方宏嬌 牛 伶 鮑揚(yáng)漪 鮑 健 李曉英

肺癌組織中高表達(dá)COX-2，與多藥耐藥性(multidrug resistance,MDR)的形成有關(guān)[1]。MDR已經(jīng)明確的機(jī)制之一是某些耐藥蛋白的過(guò)表達(dá)，其中MDR1及MRP1研究最多。在人肝癌[2]、小鼠腎癌[3]、人乳腺癌[4]等研究中均提示COX-2參與調(diào)控MDR1表達(dá)，并介導(dǎo)耐藥性的產(chǎn)生。本實(shí)驗(yàn)選擇高表達(dá)COX-2及MRP1的肺腺癌A549細(xì)胞株[5]，以Celecoxib為干預(yù)因素，觀(guān)察其對(duì)A549細(xì)胞株的生長(zhǎng)抑制情況及COX-2與MRP1表達(dá)水平的影響。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

人肺腺癌細(xì)胞株A549 購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所細(xì)胞庫(kù)。試劑:Celecoxib (大連輝瑞制藥有限公司)；培養(yǎng)基及胎牛血清(Gibco)；胰酶(GICICO)；COX-2引物、MRP1引物、β-actin引物(上海生工技術(shù)有限公司)；Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas)；PCR試劑和Taq DNA聚合酶(Fermentas)；瓊脂糖凝膠(OXOID)；DNA Marker(Fermentas)；RIPA細(xì)胞裂解液、BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)；SDS(serva)；甘氨酸(AMRESCO)；PVDF膜(millipore)；電化學(xué)發(fā)光試劑盒(Pierce)；甲叉雙丙烯酰胺(AMRESCO)；一抗兔抗人COX-2單克隆抗體(Biowprlde)；一抗兔抗人MRP-1單克隆抗體(Stan Cruz)；一抗鼠抗人β-actin單克隆抗體、羊抗兔及羊抗鼠(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2 主要儀器

細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Forma 370)；酶標(biāo)儀(美國(guó)BIO-RAD 680)；PCR儀(2720，美國(guó)ABI公司)；DYY-6B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(北京六一儀器廠(chǎng))；TGL-18R冷凍離心機(jī)(黑馬儀器公司)；GSM凝膠圖像分析管理系統(tǒng)(珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司)；PVDF膜、垂直板凝膠電泳及電轉(zhuǎn)移系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad)；HE-120水平電泳儀(中國(guó)天能公司) ；垂直板電泳槽(北京市六一儀器廠(chǎng))；X膠片(Kodak)。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) A549細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置于5% CO2、飽和濕度、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞為貼壁生長(zhǎng)，0.125%的胰蛋白酶2 ml消化傳代，2天換液并傳代一次。

1.3.2 MTT比色法檢測(cè)Celecoxib對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞活性 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A(yíng)549細(xì)胞按104/孔接種于96孔培養(yǎng)板,每孔加液量100 μl。24 h后換液分組干預(yù)，設(shè)空白調(diào)零組、對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組：Celecoxib干預(yù)濃度分別為0.5、5、25、50、100 μmol/l，每個(gè)藥物濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔；干預(yù)48 h后，每孔加入5 μg/ml的MTT 20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，取出培養(yǎng)板，每孔加入DMSO 150 μl，水平搖床振蕩10 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)測(cè)定各孔吸光度(A值)。根據(jù)以下公式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率,抑制率(%)=1-(實(shí)驗(yàn)組A 值-空白組A值)/(對(duì)照組A值-空白組) ×100%。

1.3.3 RT-PCR法檢測(cè)A549細(xì)胞COX-2及MRP1 mRNA的表達(dá)水平 RNA的提?。好靠兹?05個(gè)細(xì)胞接種到24孔板，然后分別用25、50、100 μmol/l Celecoxib干預(yù)24 h及100 μmol/l Celecoxib干預(yù)12、24、36、48 h。干預(yù)后，2000 g離心2 min收集細(xì)胞，冷PBS洗滌2次；加入1ml Trizol進(jìn)行細(xì)胞裂解后加入0.2 ml氯仿，劇烈振蕩15s，室溫放置3 min；4℃ 10000 g離心15 min，吸出上清至另一EP管中；加入0.5 ml異丙醇，顛倒混勻后室溫放置10 min；4℃ 12 000 g離心10 min；加入1 ml 70%乙醇洗滌，4℃ 7 500 g離心5 min，棄上清，室溫干燥后加入RNase-free水溶解RNA，用核酸蛋白濃度測(cè)定儀測(cè)定RNA樣品的純度。RT反應(yīng)：在0.2 ml EP管中，加入總RNA 8 μl、10 μM Oligo(dT)1 μl、RNase-free水4 μl,70℃加熱10 min，立即冰浴3 min；隨即加入5×M-MLV Buffer 4.0 μl、25 mM MgCl21 μl、10 mM dNTP 0.5 μl、RNasin 0.5 μl；37℃加熱5 min；加入M-MLV 1 μl，混勻后離心，42℃ 60 min，70℃ 10 min，即得cDNA，加入DEPC水80 μl。PCR反應(yīng)：取上述反應(yīng)液5 μl，加入到含有10×Taq Buffer 2.5 μl、25 mM MgCl21.5 μl、10 mM dNTP 0.5 μl、上游引物0.5 μl、下游引物0.5 μl、Taq酶 1μl、水13.5 μl的PCR反應(yīng)管中，分別按試劑盒反應(yīng)條件進(jìn)行產(chǎn)物擴(kuò)增，然后在1.5%瓊脂糖凝膠上以120 v電泳30 min，拍照。

1.3.4 Western blot法檢測(cè)COX-2及MRP1的蛋白表達(dá)水平 將106個(gè)A549細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，設(shè)50 μmol/l、100 μmol/l Celecoxib、空白組3組，分別干預(yù)72 h后提取細(xì)胞總蛋白質(zhì)，采用Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，然后加入等量的2×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，沸水浴3 min后在SDS-PAGE膠中以100 V充分分離蛋白，100 V恒壓濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上。TBST洗膜(10 min×3次)，加入5%脫脂奶粉，室溫封閉2 h。加入一抗4℃緩慢搖動(dòng)孵育過(guò)夜后，TBST再次洗膜(10 min×3次)，然后加入二抗室溫孵育2 h，洗膜后應(yīng)用發(fā)光試劑盒顯示蛋白質(zhì)條帶。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 Celecoxib對(duì)A549細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用

Celecoxib對(duì)A549細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用呈明顯劑量效應(yīng)關(guān)系，隨著Celecoxib濃度從0.5 μmol/l 增高到100.0 μmol/l 時(shí)，其抑制作用越強(qiáng)，差異有顯著性(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

圖1 不同濃度Celecoxib對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)抑制曲線(xiàn)

2.2 不同濃度Celecoxib對(duì)COX-2及MRP1 mRNA表達(dá)的影響

25 μmol/l、50 μmol/l、100 μmol/l Celecoxib分別作用A549細(xì)胞24 h后，檢測(cè)其COX-2及MRP1的mRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示3個(gè)濃度Celecoxib 干預(yù)后A549細(xì)胞中COX-2及MRP1基因表達(dá)水平均下降，且Celecoxib濃度越高，其表達(dá)水平下降越明顯，差異有顯著性(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

100 μmol/l Celecoxib分別干預(yù)A549細(xì)胞12、24、36及48 h，結(jié)果顯示，4個(gè)時(shí)間點(diǎn)COX-2及MRP1 mRNA表達(dá)量均有下降，作用時(shí)間越長(zhǎng)，抑制作用越強(qiáng)，差異有顯著性，見(jiàn)圖3。

2.3 不同濃度Celecoxib對(duì)COX-2和MRP1 蛋白表達(dá)水平的影響

50、100 μmol/l Celecoxib干預(yù)A549細(xì)胞，結(jié)果顯示，Celecoxib亦可下調(diào)A549細(xì)胞中COX-2和MRP1 的蛋白表達(dá)水平，100 μmol/l組較50 μmol/l組抑制作用明顯，有顯著性差異(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

圖2 不同濃度Celecoxib對(duì)A549細(xì)胞中COX-2及MRP1 mRNA表達(dá)的影響

圖3 對(duì)A549細(xì)胞作用不同時(shí)間COX-2及MRP1mRNA表達(dá)情況

圖4 不同濃度Celecoxib對(duì)A549細(xì)胞中COX-2及MRP1蛋白表達(dá)的影響

2.4 肺腺癌A549細(xì)胞中COX-2 mRNA與MRP1 mRNA表達(dá)的相關(guān)性

采用Pearson Correlation分析不同影響因素對(duì)COX-2、MRP1這對(duì)變量的相關(guān)變化，結(jié)果顯示COX-2與MRP1基因表達(dá) (γ=0.981，P<0.01)和蛋白表達(dá)(γ=0.884，P<0.01)均顯著相關(guān)，提示在COX-2和MRP1共同表達(dá)的前提下，COX-2表達(dá)可能是MRP1表達(dá)的一個(gè)函數(shù)變量，MRP1表達(dá)具有COX-2依賴(lài)性。

3 討論

MRP1是ABC家族的主要成員之一，主要是作為藥物泵功能將藥物泵出細(xì)胞外或?qū)⑺幬锓蛛x分小隔離體，使藥物不能與作用靶點(diǎn)結(jié)合而產(chǎn)生耐藥[6]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦提示肺腺癌A549細(xì)胞高表達(dá)COX-2及MRP1，與Kang的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

Celecoxib為高選擇性COX-2抑制劑，多項(xiàng)臨床研究均提示，Celecoxib聯(lián)合化放療能提高放化療的療效[7，8]。周丹等[9]研究發(fā)現(xiàn)，Celecoxib在體內(nèi)、外均能抑制肺癌生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示Celecoxib對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞有較明顯的生長(zhǎng)抑制作用，呈濃度依賴(lài)性，差異有顯著性差異，當(dāng)Celecoxib濃度為100 μmol/l時(shí)，近80%的A549細(xì)胞已被抑制。

Celecoxib還可通過(guò)下調(diào)某些耐藥蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性從而提高療效。本研究結(jié)果顯示Celecoxib可下調(diào)MRP1 mRNA及蛋白的表達(dá)水平，目前研究結(jié)果提示其可能通過(guò)以下2種方式下調(diào)MRP1表達(dá)水平：①抑制COX-2及其代謝產(chǎn)物PGE2的合成；②調(diào)控磷脂酰肌醇(-3)激酶及蛋白激酶Akt的表達(dá)水平或功能[10]。具體是何種途徑觀(guān)點(diǎn)不一，Saikawa等[11]構(gòu)建了高表達(dá)COX-2的結(jié)腸癌細(xì)胞系TR-5，發(fā)現(xiàn)COX-2高表達(dá)后MRP-1表達(dá)水平亦上調(diào)，導(dǎo)致TR-5對(duì)順鉑敏感的濃度是原始直腸癌細(xì)胞HCT-15的大約3倍。Touhey等[12]發(fā)現(xiàn)COX-2抑制劑可抑制MRP的藥物泵作用，且COX-2本身也被顯著抑制，提示COX-2表達(dá)與MRP活性具有高度正相關(guān)性。但Kang等[6]研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)MRP1表達(dá)所需的Celecoxib濃度要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于抑制COX所需濃度，且與COX-2及PGE2表達(dá)水平無(wú)關(guān)，故其認(rèn)為Celecoxib下調(diào)MRP1為非COX依賴(lài)途徑。本研究中Celecoxib可同時(shí)下調(diào)肺腺癌A549細(xì)胞中COX-2及MRP1 mRNA的表達(dá)水平，兩者受抑制程度有顯著相關(guān)性，故考慮Celecoxib可能是通過(guò)抑制COX途徑下調(diào)MRP1活性的。

本研究結(jié)果顯示，Celecoxib可通過(guò)直接抑制肺腺癌A549細(xì)胞的增殖及下調(diào)耐藥基因MRP1基因和蛋白的表達(dá)水平，從而發(fā)揮抗腫瘤作用，下調(diào) MRP1可能是通過(guò)COX依賴(lài)途徑的。

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