朱鑫鑫，劉曉輝，趙征，于景華

（天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457）

RP-HPLC法分離和定量測定未變性的乳清蛋白成分

朱鑫鑫，劉曉輝，趙征，于景華

（天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457）

建立了一種基于反相高效液相色譜（RP-HPLC）來分離并定量測定脫脂乳、加熱脫脂乳及脫脂乳粉中未變性的乳清蛋白的分析方法。采用Venusil ASB-C8色譜柱；流速0.8 mL/min；檢測波長215 nm；柱溫30℃；流動相A為體積分?jǐn)?shù)0.1%的三氟乙酸水溶液；流動相B為體積分?jǐn)?shù)0.1%的三氟乙酸乙腈溶液；洗脫方式：流動相B開始在38%下等度洗脫2 min，然后在5 min內(nèi)上升到43%，最后在43%下等度洗脫13 min。此方法在20 min內(nèi)將4種乳清蛋白組分分離且各蛋白線性關(guān)系良好，適合定性和定量檢測未變性的乳清蛋白組分。

反相高效液相色譜（RP-HPLC）；乳清蛋白；定量分析

0 引言

乳清蛋白的成分主要有α-乳白蛋白（α-La）、牛血清白蛋白（BSA）和β-乳球蛋白（β-Lg），其變性程度是衡量脫脂乳粉品質(zhì)好壞的一個重要指標(biāo)，一般采用乳清蛋白氮指數(shù)（WPNI）法來評價(jià)，隨著研究的深入此方法已不嚴(yán)謹(jǐn)[1]，需要更精確的方法來測定其變性程度。國外學(xué)者采用色譜法，有的只分離出了α-La和β-Lg[2-3]，有的分離時(shí)間長且沒有研究β-Lg的兩種遺傳變異體[4-5]；國內(nèi)趙海霞等[6]采用RP-HPLC法僅對乳清蛋白中的α-La和β-Lg進(jìn)行分離，王浩等[7]用RPHPLC法分離出乳制品中的7中蛋白質(zhì)，但是樣品中沒有除去變性的乳清蛋白和酪蛋白，對乳清蛋白變性程度的測量造成困難。本研究為測定脫脂乳及脫脂乳粉中乳清蛋白的變性程度提供了一種有效的方法。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料與試劑

液態(tài)鮮牛奶；奶粉（包括國產(chǎn)脫脂奶粉和進(jìn)口脫脂奶粉）；標(biāo)準(zhǔn)品主要有α-La（純度≥85%）、β-Lg（純度≥90%）、β-LgA（純度≥90%）、β-LgB（純度≥90%）、BSA（純度≥90%）;乙腈（色譜級，純度≥99.9%）；三氟乙酸（TFA）、鹽酸等試劑均為國產(chǎn)分析純；液相所用到的水均為三蒸水。

1.2 儀器與設(shè)備

pH計(jì)；9N-100牛奶分離機(jī)；K9840凱氏定氮儀；L2000高效液相色譜儀及數(shù)據(jù)處理平臺；色譜柱Venusil ASB-C8（250 mm×4.6 mm，5 μm，300）；0.45 μm的尼龍膜。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

鮮牛奶除去脂肪后取100 mL，在水浴中75℃下加熱10 min，然后在冰水浴中迅速冷卻；另取100 mL脫脂乳，用于測定；奶粉樣品，精確稱取5.0 g復(fù)原于50 mL的去離子水中，25℃下攪拌2 h；用HCl調(diào)節(jié)乳及復(fù)原乳pH值至4.6，然后在4℃下6 500 g離心30 min，取上清液進(jìn)行測定。上樣前用0.45 μm的尼龍膜過濾。

1.3.2 高效液相色譜條件

色譜柱為Venusil ASB-C8（250 mm×4.6 mm，5 μm，300）；流速為0.8 mL/min；進(jìn)樣量為10 μL；檢測波長為215 nm；柱溫30℃；洗脫時(shí)間20 min；流動相A為體積分?jǐn)?shù)0.1%的三氟乙酸水溶液；流動相B為體積分?jǐn)?shù)0.1%的三氟乙酸乙腈溶液；采用梯度洗脫方式。

梯度洗脫：流動相B在初始比例38%（流動相A為62%）下等度洗脫2 min，然后在5 min內(nèi)上升到43%（變化率為1%），最后在43%下等度洗脫13 min。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及其檢測限的測定

配制一定濃度的混標(biāo)：α-La（質(zhì)量濃度2 g/L）；β-LgA（質(zhì)量濃度1.8 g/L）；β-LgB（質(zhì)量濃度1.4 g/L）；BSA（質(zhì)量濃度0.4 g/L）。然后每次稀釋2倍，稀釋9次，得到10組混合標(biāo)準(zhǔn)品的濃度梯度。用RP-HPLC檢測混標(biāo)中4種蛋白的質(zhì)量濃度，以蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品濃度為縱坐標(biāo)，峰面積為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算最小檢出限。

1.3.4 穩(wěn)定性、重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

分別取處理好的原脫脂乳和進(jìn)口脫脂乳粉復(fù)原乳的上清液兩份，一份即時(shí)檢測，另一份室溫放置24 h后檢測；按照本研究方法進(jìn)行乳清蛋白成分測定，每個樣品做3次平行，分別計(jì)算4種蛋白的保留時(shí)間、峰面積和含量的標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD值）。

1.3.5 回收率的測定

取處理好的原脫脂乳和進(jìn)口脫脂乳粉復(fù)原乳的上清液各3份，加入特定質(zhì)量濃度的混標(biāo)，通過0.45 μm的尼龍膜過濾后測定其中的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，根據(jù)數(shù)據(jù)分析得出回收率。

1.3.6 樣品中未變性乳清蛋白成分的測定

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測定4種樣品中未變性的BSA，α-La，β-LgB和β-LgA的質(zhì)量濃度；用凱氏定氮法測定未變性的總?cè)榍宓鞍踪|(zhì)量濃度并計(jì)算加熱脫脂乳粉中各乳清蛋白的變性程度。

式中：M1為原脫脂乳中未變性的乳清蛋白的質(zhì)量濃度；M2為加熱脫脂乳中未變性的乳清蛋白的質(zhì)量濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 未變性乳清蛋白樣品的獲得

RP-HPLC法測定乳中未變性乳清蛋白成分的前提是將變性的乳清蛋白和酪蛋白除去。除去變性的乳清蛋白和酪蛋白的方法有飽和NaCl鹽析法和等電點(diǎn)沉淀法。飽和NaCl處理完樣品后，由于溶液仍為飽和NaCl溶液，會堵塞色譜柱，一般不用于色譜分析中；另外飽和NaCl鹽析法主要用于測定脫脂乳粉的乳清蛋白氮氮指數(shù)（WPNI的測量）[8]，是測定總的乳清蛋白變性的方法而測量乳清蛋白的成分時(shí)一般用等電點(diǎn)沉淀法。變性的乳清蛋白和酪蛋白結(jié)合，在pH值為4.6時(shí)（酪蛋白的等電點(diǎn)）會發(fā)生凝集作用，離心或者過濾后可以除去[9]。目前國內(nèi)外研究中用于沉淀酪蛋白的試劑主要有乳酸和鹽酸兩種，其中乳酸多用于電泳實(shí)驗(yàn)[10]，鹽酸則多用于液相實(shí)驗(yàn)[9]。因此本研究用鹽酸作為pH調(diào)節(jié)劑，采用等電點(diǎn)沉淀法除去變性的乳清蛋白和酪蛋白，然后6 500 g離心30 min，取上清液進(jìn)行測定。

2.2 RP-HPLC條件的優(yōu)化

2.2.1 色譜柱的選擇

根據(jù)α-La，β-Lg，BSA3種蛋白的空間結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，孔徑為300的C8色譜柱和C18色譜柱都可以用。對兩種色譜柱分離的比較發(fā)現(xiàn)，C18色譜柱對于β-LgA與β-LgB的分離較延后并且β-LgB與β-LgA的分離度不如C8色譜柱（1.9以上），本實(shí)驗(yàn)選用Venusil ASB-C8（250 mm×4.6 mm，5 μm，300）色譜柱。

2.2.2 檢測波長的選擇

由于蛋白質(zhì)中含有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸，在280 nm處有紫外吸收。而肽鍵在200～220 nm處有紫外吸收并比280 nm處的吸收強(qiáng)幾十倍[10]。本研究在280，215和220 nm下做對比實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：280 nm處4種蛋白峰面積明顯減小，而220 nm的檢測靈敏度也低于215 nm，因此本實(shí)驗(yàn)選用215 nm作為檢測波長。

2.2.3 流速的選擇

流速對蛋白質(zhì)的出峰時(shí)間影響極大，本實(shí)驗(yàn)用1，0.8和0.5 mL/min進(jìn)行對比試驗(yàn)。結(jié)果表明，流速為0.8 mL/min時(shí)出峰時(shí)間和各蛋白分離效果都是最佳。

2.2.4 洗脫條件優(yōu)化

RP-HPLC法分離蛋白常用三氟乙酸水溶液和三氟乙酸乙腈溶液進(jìn)行梯度洗脫。本研究用流動相A體積分?jǐn)?shù)為0.1%的三氟乙酸水溶液（0.1%TFA+99.9% H2O），流動相B體積分?jǐn)?shù)為0.1%的三氟乙酸乙腈溶液（0.1%TFA+99.9%乙腈）。當(dāng)流動相B的初始比例低于38%（流動相A大于62%）時(shí)，樣品中的雜質(zhì)與BSA出峰重疊從而影響B(tài)SA分離，并且α-La的峰與它前邊兩個小峰的分離效果不好；當(dāng)初始比例大于38%時(shí)，BSA與雜質(zhì)一起洗脫而檢測不到，并且β-LgA與β-LgB的峰型不好，因此本實(shí)驗(yàn)確定初始比例為38%。在兼顧出峰時(shí)間和分離度的前提下，本研究最終選取以下洗脫方式：流動相B在初始比例38%下（流動相A為62%）等度洗脫2 min，然后在5 min內(nèi)上升到43%（變化率為1%），最后在43%（流動相A為57%）處等度洗脫13 min，此時(shí)4種蛋白質(zhì)按時(shí)間順序BSA、α-La、β-LgB與β-LgA都洗脫出來并且離效果最好。圖1為4種乳清蛋白混標(biāo)分離結(jié)果，其中β-LgA與β-LgB在標(biāo)準(zhǔn)品中的分離度為1.84。

2.3 樣品中4種乳清蛋白成分的分離

在上述洗脫條件下對原脫脂乳、加熱脫脂乳、國產(chǎn)脫脂乳粉和進(jìn)口脫脂乳粉4種樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖2所示。由圖2可以看出，由于樣品中BSA的含量少（約占總?cè)榍宓鞍椎?%），峰型較小，與α-La峰前邊兩個小雜峰（實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在樣品和標(biāo)準(zhǔn)品中α-La峰前都會有兩個小雜峰）的分離比較困難，通過調(diào)整流動相B的初始比例和等度洗脫時(shí)間發(fā)現(xiàn)當(dāng)初始比例為38%并且保持洗脫2 min時(shí)，BSA的分離效果最好，并且α-La與其前邊的兩個雜質(zhì)達(dá)到基線分離。

由圖2可以看出，4種樣品中BSA、α-La、β-LgB和β-LgA 4種乳清蛋白成分都達(dá)到基線分離，其中β-LgB與β-LgA在原脫脂乳中的分離度達(dá)到1.96。由圖c與d可以看出，本實(shí)驗(yàn)所用國產(chǎn)脫脂乳粉中β-LgB和β-LgA的含量明顯低于進(jìn)口脫脂乳粉，這反映了目前我國脫脂乳粉的生產(chǎn)現(xiàn)狀：國內(nèi)乳粉的加工至今仍采用延續(xù)多年的加工工藝，生產(chǎn)的脫脂乳粉幾乎全部是高溫加熱脫脂乳粉乳[1]；此外，從分離結(jié)果看出，在脫脂乳粉生產(chǎn)期間，經(jīng)過預(yù)熱、殺菌、濃縮和噴霧干燥時(shí)β-Lg產(chǎn)生了新的變異體，對奶粉中β-LgB和β-LgA的色譜分離有一定影響。本方法用于測定脫脂乳及脫脂乳粉中天然存在的β-LgB和β-LgA，而對于加工過程中出現(xiàn)的新的變異體的測定需要進(jìn)一步研究。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制及檢測限分析

按照上述最優(yōu)條件以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為縱坐標(biāo)，色譜峰峰面積為橫坐標(biāo)分別制作4種乳清蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線。對樣品進(jìn)行3次測定，計(jì)算3次標(biāo)準(zhǔn)偏差并求出最小檢測限。具體數(shù)據(jù)如表1所示。

由表1可以看出，4種蛋白在設(shè)定的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好?？梢杂么藰?biāo)準(zhǔn)曲線定量測定脫脂乳、加熱乳及脫脂乳粉中未變性的乳清蛋白成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2.5 方法的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性分析

表2為方法的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。由表2可以看出，保留時(shí)間、峰面積和乳清蛋白成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）值均小于5%，說明本方法符合定量測定4種蛋白質(zhì)的要求，而且重現(xiàn)性和穩(wěn)定性良好。

2.6 回收率實(shí)驗(yàn)

表3為原脫脂乳和進(jìn)口脫脂乳粉中4種乳清蛋白成分的回收率。表3可以看出，此方法4種乳清蛋白成分的回收率平均在93.0%～97.0%之間，RSD在0.3%～4.1%之間，顯示出本方法有較高的回收率。

表1 4種蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢測限

表2 方法的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性（標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）值）%

2.7 樣品中未變性的乳清蛋白成分的測定

表4為4種樣品中未變性乳清蛋白成分的質(zhì)量濃度、總未變性乳清蛋白的質(zhì)量濃度和加熱脫脂乳中乳清蛋白的變性程度。由表4可以看出，熱處理會造成乳清蛋白成分的變性，不同成分變性程度不同，其中BSA變性程度最大；不同的乳粉產(chǎn)品其乳清蛋白的變性程度不同，說明不同的加工工藝（預(yù)熱、殺菌、濃縮和噴霧干燥）對乳清蛋白的影響不同。本方法可檢測出不同產(chǎn)品之間乳清蛋白質(zhì)量濃度的差異和不同乳清蛋白組分間變性程度的差異，為定性和定量研究脫脂乳及脫脂乳粉中乳清蛋白成分提供可靠的測量方法。

表3 4種乳清蛋白成分的回收率

表4 樣品中4種乳清蛋白成分的質(zhì)量濃度分析結(jié)果（n=3）

3 結(jié)論

本研究建立了一種分離并定量測定未變性的乳清蛋白的RP-HPLC法，此方法使用C8色譜柱采用梯度洗脫的方式分離出BSA，α-La，β-LgB和β-LgA 4種乳清蛋白成分，并大大縮短了洗脫時(shí)間（20 min），穩(wěn)定性和重復(fù)性優(yōu)越，回收率在93%～97%，RSD都小于5%，并且各蛋白線性關(guān)系良好可以進(jìn)行定量測定。不同的溫度、pH值、離子環(huán)境和壓強(qiáng)都會造成乳清蛋白的變性[11]，許多學(xué)者用SDS-PAGE[12]或者Native-PAGE[13]法測定乳清蛋白的變性，其時(shí)間長，數(shù)據(jù)處理麻煩，重復(fù)性差，而本研究克服了這些缺點(diǎn)，提供了一種快速、準(zhǔn)確地定性和定量分析乳清蛋白成分變性的方法；另外乳粉加工過程中預(yù)熱、殺菌、濃縮以及噴霧干燥等工藝以及同一工藝不同的加工條件都會造成乳清蛋白的變性，本研究也可以為乳粉以及低熱脫脂乳粉的生產(chǎn)過程中對乳清蛋白變性程度的檢測提供方法參考。

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Isolation and quantification of main composition with undenatured whey protein with reverse-phase HPLC

ZHU Xin-xin,LIU Xiao-hui，ZHAO Zheng，YU Jing-hua
(Department of Food Engineering and Biotechnology,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300475, China)

Four main proteins(α-La，β-LgA，β-LgB，BSA)with the undenatured whey protein in skim milk，heat treatment skim milk and skim milk powder were isolated and determined by RP-HPLC.It was achieved by using a Venusil ASB-C8column(250 mm×4.6 mm，5 μm，300˙)at a flow-rate of 0.8 mL/min,column temperature 30℃and monitored with 215 nm.A gradient of solvent A 0.1%(v/v)TFA dissolved in water and B consisting of 0.1%(v/v)TFA in acetonitrile was applied.The gradient started with 37%of solvent B keeping for 2min and was increased to 43%within 5min and then kept at 43%for 13 min.This method successfully separated these four proteins within twenty minutes.With good linear correlations about the four proteins,it was used to qualitative and quantitative analysis the composition of the undenatured whey proteins.

RP-HPLC;whey protein;quantitative analysis

TS252.7

A

1001-2230（2012）05-0051-04

2011-11-08

“十一五”國家科技支撐計(jì)劃資助項(xiàng)目（2009BADC1B02）；天津科技大學(xué)引進(jìn)人才科研啟動基金。

朱鑫鑫（1985-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称芳庸ぜ夹g(shù)。

于景華