何楓媛，葛武鵬，衛(wèi)偉，朱紅，劉銳

(西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西楊凌 712100)

提高雙歧桿菌活力的優(yōu)化增菌發(fā)酵技術(shù)研究

何楓媛，葛武鵬，衛(wèi)偉，朱紅，劉銳

(西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西楊凌 712100)

以MRS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，選取添加4種不同的增菌因子，即：魔芋膠水解物、薏苡仁浸提液、山藥浸提液、菊粉，以單因素實(shí)驗(yàn)篩選出較優(yōu)的3種增菌因子，通過正交實(shí)驗(yàn)以活菌數(shù)為活力評價(jià)指標(biāo)，確定最佳增菌配方。結(jié)果表明，單因素實(shí)驗(yàn)中，魔芋膠水解物增菌效果最佳，當(dāng)其在MRS培養(yǎng)基中添加體積分?jǐn)?shù)為35 mL/L時，雙歧桿菌的活菌數(shù)可達(dá)1.21×109mL-1；正交實(shí)驗(yàn)所得最佳增菌配方為：MRS+魔芋膠水解物（30 mL/L）+薏苡仁浸提液（25 mL/L）+菊粉（20 g/L），37℃厭氧培養(yǎng)36 h，活菌數(shù)可達(dá)7.4×109mL-1。

雙歧桿菌；增菌因子；活菌數(shù)；正交實(shí)驗(yàn)

0 引言

雙歧桿菌是定植于人體腸道內(nèi)并促進(jìn)人體健康的一種益生菌[1]。其多種生物學(xué)功能已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用[2-3]。雙歧桿菌專性厭氧，對生長條件要求苛刻，活性保持較難，其生長繁殖和體外培養(yǎng)需要多種雙歧因子[4-6]。

低聚糖是一類雙歧因子。Gibson等報(bào)道了果聚糖對雙歧桿菌增殖的影響[7]。秦湘紅等人研究認(rèn)為用魔芋制備葡甘露低聚糖可促雙歧桿菌體外生長[8]。李香串研究顯示薏苡仁浸提液可促進(jìn)雙歧桿菌的增殖[9]。張火云等研究顯示山藥粗多糖（DOT-X）對雙歧桿菌的增殖起主要作用[10]。殷洪等研究表明菊粉可使有益菌群在腸道中占有優(yōu)勢[11]。用多種增菌因子復(fù)合增殖雙歧桿菌的研究還鮮見報(bào)道。

本文主要研究魔芋膠水解物、薏苡仁浸提液、山藥浸提液、菊粉這4種物質(zhì)對雙歧桿菌體外增殖的影響，以期為該菌的體外培養(yǎng)提供新的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雙歧桿菌B94；魔芋，薏苡仁，山藥，菊粉。

MRS培養(yǎng)基：酵母粉5 g，葡萄糖20 g，檸檬酸氫二銨2 g，蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，無水乙酸鈉5 g，吐溫80 1 mL，七水和硫酸鎂0.58 g，四水和硫酸錳0.25 g，磷酸氫二鉀2 g，蒸餾水1 000 mL,調(diào)節(jié)pH值至7.1，121℃高壓滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

Galaxy系列二氧化碳培養(yǎng)箱；PB-10pH計(jì)；SWCJ-2D型凈化工作臺；BZG30菌落計(jì)數(shù)器；TOMY ES315自動蒸汽消毒柜；XSP-2CA雙目生物顯微鏡；FA2004電子分析天平。

1.3 方法

1.3.1 魔芋膠水解物的制備

將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%的魔芋精粉于37℃溶脹過夜后倒入高速組織搗碎機(jī)中攪拌10 min，放入37℃培養(yǎng)箱，保溫72 h，取出離心（4 000 r/min,15 min）,取上清液于100℃加熱20 min,將所得液濃縮至原體積的50%，既得魔芋膠水解物[12]備用。

1.3.2 薏苡仁浸提液的制備

將薏苡仁用10倍水浸泡30 min，將其煮沸，沸后在保持微沸30 min，將煮得的薏苡仁汁倒出，再加原薏苡仁10倍的水煮沸，方法同上。將兩次所得汁液混合過濾，即得薏苡仁浸提液。

1.3.3 山藥浸提液的制備

準(zhǔn)確稱取適量山藥，按料水質(zhì)量比1∶10加入三角瓶中，置于80～90℃水浴鍋保溫，3 h后用細(xì)密紗布過濾除渣，即得山藥浸提液，濃縮浸提液至山藥粗多糖的質(zhì)量濃度為100 g/L。

1.3.4 活菌計(jì)數(shù)

將雙歧桿菌B94用基礎(chǔ)培養(yǎng)基MRS進(jìn)行多次活化后，分別接種于添加不同濃度增菌因子的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)36 h,以血球計(jì)數(shù)板法計(jì)數(shù)，重復(fù)3次，取平均值，記錄數(shù)據(jù)并統(tǒng)計(jì)分析[13]。

1.3.5 單一增菌因子促進(jìn)雙歧桿菌生長試驗(yàn)

選擇魔芋膠水解物、薏苡仁浸提液、山藥浸提液、菊粉等四種物質(zhì)作為增菌因子，按不同比例加入MRS培養(yǎng)基中，其中魔芋膠水解物、薏苡仁浸提液分別按20，25，30，35，40 mL/L的不同體積分?jǐn)?shù)添加；山藥浸提液按3，4，5，6，7 mL/L的不同體積分?jǐn)?shù)添加；菊粉按12，16，20，24，28 g/L的不同質(zhì)量濃度添加。分別在以上含不同體積分?jǐn)?shù)增菌因子的MRS培養(yǎng)基內(nèi)以4%的比例接入已活化好的雙歧桿菌，37℃厭氧培養(yǎng)36 h，按1.3.4法測定活菌數(shù)。上述各實(shí)驗(yàn)均設(shè)3次重復(fù)，且各因素均以MRS基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為對照組。

1.3.6 增菌因子復(fù)合配比促進(jìn)雙歧桿菌生長實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)，在MRS基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，篩選魔芋膠水解物（A），薏苡仁浸提液（B），菊粉（C）等3個因素作為增菌因子，采用正交表L9(34)，以發(fā)酵液活菌數(shù)為指標(biāo)，做進(jìn)一步優(yōu)化，每試驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)。篩選促進(jìn)雙歧桿菌菌體生長的最佳復(fù)合配比。其正交因素與水平如表1所示。

表1 因素水平

2 結(jié)果分析與討論

2.1 雙歧桿菌增殖培養(yǎng)單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 魔芋膠水解物對雙歧桿菌體外增殖的影響

圖1為魔芋膠水解物體積分?jǐn)?shù)與活菌數(shù)目的關(guān)系。由圖1可以看出，在一定范圍內(nèi)，隨著魔芋膠水解物濃度的增加，活菌數(shù)目逐漸增加，當(dāng)添加量為35 mL/L時，活菌數(shù)目達(dá)到峰值，為1.21×109mL-1，而對照組的活菌數(shù)僅有2.21×108mL-1，可見魔芋膠水解物的添加對雙歧桿菌的增殖起到明顯促進(jìn)作用。分析表明，當(dāng)魔芋膠水解物的添加體積分?jǐn)?shù)分別為25 mL/ L以及30 mL/L時，活菌數(shù)目增殖顯著（P＜0.05），當(dāng)添加量為30 mL/L以及35 mL/L時，活菌數(shù)目增殖不顯著（P＞0.05），故選擇體積分?jǐn)?shù)為25，30，35 mL/L作為魔芋膠水解物在正交試驗(yàn)中的水平值。

2.1.2 薏苡仁浸提液對雙歧桿菌體外增殖的影響

圖2為薏苡仁浸提液體積分?jǐn)?shù)與活菌數(shù)目的關(guān)系。由圖2可以看出，在一定范圍內(nèi)，活菌數(shù)目隨薏苡仁浸提液體積分?jǐn)?shù)的增加而增加，當(dāng)添加量為30 mL/L時，活菌數(shù)目達(dá)到峰值，為3.32×108mL-1，而對照組的活菌數(shù)僅有2.21×108mL-1。分析表明，當(dāng)薏苡仁浸提液的添加體積分?jǐn)?shù)分別為25 mL/L以及30 mL/L時，活菌數(shù)目增殖顯著（P＜0.05）；當(dāng)添加量分別為30 mL/L以及35 mL/L時，活菌數(shù)目增殖不顯著（P＞0.05）。故選擇體積分?jǐn)?shù)為25，30，35 mL/L作為薏苡仁浸提液在正交實(shí)驗(yàn)中的水平值。

2.1.3 山藥浸提液對雙歧桿菌體外增殖的影響

圖3為山藥浸提液濃度與活菌數(shù)目的關(guān)系。由圖3可以看出，添加山藥浸提液對于雙歧桿菌的增殖有一定促進(jìn)作用，但增菌效果不明顯。分析發(fā)現(xiàn)，各水平組的活菌數(shù)目增殖均不顯著（P＞0.05），活菌數(shù)目最高只達(dá)到2.72×108mL-1，對照組活菌數(shù)為2.21×108mL-1，因此，在正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)中剔除該因素。

2.1.4 菊粉對雙歧桿菌體外增殖的影響

圖4為菊粉質(zhì)量濃度與活菌數(shù)目的關(guān)系。由圖4可以看出，在一定范圍內(nèi)，隨著菊粉濃度的增加，活菌數(shù)目逐漸增加，在菊粉質(zhì)量濃度達(dá)到20 g/L時，活菌數(shù)目達(dá)到峰值為4.78×108mL-1，而對照組僅為2.21×108mL-1。分析表明，當(dāng)菊粉的添加量分別為16 g/L以及20 g/L時，活菌數(shù)目增殖顯著（P＜0.05），當(dāng)添加量為20 g/L以及24 g/L時，活菌數(shù)目增殖不顯著（P＞0.05），故選擇質(zhì)量濃度為16，20，24 g/L作為菊粉在正交試驗(yàn)中的水平值。

綜合比較看出，各因子在選取添加范圍內(nèi)，各自最佳添加量對活菌增菌效果的排列順序?yàn)椋耗в竽z水解物（35 mL/L）＞菊粉（20 g/L）＞薏苡仁浸提液（30 mL/L）＞山藥浸提液（6 mL/L）。

2.2 各增菌因子復(fù)合配比正交試驗(yàn)

將各增菌因子按照L9(34)正交設(shè)計(jì)表進(jìn)行復(fù)合配比實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行培養(yǎng)基的優(yōu)化，以確定3種因子的最佳增菌配比。發(fā)酵培養(yǎng)以pH值為7.1為初始pH值，溫度37℃，時間36 h，以發(fā)酵培養(yǎng)液活菌數(shù)為評價(jià)指標(biāo)，試驗(yàn)結(jié)果與極差分析如表2所示，相應(yīng)的方差分析如表3所示。

表2中極差值與表3中F值大小順序是一致的，極差與方差結(jié)果均表明，在復(fù)合配比試驗(yàn)所考察的三個增菌因子中魔芋膠水解物（A）對發(fā)酵液活菌數(shù)的影響最為顯著，各增菌因子交互作用時對菌體增殖的影響力排序依次為：魔芋膠水解物（A）＞菊粉（C）＞薏苡仁浸提液（B）。方差分析說明魔芋膠水解物與菊粉這兩種增菌因子的添加對試驗(yàn)結(jié)果的影響高度顯著，而薏苡仁浸提液的添加對試驗(yàn)結(jié)果影響顯著。結(jié)合表2得出最優(yōu)增菌因子組合為A2B1C2,即魔芋膠水解物的添加體積分?jǐn)?shù)是30 mL/L,薏苡仁浸提液的添加體積分?jǐn)?shù)是25 mL/L,菊粉的添加質(zhì)量濃度是20 g/L。

表3 方差分析

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)L9（34）正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析選出的最優(yōu)增殖因子組合，進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，將其添加到MRS培養(yǎng)基（pH值為7.1）中，37℃厭氧培養(yǎng)36 h，進(jìn)行3次重復(fù)，雙歧桿菌增菌培養(yǎng)的試驗(yàn)結(jié)果高于表2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，活菌數(shù)平均可達(dá)到7.4×109mL-1，比起對照組（2.21×108mL-1）有了很大的提高?？梢妰?yōu)化得到的增菌組合利于雙歧桿菌增殖。

2.4 討論

單因素試驗(yàn)結(jié)果結(jié)果表明：山藥浸提液對雙歧桿菌增殖的促進(jìn)作用不明顯，故在正交試驗(yàn)中只選取了魔芋膠水解物、薏苡仁浸提液、菊粉這3種作為增菌因子。正交試驗(yàn)結(jié)果顯示，魔芋膠水解物的添加量在25～30 mL/L范圍內(nèi)時，其促進(jìn)雙歧桿菌增殖的效果隨濃度的提高而提高，這一點(diǎn)與單因素試驗(yàn)結(jié)果是相一致的。通過參照比較國內(nèi)外相關(guān)研究結(jié)果，張火云等人以中藥優(yōu)化雙歧桿菌培養(yǎng)基，可使雙歧桿菌活菌數(shù)達(dá)到2.21×108mL-1[14]；孟祥晨等人[15]通過培養(yǎng)基的篩選優(yōu)化，使活菌數(shù)達(dá)到2.9×109mL-1等，本研究得到的最佳復(fù)合配比增菌因子組合使雙歧桿菌在37℃，厭氧培養(yǎng)36 h時，其活菌數(shù)達(dá)到了7.4×109mL-1，增菌效果明顯，為相關(guān)研究提供了新的參考。

3 結(jié)論

（1）在以MRS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基所選取的4種增菌因子（魔芋膠水解物、薏苡仁浸提液、山藥浸提液、菊粉）中，單因素試驗(yàn)結(jié)果表明：魔芋膠水解物的對對雙歧桿菌體外增殖的促進(jìn)作用最好，當(dāng)添加量為35 mL/L時，雙歧桿菌的活菌數(shù)可達(dá)1.21×109mL-1。

（2）正交實(shí)驗(yàn)所得最佳復(fù)合增菌因子組合為魔芋膠水解物(30 mL/L)、薏苡仁浸提液(25 mL/L)、菊粉(20 g/L)，經(jīng)添加了該增菌因子組合的MRS培養(yǎng)基37℃厭氧培養(yǎng)36h,雙歧桿菌活菌數(shù)可達(dá)7.4×109mL-1。

[1]RASIC J L，KURMANN J A.Bifidobacteria and Their Role:Microbiological Nutritional-Physiological Medical and Technological Aspects and Bibliography[M].Boston:Besel,1983.

[2]張建浩.雙歧桿菌的生物學(xué)特征、生理功能及食品中的開發(fā)應(yīng)用[J].食品科學(xué),2002,23(10):141-142.

[3]吳淑清,王順余,譚克，等.雙歧桿菌的研究現(xiàn)狀[J].長春大學(xué)學(xué)報(bào), 2007,17(4):57-61.

[4]陳思羽,李禎禎,陳芳.人體腸道益生菌的生理功能和安全性研究現(xiàn)狀[J].中國微生態(tài)學(xué)雜志,2007,19(4):397-398.

[5]郭本恒,汪河,雙歧桿菌及其相關(guān)乳制品[J].食品工業(yè)，1998(1):24-26.

[6]NAKAZAVA Y.Function of Fermented Milks:Challenges for the Health[M].London and New york:Elsecier Apllied Sciences,1992：45-47.

[7]GIBSON R G,WANG X.Regulatory Effects of Bifidobacteria on the Growth of Other Colonic Bacteria[J].J.Appl.Microbiol,1994,77(2): 412-420.

[8]秦湘紅,張群芳.魔芋粉酶解產(chǎn)物與低聚果糖對雙歧桿菌的促生長作用比較研究[J].中國微生態(tài)學(xué)雜志，2003,15(5):261-263.

[9]李香串.薏苡仁雙歧桿菌酸乳的研制[J].科技情報(bào)開發(fā)與經(jīng)濟(jì)，2004,14(9):189-190.

[10]張火云,吳傳兵,孫永林.山藥浸提物對青春雙歧桿菌發(fā)酵的影響[J].襄樊學(xué)院學(xué)報(bào)，2009,30(8):31-34.

[11]殷洪,林學(xué)進(jìn).菊粉、低聚果糖的研究進(jìn)展[J].中國食品添加劑，2008 (4):97-101.

[12]吳擁軍,孟望霓,蔡金藤，等.魔芋葡萄甘露低聚糖的提取發(fā)酵產(chǎn)物對耐氧雙歧桿菌的促生長作用[J].研究與探討,2002,23(9):41-43.

[13]劉樹興,張明.雙歧桿菌最佳培養(yǎng)條件的研究[J].食品研究與開發(fā), 2007,28(9):47-49.

[14]張火云.孫啟玲.袁月祥.中藥及其優(yōu)化培養(yǎng)基對雙歧桿菌增殖的影響[J].四川大學(xué)學(xué)報(bào),2004(11);189-192.

[15]孟祥晨.王亞峰.霍貴成.青春雙歧桿菌增菌培養(yǎng)基的優(yōu)化[J].研究報(bào)告,2009,28(7):15-19.

Research on the optimistic fermentation technology of the activities of Bifidobacterium

HE Feng-yuan，GE Wu-peng，WEI Wei，ZHU Hong，LIU Rui
(College of Food Science and Technology,Northwest A&F University,Yangling 712100,China)

Viable counts ofBifidobacteriumis one of the key criterions to improve human body health.The study adopted MRS as basic medium,and four optimal ingredients were chosen and added:Konjac Gum Hydrolyzates,Extractive Juice of Semen Coins,Extractive Juice of Yam,Inulin.Through single-factor test,3 better optimal ingredients were sifted out.To take the viable counts as index,orthogonal experiment was used to select a formula which is the best to enriching high activitybifidobacterium.The experimental result showed that in singlefactor test,Konjac Gum Hydrolyzate had the best effect to enrichingbifidobacteriumamong the above 4 factors，and the additive concentration was MRS added with Konjac Gum Hydrolyzates(35 mL/L),with the viable counts being 1.21×109CFU/mL.Orthogonal test showed that the optimum medium was MRS added with Konjac Gum Hydrolyzates(30 mL/L),Extractive Juice of Semen Coins(25 mL/L),Inulin(20 g/L),incubated under anaerobic conditions for 36h at 37℃,with the viable counts being 7.4×109CFU/mL.

Bifidobacterium;optimal ingredient;viable counts;orthogonal test

Q93-335

A

1001-2230（2012）05-0016-04

2011-11-04

西北農(nóng)林科技大學(xué)人才基金資助項(xiàng)目(22050205)。

何楓媛（1989-），女，本科，研究方向?yàn)槿槠房茖W(xué)及生物技術(shù)。

葛武鵬