康建華，楊立順，袁海生

(天津市中醫(yī)藥大學(xué)附屬北辰中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科，天津300400)

糖尿病的慢性高血糖癥會(huì)造成患者的長期損害、機(jī)能障礙、多種器官衰竭。2009年的研究建議將糖化血紅蛋白(HbA1c)檢測作為篩選和診斷糖尿病指標(biāo)［1］。由此可見，HbA1c的檢測質(zhì)量在糖尿病的診治中起著舉足輕重的作用。由于受各種因素干擾，如:紅細(xì)胞生存期的改變、異常血紅蛋白、黃疸和高脂血癥、乙酰化血紅蛋白、氨基甲酰化血紅蛋白等因素均可造成HbA1c值出現(xiàn)假性升高或降低，所有檢測方法都存在非特異性。離子交換-高效液相色譜法(HPLC)檢測HbA1c被認(rèn)為是國際標(biāo)準(zhǔn)化的檢測方法。近年來臨床上又新出現(xiàn)了另外一種檢測HbA1c的方法——酶法。我們通過使用2種不同原理的方法同時(shí)檢測患者的HbA1c并進(jìn)行比較分析，評(píng)價(jià)2種方法的抗干擾能力。

材料和方法

一、對(duì)象

2009年12月至2010年10月在天津市中醫(yī)藥大學(xué)附屬北辰中醫(yī)醫(yī)院住院的2型糖尿病患者30例，除外尿毒癥、貧血患者，其中男22例、女18例，年齡30～70歲。同時(shí)收集20名健康體檢者EDTA-K2抗凝血作為正常對(duì)照組。糖尿病的診斷標(biāo)準(zhǔn)符合世界衛(wèi)生組織(WHO)1999年診斷標(biāo)準(zhǔn)。另外選擇天津市中醫(yī)藥大學(xué)附屬北辰中醫(yī)醫(yī)院住院透析的糖尿病尿毒癥患者8例，并采集新生兒臍帶血1份。門診患者空腹取靜脈血測定HbA1c，病房患者在入院第2天取靜脈血測定HbA1c，所有樣本都當(dāng)天檢測。

二、試劑和儀器

美國Bio-Rad公司生產(chǎn)的D-10糖化血紅蛋白檢測儀(簡稱D-10檢測儀)、配套試劑、HbA1c校正液和低、高值質(zhì)控液，D-10檢測儀可溯源到美國國家HbA1c標(biāo)準(zhǔn)化程序(NGSP)［2］。TBA-40全自動(dòng)生化分析儀。北京九強(qiáng)生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的HbA1c酶法檢測試劑盒及配套校準(zhǔn)品、質(zhì)控品和操作參數(shù)。依據(jù)ISO/DIS 17511“校準(zhǔn)物質(zhì)和質(zhì)控物質(zhì)定值的計(jì)量學(xué)溯源性”，北京九強(qiáng)生物技術(shù)有限公司HbA1c酶法試劑可溯源至NGSP。

三、檢測方法及原理

1.嚴(yán)格按儀器和試劑的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程檢測樣本，按要求進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)控。D-10檢測儀的原理為離子交換-HPLC，是基于HbA1c與其他血紅蛋白電荷的不同對(duì)HbA1c進(jìn)行分離。酶法原理是在蛋白酶的作用下，切斷HbA1c的β鏈N末端的糖化二肽，糖化二肽在果糖基肽氧化酶的作用下生成過氧化氫，在過氧化物酶的存在下與顯色劑產(chǎn)生顯色反應(yīng)，通過測定吸光度值求出HbA1c的百分濃度。

2.不同濃度HbF的制備 將30例糖尿病患者樣本混勻用2種檢測方法各檢測3次HbA1c濃度(離子交換-HPLC:8.0%、7.92%、8.10%;酶法:8.12%、7.86%、7.90%)，計(jì)算HbA1c均值為8.0%，將新生兒臍帶血液樣本［胎兒血紅蛋白(HbF)濃度約為70%［3］］與混勻后的糖尿病患者血液樣本按1∶9混合，使混合樣本HbF濃度約為7%。用2種方法同時(shí)檢測混合樣本的HbA1c濃度(離子交換 -HPLC法:7.62%、7.58%、7.60%;酶法:7.58%、7.52%、7.70%)，取均值為7.6%。從而計(jì)算出新生兒臍帶血液樣本中HbA1c的濃度約為4.0%。將新生兒臍帶血作為第1份，其他混合后糖尿病患者血液樣本分為7份，分別加入不同濃度新生兒臍帶血，將其進(jìn)行1.1倍、1.4倍、2倍、3倍、4倍、8倍、16倍稀釋，理論濃度分別為 70.0%、64.0%、50.0%、35.0%、23.0%、17.5%、8.8%和4.4%。

3.檢測 分別用2種方法檢測正常對(duì)照組、尿毒癥組和含有不同濃度HbF的糖尿病組血液樣本中的HbA1C濃度，每組檢測3次，計(jì)算均值()和標(biāo)準(zhǔn)差(s)。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有資料應(yīng)用Excel和SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組間均數(shù)比較t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、精密度試驗(yàn)

取低、高質(zhì)控品用2種方法在一次實(shí)驗(yàn)中重復(fù)測定20次，得批內(nèi)精密度。每日上午檢測1次，連續(xù)測定15 d，計(jì)算批間精密度，見表1。

表1 離子交換高壓液相色譜法和酶法的批內(nèi)及批間精密度結(jié)果

二、正常對(duì)照組及糖尿病組HPLC和酶法檢測結(jié)果的相關(guān)性分析

正常對(duì)照組和糖尿病組血液樣本分別用離子交換-HPLC和酶法檢測并進(jìn)行相關(guān)比較。以D-10檢測儀測定結(jié)果為X，酶法測定結(jié)果為Y，對(duì)測定結(jié)果進(jìn)行回歸分析?；貧w方程為Y=0.938 5X+0.248 1，r2=0.975 2，r=0.986 1，P ＜0.05，兩者具有良好的相關(guān)性。對(duì)于血紅蛋白結(jié)構(gòu)正常的各種濃度HbA1c的血液樣本，2種檢測系統(tǒng)的測定結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

三、尿毒癥組離子交換-HPLC和酶法HbA1c檢測結(jié)果比較

8例糖尿病尿毒癥患者分別用離子交換-HPLC和酶法檢測的HbA1c進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果表明離子交換-HPLC檢測結(jié)果均明顯高于酶法(此8例患者從糖尿病門診病例記錄中查閱住院前2個(gè)月監(jiān)測的空腹血糖水平，每周2次，從而計(jì)算出平均血糖水平)，見表2。

四、不同濃度的HbF對(duì)2種檢測系統(tǒng)測定HbA1c的影響

當(dāng)HbF＜8.75%時(shí)，離子交換-HPLC測定結(jié)果與預(yù)期值無差異;當(dāng)樣本中 HbF的濃度為17.50%～23.00%時(shí)，其測定結(jié)果要明顯低于HbA1c的理論濃度;當(dāng) HbF濃度達(dá)35.00% ～70.00%時(shí)離子交換-HPLC無法檢測出結(jié)果。酶法檢測結(jié)果幾乎不受HbF的干擾，見表3。

表2 2種方法測定透析的尿毒癥患者HbAlc結(jié)果比較

表3 不同濃度的HbF對(duì)2種檢測系統(tǒng)測定HbA1c的結(jié)果 (%)

討 論

HbAlc作為監(jiān)測糖尿病血糖控制的金標(biāo)準(zhǔn)［4］，為糖尿病患者提供了一項(xiàng)評(píng)估血糖長期控制情況指標(biāo)。有規(guī)律地定期檢測HbA1c，可有效地預(yù)防糖尿病及相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生。HbA1c不同的測定方法會(huì)受到各種干擾因素的影響，對(duì)變異血紅蛋白及血紅蛋白衍生物的研究有助于提高HbA1c檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。HbF是胚胎時(shí)期的血紅蛋白由2條α鏈和2條γ鏈組成。出生時(shí)，70%的血紅蛋白是HbF，6個(gè)月后降到5%以下。遺傳性HbF持續(xù)存在的個(gè)體體內(nèi)其濃度可達(dá)到總血紅蛋白的30%，而β-地中海貧血和鐮狀細(xì)胞病患者體內(nèi)HbF的濃度占總Hb的2% ～20%不等。常見的血紅蛋白化學(xué)衍生物對(duì)氨基甲酰血紅蛋白在尿毒癥患者血中濃度升高，是最常見的干擾HbA1c檢測的化學(xué)衍生物。

本研究選用2種不同原理檢測系統(tǒng)來分別測定各組血液樣本中的HbA1c濃度。對(duì)于血紅蛋白結(jié)構(gòu)正常和腎功能正常者的各種濃度HbA1c的血液樣本，2種檢測方法的測定結(jié)果有明顯相關(guān)性，都能很好的反映患者的血糖水平。批內(nèi)、批間CV＜3%，2種方法均符合要求。精密度試驗(yàn)表明2種檢測系統(tǒng)的準(zhǔn)確性都很高。

從表3可知，離子交換-HPLC在HbF濃度達(dá)35.00%～70.00%時(shí)，HbA1c無法獲得檢測結(jié)果。當(dāng)HbF＜8.75%時(shí)，測定結(jié)果與預(yù)期值無差異;當(dāng)樣本中HbF的濃度為17.50% ～23.00%時(shí)，其測定結(jié)果要明顯低于HbA1c的理論濃度，而酶法幾乎不受HbF干擾。分析原因可能為新生兒臍帶血中含有大量HbF，大約為70%，其等電點(diǎn)與HbA1c比較接近。在檢測過程中，HbA1c的峰大部分疊加在HbF峰中，所以HbA1c的值大大偏低或根本檢測不出。

對(duì)于尿毒癥患者，離子交換-HPLC檢測出的HbA1c濃度明顯高于酶法，分析原因可能是由于離子交換-HPLC是利用HbA1c與其他血紅蛋白帶電性的不同，通過離子交換的管柱達(dá)到分離目的，故受與HbA1c帶電性相似的變異血紅蛋白的影響。尿毒癥患者由于腎功能嚴(yán)重受損，血紅蛋白濃度較低，患者體內(nèi)有過多的尿素生成，尿素在體內(nèi)可自發(fā)地分離形成氨和氰酸鹽，氰酸鹽經(jīng)質(zhì)子化作用后形成異氰酸，異氰酸與蛋白質(zhì)的α和ε氨基基團(tuán)反應(yīng)即形成氨基甲酰。血紅蛋白β鏈N端的纈氨酸可與異氰酸發(fā)生特異性的結(jié)合反應(yīng)，形成穩(wěn)定的氨基甲酰血紅蛋白。氨基甲酰血紅蛋白與HbA1c的等電點(diǎn)相似，故可對(duì)依據(jù)電荷原理檢測HbA1c的方法形成干擾。Lee等［5］發(fā)現(xiàn)，用離子交換色譜法測定HbA1c時(shí)，如尿素濃度超過 17 mmol/L，每升高 1 mmol/L會(huì)使HbA1c值升高0.04%。酶法HbA1c的測定是個(gè)突破，主要表現(xiàn)在3方面:(1)特異蛋白內(nèi)切酶特異酶解血液中的血紅蛋白產(chǎn)生果糖基氨基酸，血漿中的其他蛋白，如白蛋白、球蛋白等對(duì)結(jié)果不能產(chǎn)生干擾;(2)果糖基氨基酸氧化反應(yīng);(3)在溶血體系中應(yīng)用了H2O2測定的靈敏性，由于過氧化氫酶可以分解色素元引起負(fù)反應(yīng)，所以可用過氧化物酶代替，且不受異常血紅蛋白和血紅蛋白衍生物的影響，特異性強(qiáng)［6］。與本研究結(jié)果相符，酶法檢測含不同濃度的HbF和氨基甲酰血紅蛋白時(shí)的HbA1c結(jié)果與理論值相符。

總之酶法和離子交換-HPLC測定HbA1c對(duì)于血紅蛋白結(jié)構(gòu)正常和腎功能正常者的各種濃度HbA1c的血液樣本，都能很好的反映患者的血糖水平。但酶法不易受變異血紅蛋白和氨基甲酰血紅蛋白的影響，且操作簡便［7］，儀器設(shè)備要求不高，能在實(shí)驗(yàn)室原有各種生化儀進(jìn)行檢測，收費(fèi)低廉。不同的測定方法會(huì)受到各種干擾因素的影響，對(duì)變異血紅蛋白及血紅蛋白衍生物的研究有助于提高HbA1c檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。離子交換-HPLC法雖受變異血紅蛋白的干擾，但做為檢測HbA1c的金標(biāo)準(zhǔn)方法，具有快速、簡便、精確等特點(diǎn)，結(jié)果的重復(fù)性顯著優(yōu)于其他方法，可以通過各個(gè)不同形態(tài)圖譜分析識(shí)別出變異血紅蛋白的存在。如果選擇高分辨率HbA1c檢測試劑及儀器，HbA1c的檢測結(jié)果將不受血紅蛋白變異體及其衍生物的影響。本研究提醒臨床醫(yī)生考慮HbF和變異血紅蛋白對(duì)HPLC方法的干擾，從而避免此類糖尿病患者HbA1c的誤讀。國際臨床化學(xué)聯(lián)合會(huì)(IFCC)確立的測定HbA1c的參考方法是高效液相-電噴物電離/質(zhì)譜(HPLC-ESI/MS)或高效液相-毛細(xì)管電泳(HPLC-CE/UV)［8］。國內(nèi)臨床檢驗(yàn)的主管部門也提倡重視HbA1c測定技術(shù)及量值溯源［9］，生產(chǎn)廠家、實(shí)驗(yàn)室加入NGSP的對(duì)比計(jì)劃以推動(dòng)HbA1c的標(biāo)準(zhǔn)化進(jìn)程。在后續(xù)的研究中，我們將以HPLCESI/MS法為參考，對(duì)不同測定HbA1c方法的影響因素作進(jìn)一步的比對(duì)研究。

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