徐 紅

(泰山醫(yī)學(xué)院附屬泰山醫(yī)院心內(nèi)科，山東 泰安 271000)

目前大量研究發(fā)現(xiàn)，心肌梗死后存在心臟交感神經(jīng)再生、增生和不均一支配，交感神經(jīng)重構(gòu)與心肌組織重構(gòu)、心肌電重構(gòu)，共同成為心律失常和猝死的發(fā)生基質(zhì)[1-5]。心肌梗死后再生神經(jīng)以交感神經(jīng)為主，酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)在分子生物學(xué)實驗研究中，常被作為交感神經(jīng)的標(biāo)記物[6]，以探討心律失常的神經(jīng)機(jī)制。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為心肌的氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)，細(xì)胞外基質(zhì)的重塑和纖維化等共同參加了心律失常的發(fā)生過程，并成為抗心律失常藥物作用的新靶點。參松養(yǎng)心膠囊(SSYX)是一種復(fù)方制劑，具有多離子通道和非離子通道的抗心律失常作用[7,8]。隨機(jī)臨床驗顯示，SSYX對治療冠心病心律失常有明顯療效。但關(guān)于SSYX對MI后抗心律失常的機(jī)制和對心肌TH mRNA表達(dá)影響的相關(guān)研究鮮有報道。對此，我們進(jìn)行了初步的探討。

1 材料與方法

1.1 動物模型的建立和分組

45只新西蘭兔[普通級，編號SCXK(魯)20050015，2.5～3 kg]。購自山東中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心。

MI模型制備：3%戊巴比妥鈉按40 mg/kg劑量行腹腔內(nèi)注射麻醉、備皮。消毒后沿胸骨中線切開皮膚，暴露胸骨及肋軟骨。貼緊胸骨左緣剪斷第4～5肋骨，暴露縱隔及心臟，保持兩側(cè)胸膜完整，眼科鑷夾起心包膜，剪開心包，暴露出冠狀動脈。左心耳下緣至心尖部的中下1/3處用6/0線穿過心肌淺層縫扎前降支，進(jìn)針深度約2.0 mm，記錄心電圖。心電圖示ST段抬高，且結(jié)扎水平以下心肌局部顏色變暗，搏動減弱，觀察20分鐘后逐層關(guān)閉胸腔。術(shù)后均給予青霉素肌肉注射3天，預(yù)防感染，單籠喂養(yǎng)，予以自主飲食(水)。

MI模型制備后，30只兔隨機(jī)分為心肌梗死組(MI組，n=15)和心肌梗死+參松養(yǎng)心膠囊組(SSYX組，n=15)。SSYX組自術(shù)后第1天給予參松養(yǎng)心膠囊藥粉 0.8 g/kg·d灌胃；MI組給予0.9%氯化鈉5 ml/kg·d灌胃；另取15只兔作為假手術(shù)組(Sham組)，冠狀動脈穿線但不結(jié)扎，同期普通飼料喂養(yǎng)8周。

1.2 電生理試驗

術(shù)后8周所有成模兔再次以3%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔內(nèi)注射麻醉，心電監(jiān)護(hù)，開胸，充分暴露心臟左室游離壁，縫制心包吊床。起搏電極由2支針形電極組成，電極直徑 0.3 mm，兩電極相距約3.0 mm，在梗死灶(梗死區(qū)蒼白邊緣2.0～3.0 mm)刺入2.0 mm。Sham組起搏電極放置在心臟的相應(yīng)部位。

1.2.1梗死灶周(ERP)的測定

應(yīng)用心臟電生理刺激儀(DF-5A型，蘇州市東方電子儀器廠)以S1S2 160 ms逆掃，每次遞減5 ms，測定梗死灶周心肌有效不應(yīng)期(ERP)。

1.2.2程序電刺激誘發(fā)室性心律失常

在梗死灶周S1S2S3刺激和S1S1刺激8 min；未達(dá)刺激終點停止5分鐘后再重復(fù)一次上述電刺激直至誘發(fā)出室性心動過速(VT)、室顫(Vf)，如未誘發(fā)出VT/Vf，則在ERP基礎(chǔ)上增加 30 ms，加發(fā)S3刺激，直至誘發(fā)出VT/Vf。

1.3 總RNA的提取

應(yīng)用Trizol(Invitrogen，美國)分別提取梗死灶周和非梗死左室游離壁心肌總RNA。100 mg組織塊加入1 ml Trizol 勻漿，冰上孵育后加入0.2 ml氯仿，震蕩，4 ℃離心(12,000轉(zhuǎn)/分)10 min，取上清液移入新管；加入0.5 ml異丙醇，4 ℃離心(12,000轉(zhuǎn)/分)5 min，棄去上清液；加入1 ml 75%乙醇洗滌，4 ℃離心(12,000轉(zhuǎn)/分)5分鐘，棄去上清液；DEPC處理水溶解RNA。紫光分光計測定260 nm、280 nm吸光度值(OD)，計算RNA總量。

1.4 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)

應(yīng)用RT-PCR試劑盒(大連寶生物工程有限公司)檢測mRNA的表達(dá)水平。1)合成cDNA：取2 μl 總RNA，加入10×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液1μl 、dNTP 1 μl 、隨機(jī)引物0.5 μl 、RNA酶抑制劑0.25 μl 、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶0.5 μl 、去RNA酶水配置總反應(yīng)液體積為10 μl 。30 ℃ 10 min、42 ℃ 30 min、99 ℃ 5 min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。2)PCR反應(yīng)：目的基因TH引物序列：上游5’AATTCGATTCCGACCTGGA 3’，下游5’RGATGTACTGGGTGCACTGGA3’，擴(kuò)增目的片段398bp；以磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參照物，GAPDH引物序列；上游5’GCGCCTGGTCACCAGGGCTGCTT 3’,下游5’TGCCGAAGTGGTCGTGGATGCCT3’，擴(kuò)增目的片段465bp。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。3)TH PCR反應(yīng)體系：cDNA 10 μl 、5×PCR緩沖液 10 μl 、Tag酶0.25 μl ，目的基因及GAPDH上游、下游引物各0.5 μl ，加入雙蒸水至總體積50 μl ，94 ℃預(yù)變性5分鐘，擴(kuò)增36個循環(huán)(條件：94 ℃變性30 s、57 ℃ 退火45 s、72 ℃延伸240 s、4 ℃5 min)。1.2%瓊脂糖電泳分析PCR產(chǎn)物，應(yīng)用UVIpro凝膠圖像分析系統(tǒng)攝像并掃描分析，以目的基因與內(nèi)參照物基因條帶吸光度比值作為目的基因的相對表達(dá)強(qiáng)度。

1.5 統(tǒng)計分析

2 結(jié) 果

2.1 動物一般情況

在制作 MI動物模型過程中，心電圖 I導(dǎo)聯(lián)和aVL導(dǎo)聯(lián)ST段上抬，部分動物 Ⅱ、Ⅲ和 aVF導(dǎo)聯(lián)出現(xiàn) ST段上抬，冠狀動脈結(jié)扎線以下局部心肌搏動減弱，心肌顏色發(fā)紫。飼養(yǎng)過程中模型組、治療組及假手術(shù)組動物均無死亡。模型組及治療組二次開胸前心電圖 I、 aVL 導(dǎo)聯(lián)可見病理性Q波，假手術(shù)組心電圖前后變化不大。開胸后在冠狀動脈結(jié)扎附近梗死心肌呈現(xiàn)蒼白色，而假手術(shù)組冠狀動脈穿線附近心肌顏色無變化。經(jīng)過 8 周的參松養(yǎng)心膠囊治療后，治療組心率較MI組有所下降(P<0.05，表1) 。

2.2 各組電生理參數(shù)

MI組較Sham組梗死灶周ERP明顯延長(120.6±7.3 ms 比91.4±5.8 ms，P<0.01)。經(jīng)參松養(yǎng)心膠囊干預(yù)8周后，SSYX組有效不應(yīng)期有所縮短至105.1±6.7 ms。在程序電刺激試驗中，MI組有2例(2/15，13.3%)誘發(fā)出VT，5例誘發(fā)出心室顫動(Vf)(5/15，33.3%)，室性心律失常(VA)總誘發(fā)率為46.7%。而SSYX組有1例(l/15，6.7%)誘發(fā)出VT，3例誘發(fā)出Vf(3/15，20.0%)，VA總誘發(fā)率為26.7%。VA總誘發(fā)率在SSYX組與MI組間有顯著性差異(表 1)。

表1 各組間電生理數(shù)據(jù)比較

注：與Sham組相比，*P<0.01；與MI組相比，#P<0.05

2.3 各組TH mRNA的表達(dá)水平

術(shù)后8周 MI組梗死灶周及非梗死左室游離壁TH mRNA的表達(dá)水平分別為(3.176±0.099, 2.028±0.072)，較Sham組相應(yīng)部位(0.958±0.051 , 0.960±0.054 ，P<0.01)顯著增高。參松養(yǎng)心膠囊干預(yù)8周后，SSYX組相應(yīng)部位TH mRNA的表達(dá)水平降低(1.768±0.113, 1.246±0.142)，與MI組比較有明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01，表2)。

表2 心肌TH mRNA表達(dá)水平

注：與Sham組相比，*p<0.01；與MI組相比，#p<0.05

3 討 論

近年來大量研究證實MI時神經(jīng)發(fā)生損傷變性，MI后慢性期存在神經(jīng)鞘細(xì)胞和軸突再生及增生的動態(tài)演變過程，即神經(jīng)重構(gòu)。并且再生神經(jīng)纖維大多數(shù)呈TH陽性，證實再生神經(jīng)纖維以交感神經(jīng)為主[9]。交感神經(jīng)空間分布不均衡導(dǎo)致交感興奮時心臟電生理異質(zhì)性增加可促使惡性心律失常的發(fā)生[10]。

程序電刺激是評價MI后室性心律失常發(fā)生的重要指標(biāo)，實驗中我們通過程序電刺激檢測MI后心肌電生理參數(shù)發(fā)現(xiàn)，MI組梗死灶周ERP明顯延長，VA發(fā)生率增高。經(jīng)參松養(yǎng)心膠囊干預(yù)后，SSYX組VA發(fā)生率降低。術(shù)后8周 MI組梗死灶周及非梗死左室游離壁TH mRNA的表達(dá)水平分較Sham組相應(yīng)部位顯著增高(P<0.05)。參松養(yǎng)心膠囊干預(yù)后，SSYX組相應(yīng)部位TH mRNA的表達(dá)水平降低，有明顯統(tǒng)計學(xué)差異。

MI后8周梗死灶周TH mRNA表達(dá)的增高說明梗死邊緣區(qū)域TH活性較高，NE合成增多，與VA發(fā)生率增高相關(guān)。TH位于腎上腺素能神經(jīng)的胞漿中，是NE生成的限速酶。交感神經(jīng)的過度增生，使局部組織NE增高，梗死灶周高濃度NE作用于心肌細(xì)胞腎上腺素能受體，使離子通道發(fā)生重構(gòu)，包括: Ica,L密度增加，復(fù)極 K+電流減低等，導(dǎo)致區(qū)域間電生理異質(zhì)性增加和心肌組織重構(gòu)，觸發(fā)心律失常[1,3,11]。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究提示SSYX顯著降低冠脈阻力和心肌耗氧量，對器質(zhì)性心臟病和自主神經(jīng)功能失調(diào)引起的室性早搏均具有顯著療效。SSYX作用于ICa，L、INa、Ito、IK多種離子通道，降低心肌細(xì)胞自律性，抑制折返激動，調(diào)節(jié)自主神經(jīng)功能，多環(huán)節(jié)、多靶點抑制心律失常發(fā)生。李寧等[12]研究顯示SSYX對IK電流有抑制作用。IK有快速激活(IKr)和緩慢激活(IKs)兩種成分，心率增快時復(fù)極以IKs為主，SSYX阻滯心動過速時Iks，從而發(fā)揮抗心律失常作用。

總之，心肌梗死后心臟的交感神經(jīng)重構(gòu)增加了心肌對室性心律失常的易感性，參松養(yǎng)心膠囊干預(yù)可減低心肌梗死后的交感神經(jīng)增生，從而降低室性心律失常的發(fā)生率。

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