丁 罡綜述 黃 鋼審校

在世界范圍內(nèi)，肺癌的發(fā)病率明顯增高。在歐美某些國(guó)家和我國(guó)大城市中，肺癌的發(fā)病率已居男性各種腫瘤的首位,每年因肺癌死亡的人數(shù)超過(guò)100萬(wàn)，并且每年新增病例120萬(wàn)[1]。非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)占肺癌的80%，確診時(shí)多為晚期，盡管手術(shù)、化療、放療技術(shù)不斷提高，但NSCLC患者的預(yù)后仍很差，總體5年生存率低于20%[2]。miRNAs幾乎參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的各個(gè)生物過(guò)程，包括發(fā)育、造血、器官形成、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。在腫瘤組織中，miRNAs表達(dá)異常。MiRNAs既可起癌基因功能，又能作為抑癌因子。在肺癌組織中miRNAs有特定的表達(dá)譜，參與調(diào)節(jié)腫瘤血管生成等多個(gè)過(guò)程，并可作為生物標(biāo)志物用以早期診斷，靶向治療及臨床預(yù)后。本文就miRNA的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性，在肺癌中的研究進(jìn)展綜述如下。

1 miRNA的發(fā)現(xiàn)

1993年，Lee、Feinbaum和Ambros等發(fā)現(xiàn)在線蟲(chóng)體內(nèi)存在1種RNA(lin-4)，是1種不編碼蛋白但可以生成一對(duì)小的RNA轉(zhuǎn)錄本，每一個(gè)轉(zhuǎn)錄本能在翻譯水平通過(guò)抑制1種核蛋白lin-14的表達(dá)而調(diào)節(jié)了線蟲(chóng)的幼蟲(chóng)發(fā)育進(jìn)程。7年后科學(xué)家又發(fā)現(xiàn)了第2個(gè)miRNA-let-7，let-7相似于lin-4，同樣可以調(diào)節(jié)線蟲(chóng)的發(fā)育進(jìn)程，Let-7最早在G.elegans體內(nèi)發(fā)現(xiàn)。在線蟲(chóng)C.elegan中，Let-7具有調(diào)控發(fā)育的時(shí)序及細(xì)胞增殖，在哺乳動(dòng)物中也發(fā)現(xiàn)相同功能的基因，表明miRNA 進(jìn)化上是比較保守的。

2 miRNA的產(chǎn)生及作用機(jī)制

miRNA通常是在細(xì)胞核內(nèi)由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄的，在核內(nèi)編碼miRNA的基因首先在RNA聚合酶Ⅱ的作用下轉(zhuǎn)錄成具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的初級(jí)產(chǎn)物miRNA(pri-miRNA)。初級(jí)產(chǎn)物miRNA在核酸酶Drosha和其輔助因子Pasha的作用下形成由70個(gè)核苷酸組成的miRNA前體。轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白5將miRNA前體輸送到細(xì)胞質(zhì)中。隨后，另一個(gè)核酸酶Dicer將其剪切，產(chǎn)生約為22個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的雙鏈miRNA。成熟miRNA 可形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RISC)。miRISC依據(jù)miRNA與同源mRNA堿基互補(bǔ)配對(duì)的程度而啟動(dòng)不同的作用機(jī)制，對(duì)完全配對(duì)的2個(gè)序列，miRISC對(duì)靶mRNA 進(jìn)行剪切，對(duì)部分配對(duì)的2個(gè)序列，miRISC阻斷mRNA 的翻譯并降解mRNA，從而產(chǎn)生基因沉默。miRNA 不僅可引起轉(zhuǎn)錄后基因沉默，而且可引起轉(zhuǎn)錄前和轉(zhuǎn)錄期間的多重沉默[3]。

3 miRNA與肺癌的關(guān)系

3.1 miRNA與肺癌的發(fā)生和機(jī)制

肺癌中miRNA的作用模式(與miRNA相連的實(shí)線表示下調(diào)作用，虛線表示上調(diào)作用)

3.1.1 癌基因或抑癌基因 miRNA具有組織特異性，與肺組織相關(guān)的包括let-7a、miR-34、miR-21、miR-143、miR-145、miR-31、miR-146等40余種[4]。最近研究[5]證明，miRNAs與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。miRNA既可作為抑癌基因(miR-15a、miR-16-1、let-7等)下調(diào)原癌基因的活性；也可作為癌基因(miR-155，miR-17-5p，miR-21等)下調(diào)抑癌基因的活性。Johnson等發(fā)現(xiàn)let-7miRNA與RAS的3'端相結(jié)合，使人類(lèi)細(xì)胞中RAS表達(dá)下降，與正常肺組織相比，let-7在肺癌組織中呈低表達(dá)。在肺腺癌細(xì)胞中恢復(fù)胞內(nèi)let-7水平抑制了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，從而表明let-7可能在腫瘤發(fā)展過(guò)程中具有抑癌基因作用。Garofalo 等[6]在NSCLC 的研究中證實(shí)，miR-221 和miR-222 的表達(dá)水平在TNF 相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體( TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)抵抗的NSCLC 細(xì)胞中升高。

3.1.2 DNA甲基化 DNA甲基化是最早發(fā)現(xiàn)的表觀遺傳學(xué)修飾途徑之一，基因組甲基化受DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase，DNMT)的調(diào)控。DNA甲基化能引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)改變，影響DNA構(gòu)象及DNA穩(wěn)定性，還能使DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式發(fā)生改變，從而調(diào)控基因表達(dá)。MiR-370 作用于白介素-6(IL-6)，受DNA甲基化酶1 及HASJ4442 的影響，而miR-34b 及miR-34c 由于甲基化不足，影響p53 相關(guān)基因的功能[7]。Fabbri等[8]研究發(fā)現(xiàn)，miR-29在肺癌組織中表達(dá)降低，并且miR-29 的表達(dá)量與DNMT3A 和DNMT3B呈負(fù)相關(guān)。在肺癌細(xì)胞中miR-29抑制兩者表達(dá)，可防止DNA過(guò)度甲基化，因此，miR-29可使抑癌基因去甲基化而正常表達(dá)，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)。

3.1.3 血管生成 癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移依賴新生血管的形成，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是最有效的促血管生長(zhǎng)因子。腫瘤細(xì)胞能分泌VEGF等促血管生長(zhǎng)因子，誘發(fā)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，逐步形成新生血管。Fish等[9]發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞中高表達(dá)的miR-126調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)VEGF的反應(yīng)。剔除斑馬魚(yú)體內(nèi)的miR-126后將導(dǎo)致胚胎發(fā)育過(guò)程中血管完整性的降低及出血。增加Spred-1表達(dá)或抑制VEGF均得到與剔除miR-126類(lèi)似的結(jié)果。此外，Liu等[10]研究發(fā)現(xiàn)miR-126在肺癌組織中低表達(dá)，將miR-126轉(zhuǎn)染到肺癌細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)miR-126可下調(diào)VEGF的表達(dá)并抑制肺癌細(xì)胞的增殖。隨后將穩(wěn)定表達(dá)miR-126的肺癌細(xì)胞皮下注人裸鼠體內(nèi)，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組的腫瘤生長(zhǎng)得到明顯抑制。有證據(jù)表明miRNA在某些腫瘤類(lèi)型中起著調(diào)節(jié)RTKs的作用。EGFR在一些腫瘤類(lèi)型中如肺癌中過(guò)表達(dá)，因此，在肺癌或者其他惡性腫瘤中利用針對(duì)EGFR的靶向藥物來(lái)抑制其活動(dòng)。

3.2 miRNA與肺癌的早期診斷

正常組織和腫瘤組織中miRNAs表達(dá)明顯改變，且miRNAs在不同腫瘤中具有特定的表達(dá)模式，miRNAs在腫瘤中表達(dá)的這些特點(diǎn)為肺癌的診斷開(kāi)辟了一條嶄新途徑，并且已經(jīng)在包括肺癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤中得到證實(shí)[11]。

Wei等[12]應(yīng)用RT-PCR 法，研究63例NSCLC患者和30例健康對(duì)照組血漿中的miR-21 表達(dá)情況，NSCLC患者的血漿miR-21 水平明顯高于年齡、性別匹配的對(duì)照組。Liang的研究表明miR-34b/34c/449在肺腺癌中陽(yáng)性檢測(cè)率為87%，鱗狀細(xì)胞癌為82%[13]。Yanaihara 等[14]共發(fā)現(xiàn)6 種miRNAs( miR-205、- 99b、- 203、- 202、- 102 和- 204-pre)在肺腺癌和肺鱗癌中的表達(dá)存在顯著差異這些研究表明，miRNAs可能是以正常組織生理活性為背景診斷惡性生長(zhǎng)的1種有效工具。另外發(fā)現(xiàn)，miRNA表達(dá)與細(xì)胞分化水平相關(guān)。Mascaux等[15]利用熒光支氣管鏡活檢正常組織、異常增生、原位癌、浸潤(rùn)性鱗癌等不同病理過(guò)程組織，發(fā)現(xiàn)miR-32、miR-34c表達(dá)呈線性下降，miR-142-3p、miR-9則上升。

循環(huán)中miRNAs對(duì)于腫瘤診斷的效用也得到了研究，突出了它們作為腫瘤檢測(cè)的非侵入性診斷工具的潛能。一項(xiàng)研究對(duì)肺癌及結(jié)腸癌患者中特定的血清miRNA表達(dá)譜進(jìn)行了鑒定，而且miR-25和miR-223在一個(gè)75例健康捐贈(zèng)者及152例非小細(xì)胞肺癌患者的獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中得到了驗(yàn)證，提示miR-25和miR-223可以作為非小細(xì)胞肺癌的診斷標(biāo)識(shí)物[16]。有報(bào)道稱其他miRNAs如miR-141和miR-21分別對(duì)前列腺癌的發(fā)生具有預(yù)測(cè)作用并可作為診斷B細(xì)胞淋巴瘤的生物學(xué)標(biāo)志物[17]。

Let-7a miRNA在NSCLC細(xì)胞和組織中有異常表達(dá)已被證實(shí)。Chen等[18]發(fā)現(xiàn)血清中包括let-7在內(nèi)的miRNA水平穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，其血清水平可較好地指示包括癌癥在內(nèi)的多種疾病，可以作為潛在的生物標(biāo)志物檢測(cè)各種癌癥和其他疾病。Jeong 等[19]應(yīng)用RT-PCR 方法分析35 例NSCLC 患者和30 名健康對(duì)照組血清中的let-7a 表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)NSCLC 患者的let-7a 表達(dá)水平明顯低于健康對(duì)照組； 而且血清學(xué)let-7a 低表達(dá)者腫瘤組織中的let-7a 水平也呈低表達(dá)。

3.3 miRNA與肺癌的治療

對(duì)由miRNAs調(diào)節(jié)的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行深入研究將有助于鑒定其他用于預(yù)測(cè)現(xiàn)行治療方法的miRNAs，并為臨床醫(yī)生對(duì)患者進(jìn)行分層并將個(gè)性化治療方案最優(yōu)化提供額外的工具。

放療是目前肺癌治療的常用方法之一。Weidhaas等[20]在體外培養(yǎng)的肺癌細(xì)胞和線蟲(chóng)體內(nèi)過(guò)表達(dá)let-7，發(fā)現(xiàn)其輻射敏感性增高，輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡增多；而降低let-7水平則產(chǎn)生輻射抵抗。Shin 等[21]在分析電離輻射后A549 細(xì)胞中miRNAs表達(dá)變化后證實(shí)，A549 細(xì)胞接受20 Gy和40 Gy放射后，miRNAs分別有4 種和10 種改變，并且這些變化的miRNAs與放射引起的細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期調(diào)控等有關(guān)。

靶向療法的出現(xiàn)意味著特殊肺癌亞型的分子分類(lèi)可以進(jìn)一步指導(dǎo)個(gè)體化治療模式并改善患者的預(yù)后。Bertino 等[22]提出了"miRNAs的藥物基因組學(xué)"的概念。拮抗miRNA(antagomir)是一類(lèi)治療性RNA 分子，其功能是抑制miRNA的發(fā)揮作用。如用antagomir-17-5p 給藥2周，30% 的腫瘤得到徹底抑制[23]。用1種miRNA抑制劑antagomir[24]處理致瘤性miR-17-5p導(dǎo)致30%的小鼠發(fā)生完全的腫瘤衰退[23]。在小鼠和靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物的其他研究結(jié)果表明，使用鎖核酸替換抑制劑可以有效地沉默miR-122，而且膽固醇結(jié)合也沒(méi)有證據(jù)表明治療相關(guān)的細(xì)胞毒作用[25]，支持這些方法在臨床應(yīng)用中的發(fā)展。大量研究[26]已經(jīng)表明，表皮生長(zhǎng)因子受體( epidermal growth factor receptor，EGFR) 過(guò)度表達(dá)和( 或) 激活與NSCLC 患者生存期短及預(yù)后差及放化療敏感性下降密切相關(guān)，EGFR 與miRNAs間的關(guān)系已經(jīng)成為肺癌研究的一大熱點(diǎn)。

針對(duì)miRNAs的作用機(jī)理開(kāi)發(fā)肺癌特異性的治療藥物，在一些研究實(shí)驗(yàn)中顯示了令人鼓舞的效果，不同于miRNA變種DNA，miRNA抑制劑不被miRNA的生物通路處理。這些抑制劑化學(xué)性的改變單股寡核苷酸對(duì)成熟miRNA的互補(bǔ)。這種化學(xué)修飾包括硫代硫酸、2'-O-甲基化[27]和鎖核酸替換增加了它們對(duì)核酸酶降解作用的耐受。這些抑制劑可以結(jié)合到RISC復(fù)合體中成熟的miRNA并作為競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑發(fā)揮作用，但也可以結(jié)合pri-miRNA 或pre-miRNA并消除它們的加工，從細(xì)胞核出來(lái)或結(jié)合到RISC復(fù)合體?？偠灾趍iRNA的治療方法具有巨大但未實(shí)現(xiàn)的潛能。

3.4 miRNA與肺癌的預(yù)后和轉(zhuǎn)移判斷

miRNAs主要參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，提示這些調(diào)節(jié)因子可能對(duì)于獲取診斷及預(yù)后信息有特別的作用。當(dāng)前研究表明，經(jīng)miRNA譜分析的腫瘤與正常組織相比，具有不同的miRNA表達(dá)[28]，且認(rèn)為miRNA可作為肺癌預(yù)后判斷指標(biāo)。Yu等[29]對(duì)112 例NSCLC 患者進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)Cox 模型和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分發(fā)現(xiàn)了5 個(gè)預(yù)測(cè)NSCLC 治療效果的miRNA 信號(hào)。一項(xiàng)在肺癌中的研究表明mir-155高表達(dá)及l(fā)et-7a-2低表達(dá)與患者預(yù)后有關(guān)[30]。一項(xiàng)143例肺癌切除患者的獨(dú)立研究表明let-7的低表達(dá)的患者生存期顯著縮短，而與肺癌的分期無(wú)關(guān)[31]。

一些其他類(lèi)型的miRNAs也可能具有診斷及判斷預(yù)后的價(jià)值。這些miRNAs包括保護(hù)性let-7和miR-221以及高危險(xiǎn)的miR-137、miR-372和 miR-182，它們可以用于預(yù)測(cè)肺癌患者生存的可能性。Gallardo 等[32]分析了70 例NSCLC 患者的腫瘤組織，發(fā)現(xiàn)miR-34 家族在腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)且與術(shù)后復(fù)發(fā)率高有關(guān)。多項(xiàng)研究結(jié)果表明大多數(shù)保護(hù)性的miRNAs在肺癌中的表達(dá)通常是下調(diào)的，而與高風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)的miRNAs的表達(dá)往往上調(diào)[33]，這種miRNAs的差別表達(dá)可能具有診斷意義及判斷預(yù)后的價(jià)值。Hu等[34]最近研究報(bào)道基于Solexa 測(cè)序方法在血清中檢測(cè)出的4 種miRNAs組合( miR-486、-30 d、-1 和-499) 能夠準(zhǔn)確預(yù)測(cè)Ⅰ至Ⅲa 期NSCLC 患者的預(yù)后。

關(guān)于miRNA的研究日趨成熟，問(wèn)題正由miRNA是否在腫瘤中區(qū)別表達(dá)轉(zhuǎn)向miRNA是否具有治療效用。人類(lèi)腫瘤譜已經(jīng)鑒定出與風(fēng)險(xiǎn)、診斷、預(yù)后和治療反應(yīng)相關(guān)的標(biāo)記。與正常組織相比惡性腫瘤細(xì)胞中高度保守的非編碼基因的區(qū)別表達(dá)為疾病的進(jìn)展提供更好的理解。目前尚無(wú)系統(tǒng)研究miRNA與肺癌的發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，miRNA 與基因表達(dá)調(diào)控方式的精細(xì)調(diào)節(jié)機(jī)制還不清楚，miRNA在細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育中的作用機(jī)理亦不清楚，這一領(lǐng)域正進(jìn)入系統(tǒng)生物學(xué)，通過(guò)它們相互作用及功能把我們從單一miRNAs及一種或幾種主要靶點(diǎn)的研究帶入對(duì)調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)更全面的探索，并將miRNAs整合到已存在的信號(hào)通路、代謝、蛋白質(zhì)相互作用及基因調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。

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