杜蘇萌 趙金安

（太原工業(yè)學(xué)院 環(huán)境與安全工程系，山西 太原 030008）

利用黑曲霉和酵母共發(fā)酵秸稈產(chǎn)乙醇的研究

杜蘇萌 趙金安

（太原工業(yè)學(xué)院 環(huán)境與安全工程系，山西 太原 030008）

利用黑曲霉降解秸稈的效果，黑曲霉和酵母共發(fā)酵條件的優(yōu)化以及在最優(yōu)條件下產(chǎn)乙醇的效果.從秸稈腐殖質(zhì)土中篩選出9株黑曲霉，并用剛果紅鑒別培養(yǎng)基篩選出水解圈比較大的兩株菌，從p H、溫度、發(fā)酵時(shí)間對(duì)兩株菌進(jìn)行產(chǎn)纖維素酶的優(yōu)化，并將黑曲霉和酵母在最適條件下共發(fā)酵生產(chǎn)乙醇.最后得出p H＝5，溫度為32℃，發(fā)酵時(shí)間為72 h時(shí)酶活最高，液體發(fā)酵在上述適宜條件下降解秸稈72 h后接種酵母進(jìn)行共發(fā)酵24 h，生產(chǎn)出乙醇，質(zhì)量比是3%.

纖維素降解菌；篩選；酶活；共發(fā)酵；秸稈

石油的大量消耗給人們帶來(lái)了各種問(wèn)題，主要有能源危機(jī)和環(huán)境問(wèn)題，試圖開(kāi)發(fā)一種可替代性燃料緩解能源和環(huán)境問(wèn)題已經(jīng)是各國(guó)廣泛關(guān)注的焦點(diǎn)［1］.乙醇燃燒后變成水和二氧化碳對(duì)環(huán)境污染小，而且釋放能量多，因此開(kāi)發(fā)乙醇燃料已成為研究的熱點(diǎn)［2M3］.我國(guó)是農(nóng)業(yè)種植大國(guó)，每年產(chǎn)生很多玉米農(nóng)作物秸稈，這些秸稈植物質(zhì)經(jīng)過(guò)微生物發(fā)酵可以轉(zhuǎn)化成乙醇［4，5］.目前發(fā)現(xiàn)可以代謝秸稈的微生物有很多種，其中主要的一種菌包括黑曲霉［6］.本研究就是從腐爛的秸稈及秸稈下的腐殖土樣品中共篩選出9株黑曲霉，并對(duì)這9株黑曲霉進(jìn)行酶活測(cè)定，最后選出2株產(chǎn)酶高的菌株進(jìn)行不同p H、不同發(fā)酵時(shí)間、不同溫度三個(gè)條件對(duì)產(chǎn)纖維素酶能力的影響，并研究了黑曲霉與酵母共發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的效果［7］.

1 材料

1.1 試劑

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（2 mg／ml）

檸檬酸緩沖液（0.05 mol／L，p H 為5.0）

羧甲基纖維素鈉溶液（0.51%，CMC）

3，5－二硝基水楊酸試劑（DNS）

1.2 菌株

在太原市北固碾村玉米地土樣品中篩選得到9株黑曲霉，酵母為學(xué)校實(shí)驗(yàn)室保存

1.3 培養(yǎng)基

瓊脂纖維素培養(yǎng)基（MgSO4·7 H2O 1.0 g，CaCO32.0 g，（NH4）2SO42.0 g，NaCl 1.0 g，瓊脂20.0 g，加H2O定容到500 m L，自然p H，濾紙和培養(yǎng)皿大小一樣）

剛果紅培養(yǎng)基（微晶纖維素1.88 g，（NH4）2SO42.0 g，瓊脂14.0 g，MgSO40.25 g，K2HPO40.5 g，剛果紅0.2 g，加 H2O定容到1 000 m L，p H為6～7）

羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基（保藏用）

（羧甲基纖維素鈉15.0 g，KH2PO40.5 g，NaCl 6.0 g，（NH4）2SO42.0 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，CaCl20.1 g，K2HPO42.0 g，酵母粉1.0 g，加 H2O至1 000 m L，p H 為5.0），

發(fā)酵培養(yǎng)基（液體）

（秸稈粉40.0 g，（NH4）2SO42.0 g，NaCl 6.0 g，MgSO4·7 H2O 0.1 g，K2HPO42.0 g，CaCl20.1 g，酵母粉1.0 g，KH2PO40.5 g，加 H2O定容到1 000 m L，p H 為5.0）

2 方法

2.1 纖維素降解菌的初篩實(shí)驗(yàn)

將采集的秸稈土質(zhì)樣品用無(wú)菌水溶解，配制幾個(gè)稀釋度，取10－3，10－4，10－5三個(gè)稀釋度樣品均勻涂布于瓊脂纖維素培養(yǎng)基，三個(gè)稀釋度各涂布三個(gè)培養(yǎng)皿，置于恒溫培養(yǎng)箱28℃培養(yǎng)，定時(shí)觀察并記錄濾紙條的降解情況，從濾紙上的潰爛斑處挑取菌落于CMC培養(yǎng)基上進(jìn)行純化最后得到單菌落.

將分離后得到的單菌落接種在剛果紅培養(yǎng)基平板上，置于恒溫箱中28℃培養(yǎng)，挑選在培養(yǎng)皿上長(zhǎng)得快、透明水解圈比較大的單菌落，保存在CMC培養(yǎng)基上備用.

2.2 纖維素降解菌的復(fù)篩實(shí)驗(yàn)

用液體發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)初篩得到的單菌落中，定時(shí)取樣（本實(shí)驗(yàn)為24 h）測(cè)定羧甲基纖維素酶活（CMC）和還原糖的變化情況，將CMC酶活高及還原糖累積濃度高的菌種，保存在保藏培養(yǎng)基上作為備用菌種.

繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線：取6支比色管（體積為25 m L），配置成6個(gè)不同濃度的葡萄糖溶液，然后繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1：

測(cè)定羧甲基纖維素酶活（CMC）：將6個(gè)比色皿分別編號(hào)后各加入3，5-二硝基水楊酸試劑1.5 ml以鈍化酶活性.同時(shí)將比色皿置于45℃水浴鍋中預(yù)熱5～10 min，然后向各管中加入粗酶液0.1 m L，45℃繼續(xù)保溫0.5 h.保溫結(jié)束后立即向每個(gè)比色皿中各加入3，5二硝基水楊酸1.5 m L終止酶反應(yīng).搖勻后沸水浴5 min，取出冷卻后蒸餾水定容.設(shè)空白對(duì)照溶液，在波長(zhǎng)540 nm處測(cè)定吸光度值并將結(jié)果記錄.最后在上述繪制出的標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的葡萄糖含量.按以下公式計(jì)算CMC酶活力：

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

式中：G—在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得還原糖的量；n—酶液的稀釋倍數(shù)；V—酶液體積，t—時(shí)間，1 000—由mg換算成ug的換算因子.

分別測(cè)定p H＝3，4，5，6，7，8幾個(gè)p H條件下對(duì)液體培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)酶的影響，不同發(fā)酵時(shí)間0 h，24 h，48 h，72 h，96 h，120 h幾個(gè)時(shí)間段還原糖含量和酶活測(cè)定.

乙醇發(fā)酵實(shí)驗(yàn)在500 mL三角瓶中進(jìn)行，內(nèi)含200 m L液體培養(yǎng)基，接種A-2菌種10%，置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱28℃，150 r／min條件下培養(yǎng)72 h，再加入酵母接種量也為10%，放于恒溫培養(yǎng)箱28℃，下靜置培養(yǎng)24 h.

乙醇蒸餾在500 m L蒸餾瓶中進(jìn)行，內(nèi)含150 m L發(fā)酵液，內(nèi)加玻璃珠以控制沸騰速度.在100 m L容量瓶中加入10 m L蒸餾水并插入冷凝管，冷凝管延伸部分的末端浸入水中.收集餾出液，延伸部分用水沖洗后停止蒸餾.乙醇的鑒定 在硫酸介質(zhì)中，向餾出液中加入2ml的質(zhì)量比為5%重鉻酸鉀，觀察顏色是否由橙紅色變?yōu)榫G色.

3 結(jié)果與討論

3.1 結(jié)果

從表1中可以看出A-3，B-1兩個(gè)菌株的水解圈直徑比較大，產(chǎn)酶能力最強(qiáng)，選這兩株菌進(jìn)行不同發(fā)酵時(shí)間葡萄糖含量和酶活測(cè)定，如圖2，圖3.

表1 初篩9個(gè)菌株的剛果紅培養(yǎng)基水解圈直徑大小

圖2 兩株菌不同發(fā)酵時(shí)間的酶活測(cè)定

圖3 不同p H值下測(cè)得的CMC酶活曲線

從圖2上可以看出大約在72 h時(shí)兩株菌酶活最高，低于或高于72 h酶活都有所降低.

從圖3上可以看出在p H為5時(shí)兩株菌的酶活最高，低于或高于p H＝5時(shí)兩株菌酶活都有所降低.

對(duì)上述兩株菌在p H＝5，溫度為32℃下發(fā)酵72 h后接種10%的酵母，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)24 h，用質(zhì)量比為5%重鉻酸鉀溶液進(jìn)行乙醇鑒定，顏色由橙紅色變?yōu)榫G色，說(shuō)明乙醇產(chǎn)生，經(jīng)測(cè)定乙醇質(zhì)量比為3%.

3.2 討論

本研究從秸稈腐質(zhì)土中共篩選出9株黑曲霉菌，其中通過(guò)剛果紅培養(yǎng)基鑒定水解圈大小和酶活測(cè)定有2株黑曲霉菌（編號(hào)為A-3、B-1）屬于高產(chǎn)酶菌株，將這兩株菌用于后面的產(chǎn)酶因素影響和發(fā)酵條件優(yōu)化研究，最后得出p H＝5，溫度32℃，降解秸稈粉72 h時(shí)酶活最高，應(yīng)該在此條件下降解秸稈粉，達(dá)到適宜條件后接種10%的酵母，將黑曲霉和酵母進(jìn)行發(fā)酵24 h，顏色變綠可以得知生產(chǎn)出乙醇，經(jīng)測(cè)定質(zhì)量比為3%.如何提高乙醇得率有待進(jìn)一步研究.

［1］ 郭夏麗，楊小麗，李順義，王 巖.秸稈降解菌的篩選及菌種組合［J］.鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)（工學(xué)版），2010，31（1）：74-77

［2］ 胡立明，謝 宇，李 潔.黑曲霉產(chǎn)纖維素酶液體發(fā)酵條件的研究［J］.河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2007，28（1）：70-74

［3］ 馬旭光，藺海明，劉星斌.黑曲霉高產(chǎn)纖維素酶活突變株ZM-8的篩選［J］.中國(guó)飼料，2007（5）：30-32

［4］ 謝小保，譚 宏，黃小茉.黑曲霉 GD6纖維素酶液體發(fā)酵條件的研究［J］.微生物學(xué)雜志，2004，24（2）：21-23

［5］ 張素平，顏涌捷，任錚偉，等.纖維素制曲乙醇技術(shù)［J］.化學(xué)進(jìn)展，2007，19（7）：1 129-1 133

［6］ 王站勇，蘇婷婷.產(chǎn)纖維素酶黑曲霉 LN0401液體發(fā)酵條件分析［J］.遼寧石油化工大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，26（2）：28-29

［7］ 潘俊波，李 金，徐鳳華.高效纖維素降解菌的篩選［J］.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，37（2）：175-179

The Study of Fermentation Production for Fuel-Ethanol by Aspergillus.niger And Yeast

Du Sumeng Zhao Jinan
（Taiyuan institute of technology，environment and safety engineering department，Taiyuan 030008，China）

To study the effect of degrading straw using Aspergillus.niger，and to look for the best condition under which to research the effect of producing Ethanol.screen nine Aspergillus.niger from straw humus soil，and select two strains whose hydrolysis ring are larger on congo red culture medium，and study the affect of p H、temperature，fermentation time to production for enzyme，and study the fermentation production for Ethanol by Aspergillus.niger and Yeast under the most suitable condition.When the p H is 5，the temperature is 32℃the fermentation time is 72 hours，enzyme activity lies the highest.Liquid fermentation for ethanol succeed by Aspergillus.niger And Yeast after 24 hours of adding the Aspergillus.niger And Yeast.The production rate of ethanol is 3%.

Cellulose-deposing microbes；screen；enzyme activity；fermentation by Aspergillus.niger And Yeast；straw

張麗萍】

1672-2027（2012）03-0132-03

Q815

A

2012-06-22

杜蘇萌（1982-），女，山西運(yùn)城人，碩士，太原工業(yè)學(xué)院助教，主要從事微生物學(xué)研究.