)定溶液中GPC的含量。按下式計(jì)算樹(shù)脂的吸附率［9］：

式中：X為吸附率；c0為吸附原液中GPC的質(zhì)量濃度，mg／m L；ce為吸附后溶液中GPC的質(zhì)量濃度，mg／m L。

吸附率、解吸率和選擇性是離子交換樹(shù)脂分離時(shí)需要考慮的重要參數(shù)，它不僅要求吸附樹(shù)脂具有較高的吸附率，同時(shí)還應(yīng)該具有較高的解吸率和選擇性。因此，解吸率的測(cè)定是樹(shù)脂試驗(yàn)的重要環(huán)節(jié)。取上述吸附后的樹(shù)脂，加入稀鹽酸50 m L在恒溫水浴中震蕩24 h，過(guò)濾，取濾液定容，測(cè)定其中GPC的含量，按下式計(jì)算解吸率：

式中：B為解吸率；c1為解吸液中GPC的質(zhì)量濃度，mg／m L；V1為解析液的體積，m L；V為吸附液的體積，m L。

1.2.4 裝柱上樣、洗脫和處理裝柱過(guò)程：離子交換樹(shù)脂采用濕法裝柱，將1.5 L無(wú)水甲醇溶劑浸泡的離子交換樹(shù)脂D113邊攪拌邊緩緩加入層析柱中，待樹(shù)脂沉積后，用活塞密封柱子，控制出口流速，以同種溶劑沖洗柱子。上樣過(guò)程：將上面所得濾液以泵打入，收集流出液，取樣分析，即得吸附曲線。洗脫過(guò)程：先用甲醇洗脫，直至雜質(zhì)完全去除；然后用稀酸洗脫，再依次從D318、001×4上洗脫下來(lái)。處理過(guò)程：所得水溶液適量濃縮，加入少量活性炭，加熱攪拌，濾液減壓蒸餾，真空干燥，采用高效液相色譜（HPLC）分析得其質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.2.5 分析方法高效液相色譜（HPLC）法。色譜條件為：色譜柱lichrospher（D4.6 mm×250 mm）；流動(dòng)相，A：甲醇，B：V（甲醇）∶V（水）＝8∶1；柱溫：35℃；流量：1 m L／min；進(jìn)樣量：5μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 樹(shù)脂篩選

根據(jù)文獻(xiàn)［10］可知，GPC無(wú)法與醇溶液中羧基型的弱酸陽(yáng)離子交換樹(shù)脂形成穩(wěn)定的結(jié)合，在洗脫過(guò)程中很容易與雜質(zhì)一起洗脫下來(lái)，無(wú)法達(dá)到分離的目的。而醇溶液中部分大孔型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂可以與GPC形成穩(wěn)定的復(fù)合物。故從強(qiáng)酸型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂、大孔型的強(qiáng)酸型及弱酸型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂這3種類型的樹(shù)脂中進(jìn)行篩選。3種常用的離子交換樹(shù)脂對(duì)GPC的靜態(tài)吸附情況見(jiàn)表1。

表1 3種離子交換樹(shù)脂對(duì)GPC的吸附率Tab.1 Adsorption effect of GPC by three kinds of resin

用稀鹽酸進(jìn)行解吸，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 3種樹(shù)脂對(duì)GPC的解吸率Tab.2 Desorption rate of GPC in three kinds of resin

由表1可知，3種樹(shù)脂的吸附率都很高，說(shuō)明3種樹(shù)脂均能與GPC醇溶液形成穩(wěn)定的結(jié)合。但由表3可知，001×4的解吸率較低，可能是磺酸基型的強(qiáng)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂在長(zhǎng)時(shí)間的吸附解吸過(guò)程引起了GPC中P－O鍵的斷裂，GPC發(fā)生了解離，導(dǎo)致GPC的產(chǎn)量下降。而D001和D113這兩種大孔型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂在吸附與解吸的過(guò)程中的作用均優(yōu)于001×4。綜合考慮吸附率和解吸率，選擇吸附率與解吸率均較高的D113樹(shù)脂進(jìn)行吸附研究。

2.2 D113樹(shù)脂吸附曲線

將甲醇鈉反應(yīng)液加入到裝有D113樹(shù)脂的層析柱中（D30 mm×500 mm），在流量為2～3 m L／min條件下上柱，以200 m L為單位收集流出液，檢測(cè)其中GPC的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，繪制吸附曲線，如圖1所示。

從圖1中可以看出，隨著流出液量的增加，流出液中GPC的含量也逐漸增加，在流出液達(dá)1 600 m L之前，流出液中均無(wú)GPC，這說(shuō)明1 600 m L反應(yīng)液中的GPC完全被吸附，計(jì)算出1.5 L樹(shù)脂能處理1 600 m L的反應(yīng)液，即500 g大豆粉末磷脂。

圖1 D113樹(shù)脂對(duì)GPC的吸附曲線Fig.1 The adsorption curve of GPC in D113 resin

2.3 洗脫、解吸及后續(xù)純化過(guò)程的控制

無(wú)水甲醇做為洗脫劑的過(guò)程中，雜質(zhì)含量逐漸減少，采用薄層層析色譜法進(jìn)行快速檢測(cè)是否完全去除。在流量為2～3 m L／min條件下上柱，以200 m L為單位收集流出液，檢測(cè)其中GPC和雜質(zhì)的含量，繪制出曲線，如圖2所示。

圖2 甲醇洗脫過(guò)程中GPC和雜質(zhì)的響應(yīng)值變化Fig.2 Response value of GPC and impurities during methanol washing progress

從圖2中可以看出，GPC在甲醇洗脫過(guò)程中仍然吸附在樹(shù)脂上，而隨著洗脫劑量的增加，流出液中雜質(zhì)的含量逐漸減少，當(dāng)甲醇洗脫劑的量達(dá)到1 600 m L時(shí)，雜質(zhì)的含量已經(jīng)很低，通過(guò)薄層層析色譜法檢驗(yàn)，無(wú)明顯斑點(diǎn)，即甲醇洗脫完全。

采用進(jìn)行解吸，收集所有解吸溶液。稀酸可以將GPC完全解吸下來(lái)，但同時(shí)一些結(jié)合較強(qiáng)的陰離子（如膽堿、乙醇胺離子）也被解吸下來(lái)，導(dǎo)致解吸液中產(chǎn)品純度的降低，后期仍然需要對(duì)解析液進(jìn)行選擇［11］。

將上述解吸液繼續(xù)經(jīng)過(guò)D318樹(shù)脂的層析柱（D25 mm×300 mm），其中陰離子（膽堿、乙醇胺、GPE等）吸附在柱中，而GPC得到純化，最后從001×4樹(shù)脂的層析柱（D15 mm×300 mm）中洗脫下來(lái)。所得水溶液適量濃縮，濾液減壓濃縮，真空干燥，得高粘度無(wú)色透明的產(chǎn)品。

2.4 GPC的檢測(cè)

對(duì)產(chǎn)品的各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，并與標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較，如表3所示。

表3 產(chǎn)品各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)Tab.3 Determined index of the production

3 結(jié)語(yǔ)

以大豆粉末磷脂為原料，首先經(jīng)甲醇鈉催化脫酰反應(yīng)，得到含有GPC的反應(yīng)液，再經(jīng)離子交換樹(shù)脂法逐步純化，可制備出干基質(zhì)量分?jǐn)?shù)為97.11%的產(chǎn)品。作者制備的產(chǎn)品已基本符合產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)要求，可以為GPC的純化工藝研究和工業(yè)化生產(chǎn)提供重要的參數(shù)。

（References）：

［1］Christopher T.Crystallization process for preparing glycerophosphocholine［P］.United States Patent：US5523450（A），1996－06－04.

［2］Jaswinder Singh Chadha.Preparation of crystalline L－α－glycerophosphoryl－choline－cadmium chloride adduct from commercial egg lecithin［J］.Chemistry and Physics of Lipids，1970，1（1）：104－108.

［3］Brockerhoff，H.et al.Simplified Preparation of L－α－Glyceryl Phosphorylcholine［J］.Biochemistry and Cell Biology，1965，43（10）：1777.

［4］孫清瑞，鹿保鑫.化學(xué)催化法制備甘油磷酸膽堿的研究［J］.油脂工程，2009，11：56－58.

SUN Qing－rui，LU Bao－xin.Preparation of Glycerophosphocholine（GPC）by Chemical Catalysis［J］.Cereals and Oils Processing，2009，11：56－58.（in Chinese）

［5］Paul Reichling Dipl－Chemdr.Verfahren zur gewinnung von reinen natuerlichen cholinphosphorsaeurediglyceridestern［P］.Deutsches Patentamt：DE1543722（A1），1979－04－04.

［6］Song，Yoon Seok，Song，Eun Seob.A Process for preparation of L－alpha－glycerophosphoryl choline［P］.World Intellectual Property Organization Patent：WO2007145476（A1），2007－12－21.

［7］Tronconi Giovanni.Process for the Preparation of L－alpha－glycerylphosphorylcholine，L－alpha－glycerylphosphorylethanolamine from crude and／or deoleated lecithins［P］.European Patent：EP0217765（A2），1987－04－08.

［8］Tronconi Giovanni.Process for separating the main components of a mixture of raw deacylated phospholipids［P］.World Intellectual Property Organization Patent：WO9115494（A1），1991－10－17.

［9］劉元法，汪燕，王興國(guó).離子交換樹(shù)脂分離磷脂酰膽堿的研究［J］.中國(guó)油脂，2009，33（5）：58－60.

LIU Yuan－fa，WANG Yan，WANG Xing－guo.Seperation of soya phosphatidylcholine by ion exchange resin［J］.China Oils and Fats，2009，33（5）：58－60.（in Chinese）

［10］Tronconi Giovanni.Process for the preparation of L－alpha－glycerylphosphoryl－choline and of L－alpha－glycerylphosphorylethanolamine［P］.United States Patent：US5250719（A），1993－10－05.

［11］曹棟，裘愛(ài)泳，王興國(guó).乙醇對(duì)柱層析分離大豆磷脂中磷脂酰膽堿的影響［J］.無(wú)錫輕工大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，21（3）：302－304.

CAO Dong，QIU Ai－yong，WAN Xin－guo.The effect of different concentration of ethanol on the isolation of phosphatidy choline from soybean phosphalipid by column chromatography［J］.Journal of Wuxi University of Light Industry，2002，21（3）：302－304.（in Chinese）

Separation and Purification of Glycerophosphocholine（GPC）

ZHOULi，WANGXing－guo，ZH ANGKang－yi，LIUYuan－fa＊
（School of Food Scince and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，Jiangsu）

Glycerophosphocholine（GPC）is obtained by completely deacylated from phosphacholine（PC）.In order to obtain the more pure product，a process for separating glycerophosphocholine（GPC）from raw deacylated mixtures of crude soy lecithin is was developed in this manuscript..Then three resins were selected and compared，of them，D113 is selected to more detailed study its adsorption and desorption process.The elution was then eluted on a strong basic resin in OH form.After concerntration，the purity of GPC product is up to 97.11%on dry basis by HPLC analysis.

glycerophosphocholine（GPC），ion exchange，separation

Q 545

A

1673－1689（2012）01－067－04

2011－02－24

國(guó)家“十二五”科技支撐計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（2011BAD02B04）。

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劉元法（1974－），男，山東淄博人，工學(xué)博士，教授，主要從事油脂深加工研究。Email：yuanfa.liu＠gmail.com