田 曄 ,滕 應(yīng),趙 靜,李振高,馬文亭 ,張明旭 ,駱永明 ,3* (.安徽理工大學(xué)地球與環(huán)境學(xué)院,安徽 淮南 300；.中國科學(xué)院南京土壤研究所,土壤環(huán)境與污染修復(fù)重點實驗室,江蘇 南京 0008；3.中國科學(xué)院煙臺海岸帶研究所,山東 煙臺 64003)

銅(Cu)是生物體內(nèi)基本的微量營養(yǎng)元素之一,但過量的Cu會對生物體產(chǎn)生毒性[1].植物修復(fù)是Cu污染土壤修復(fù)的重要手段之一[2-3].海州香薷(Elsholtzia splendens Nakai)是中國原生Cu耐性/富集植物,因其生物量較大且對 Pb、Zn污染土壤亦有較強適應(yīng)性,成為目前Cu污染土壤修復(fù)的常用植物[4-5].但高Cu濃度引起的植物生長緩慢,生物量小甚至死亡及土壤Cu有效性低等問題限制了海州香薷對Cu的提取[6-7].目前微生物強化已是植物修復(fù)研究的熱點[8],微生物可通過促進植物生長和提高植物對重金屬吸收能力兩方面增強植物對土壤重金屬的積累量[8-9],達到強化重金屬污染土壤的植物修復(fù)的目的.目前,用于強化植物修復(fù)效應(yīng)研究的微生物主要為具重金屬抗性的細菌和真菌.細菌主要見于植物促生細菌(PGPR),真菌主要見于叢枝菌根真菌(AMF)[10].Cu污染土壤通常pH值偏酸性,而真菌比細菌更適應(yīng)酸性環(huán)境.但由于叢枝菌根真菌難分離純化及純培養(yǎng),一定程度上限制了其應(yīng)用.木霉屬(Trichoderma)真菌在土壤中分布廣泛、生物量大,環(huán)境適應(yīng)性強,在酸性土壤上生長良好,且易于分離純化和培養(yǎng),目前主要在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中用于促進植物生長、誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性等[11-12].另外,Anand等[13]、沈薇等[14]和胡亮等[15]研究表明,木霉在搖瓶條件下對重金屬Cu、Pb和Zn均有較強抗性.因此推斷木霉屬真菌具有強化Cu污染土壤的植物修復(fù)效應(yīng)的潛力.

里氏木霉 FS10-C(Trichoderma reesei FS10-C)是本課題組從Cu污染土壤中篩選出的1株抗Cu木霉,白色棉絮狀菌絲、綠色孢子、產(chǎn)黃色素,已送由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏(保藏編號:CGMCC NO.3970).目前國內(nèi)外關(guān)于木霉與植物生長及木霉與重金屬關(guān)系的研究常見于哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、綠色木霉(Trichoderma virens)和深綠木霉(Trichoderma atroviride)[16-18],尚未見關(guān)于里氏木霉對海州香薷生長和重金屬吸收影響的相關(guān)研究.本課題組前期研究證實,該株木霉具ACC脫氨酶、解磷作用和產(chǎn)鐵載體等促生活性;且搖瓶條件下,在pH值2～10,Cu濃度≤600mg/kg時均可生長發(fā)育,100mg/kg和200mg/kg濃度下Cu積累率分別可達50.6%和30.3%;另外,課題組前期對該株木霉的生物安全性評價研究亦表明該菌及其代謝產(chǎn)物均對人畜無害.由此推測里氏木霉FS10-C可作為一株強化Cu污染土壤植物修復(fù)作用的候選菌.

為便于保存和施用,擬將該株木霉制備成固體生物制劑.許傳坤等[19]的研究表明,向土壤中添加額外能源物質(zhì)及其他有機物質(zhì)能降低或全部解除土壤對木霉的抑制作用.據(jù)此,經(jīng)前期固體基質(zhì)的物料篩選,本研究選擇苜蓿粉作為固體基質(zhì)制備木霉制劑并采用溫室盆栽試驗,探討施加木霉制劑對外源Cu土壤上海州香薷生長及Cu吸收能力的影響.以期為海州香薷修復(fù)Cu污染土壤提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

供試土壤為南京棲霞山無污染的黃棕壤,風干研磨過2mm篩.土壤pH值6.6,有機質(zhì)含量21.3g/kg,堿解氮含量162.3mg/kg,速效磷含量11.7mg/kg,速效鉀含量 82.2mg/kg,陽離子交換量16.5cmol/kg, Cu全量30.0mg/kg, Zn全量77.4mg/kg, Pb全量87.4mg/kg,Cd未檢出.

海州香薷種子采自銅陵鐵頭山銅礦區(qū).

Cu污染土壤的制備:外源添加不同濃度CuSO4·5H2O,拌入基肥(尿素、磷酸氫二鈉和氯化鉀按N:0.15g/kg, P:0.10g/kg土,K:0.30g/kg施入).調(diào)節(jié)土壤水分至田間持水量的60%,老化15d后制備成0, 100, 200, 400mg/kg外源Cu濃度土壤.

表1 木霉制劑發(fā)酵條件正交試驗的因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for optimizing fermentation conditions of Trichoderma sp.preparation

木霉制劑的制備:木霉制劑由本實驗室篩選保存的抗銅里氏木霉FS10-C的孢子懸液經(jīng)滅菌苜蓿粉固體發(fā)酵制成.發(fā)酵條件經(jīng)正交試驗設(shè)計優(yōu)化篩選.篩選方案是:選取物料量(A)、固水比(B)和孢子接種量(C)3個因素,每個因素設(shè)3個水平,按照制劑孢子濃度篩選最佳發(fā)酵條件.各因素與水平設(shè)置見表1.發(fā)酵過程為:把苜蓿粉按一定固水比加入去離子水(表1),調(diào)勻后裝入直徑15cm玻璃培養(yǎng)皿中,滅菌制成滅菌基質(zhì).無菌條件下,接種定量的孢子懸液(106cfu/mL)于滅菌基質(zhì)中(表1),28℃恒溫培養(yǎng),第3d起每天攪動1次,7d后混勻待用.木霉制劑采用血球計數(shù)板計數(shù)孢子濃度(cfu/g),4℃保存待用.

1.2 盆栽試驗設(shè)計與實施

每盆2.5kg土.每個土壤外源Cu水平均設(shè)3個處理:空白(只種海州香薷)、滅菌基質(zhì) (種海州香薷+施加滅菌苜蓿粉)、木霉制劑(種海州香薷+施加木霉制劑),每個處理 3個重復(fù).按土壤質(zhì)量的4%將木霉制劑拌入土壤中,表層覆土平衡 3d后播種.海州香薷的種子用75%的乙醇消毒,無菌水沖洗.采用培養(yǎng)皿法發(fā)芽,待種子露白萌發(fā)后播入盆中,每盆播 15粒.播種后每天補充去離子水達田間持水量的60%,待苗齊、苗壯后定苗.盆栽試驗在溫室進行,6月19日播種,10月20日收獲.

1.3 盆栽試驗測定指標和方法

海州香薷收獲前測株高,分地上部和根分別收獲.植物樣用自來水和去離子水沖洗后擦干,105℃下殺青 30min,80℃烘干至恒重后,分別測量植物地上部和根干重(g).將地上部和根分別用不銹鋼粉碎機粉碎,HNO3-HClO4(3:2,V/V)消解后測Cu濃度.土樣風干過20目篩,與 1mol/L NH4OAc(pH值7)混合(土液比1:5),180r/min震蕩16h,3600r/min離心5min,上清液過濾測土壤有效態(tài)Cu含量.Cu含量采用火焰原子吸收分光光度計測定.

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用EXCEL2003和SPSS 12.0進行圖表制作和方差分析等數(shù)據(jù)處理.

2 結(jié)果與分析

2.1 木霉制劑制備的最佳條件

正交試驗結(jié)果顯示,木霉制劑發(fā)酵的最佳條件為A1B3C2,即物料量 20g、固水比為1:1和孢子接種量為6%時發(fā)酵效果最佳.木霉制劑為綠色,孢子含量大于109cfu/g.

木霉對營養(yǎng)的要求不嚴格,可分解利用纖維素、半纖維素、幾丁質(zhì)等為碳源[12].苜蓿含豐富的碳水化合物、多種礦物元素及維生素[20],具備木霉增殖所需的營養(yǎng)條件.本研究結(jié)果證實,以滅菌苜蓿粉為基質(zhì),不同于一般的泥炭等基質(zhì)僅機械地將微生物吸附于基質(zhì)上,而是以苜蓿粉為營養(yǎng)來源和繁殖場所進行木霉增殖,可通過顏色深淺初步判斷木霉制劑孢子含量,施用方法可參照一般固體菌肥.因此該里氏木霉制劑具有制備方法簡單、孢子密度大且易施用等應(yīng)用優(yōu)點.

2.2 木霉制劑對海州香薷生長的影響

表2 木霉制劑對海州香薷生物量的影響Table2 Effect of Trichoderma.sp preparation on biomass of Elsholtzia splendens

施加木霉制劑后,除400mg/kg外源Cu土壤上地上部干重外,各Cu處理下,香薷生物量均呈增加趨勢(表2).其中與空白組相比,未加Cu時株高、地上部干重和根干重分別增加7.0%、59.8%和44.2%(P＜0.05), 100mg/kg外源Cu土壤上株高和根干重分別增加20.0%和108.5%(P＜0.05),200mg/kg外源Cu土壤上株高和地上部分別增加7.1%和35.9%(P＜0.05).

結(jié)果表明該木霉制劑在無污染和低Cu污染土壤上下可促進海州香薷莖葉和根系發(fā)育,具有促進海州香薷生長的作用且主要是里氏木霉FS10-C作用的結(jié)果.Hoyos-Carvajal等[21]和Contreras-Cornejo等[22]的研究表明,木霉屬真菌具解磷能力,可產(chǎn)鐵載體、吲哚乙酸(IAA)和赤霉素等促生物質(zhì).Rudresh等[23]發(fā)現(xiàn)木霉菌可在液體培養(yǎng)條件下溶解難溶性磷酸鹽,提高植物對磷元素的利用,改善土壤的營養(yǎng)環(huán)境,促進植物生長.本課題組前期研究證實里氏木霉 FS10-C具ACC脫氨酶、解磷和產(chǎn)鐵載體等促生活性,而本研究顯示出的里氏木霉FS10-C對海州香薷生長的促進可能與該株木霉的這些促生活性有關(guān).

400 mg/kg外源Cu土壤上,木霉制劑組根干重和株高增加不顯著,且地上部生物量反而低于空白對照,可能與此時木霉制劑極顯著提高了海州香薷的Cu積累量,在一定程度抑制了海州香薷的生長和根際土著微生物有作用,使海州香薷生物量未見顯著增加.

而滅菌基質(zhì)組海州香薷僅在不加Cu和100mg/kg外源Cu土壤上生物量有高于空白組的趨勢,且除 400mg/kg 外源Cu土壤上地上部干重顯著高于木霉制劑組外(P＜0.05),其余生物量指標均呈小于木霉制劑組的趨勢.這是由于滅菌基質(zhì)由苜蓿粉制成,施加苜蓿粉相當施加有機物料.在無外源Cu和低外源Cu水平(≤100mg/kg)土壤中,苜蓿粉分解釋放有機質(zhì)可加強海州香薷根際的土著土壤微生物、土壤酶及土壤激素等促進植物生長的活性.但隨著Cu濃度升高,土壤中土著微生物數(shù)量減少或死亡且伴隨土壤酶和土壤激素等逐漸失活,失去其促進植物生長的活性.

2.3 木霉制劑對Cu污染土壤有效態(tài)Cu的影響

施加木霉制劑,各濃度外源Cu土壤NH4OAc提取態(tài)Cu含量分別增加42.9%、48.0%和27.5%(圖1),均顯著高于空白組(P＜0.05).而滅菌基質(zhì)組土壤Cu有效性均顯著降低(P＜0.05).

結(jié)果表明,木霉制劑可提高土壤Cu有效性,發(fā)揮土壤Cu活化作用.而滅菌基質(zhì)組土壤Cu有效性的降低則提示滅菌基質(zhì)在一定程度上起到鈍化土壤Cu的作用.這可能是滅菌苜蓿粉作為有機物料,可降低土壤外源Cu的有效性,其結(jié)果與王果等[24]、陳建斌等[25]和陸曉輝等[26]加入稻草、紫云英、玉米秸稈等土壤Cu的重金屬有效性降低的研究結(jié)果一致.由此也可推斷該木霉制劑對土壤Cu的活化作用是由里氏木霉FS10-C及其代謝產(chǎn)物的作用產(chǎn)生.

圖1 木霉制劑對Cu污染土壤Cu有效性的影響Fig.1 Effect of Trichoderma.sp preparation on Cu phytoavailability of Cu contaminated soil

文獻報道木霉代謝過程可產(chǎn)生如檸檬酸等有機酸代謝產(chǎn)物[13,27].本課題組對里氏木霉FS10-C的前期研究發(fā)現(xiàn),該株木霉在液體培養(yǎng)過程中降低了培養(yǎng)基pH值,可能是該株木霉在生長過程中產(chǎn)生的酸性代謝產(chǎn)物導(dǎo)致.據(jù)此推測木霉FS10-C對土壤Cu的活化作用可能是與木霉FS10-C代謝過程產(chǎn)生的鐵載體和有機酸等生物源螯合劑與土壤Cu發(fā)生螯合作用的結(jié)果[28],其具體機制有待于進一步研究.

2.4 木霉制劑對海州香薷Cu含量的影響

如圖2所示,施加木霉制劑后,海州香薷地上部Cu含量在200,400mg/kg外源Cu土壤上均呈增加趨勢,且在400mg/kg外源Cu土壤上高于空白組112.0%(P＜0.05);根Cu含量在100,400mg/kg外源Cu土壤上分別顯著高于空白組22.4%和13.3%(P＜0.05).

而滅菌制劑組,海州香薷根Cu含量在各添加各外源Cu濃度土壤上均呈降低趨勢;地上部Cu含量僅在200mg/kg外源Cu土壤上時增加,但差異不顯著(P＞0.05).

圖2 木霉制劑對Cu污染土壤上海州香薷Cu含量影響Fig.2 Effect of Trichoderma sp. preparation on Cu concentration of Elsholtzia splendens

2.5 木霉制劑對海州香薷Cu積累量的影響

施加木霉制劑后,在各外源Cu濃度土壤上單株海州香薷Cu積累總量均呈增加趨勢(圖3).且在0,100, 400mg/kg外源Cu土壤上分別比空白組顯著增加 32.9%、75.3%和19.9%(P＜0.05).其中,根Cu積累量在0, 100, 400mg/kg土壤上分別增加16.9%、155%和16.0%(P＜0.05);地上部Cu積累量在 0,200,400mg/kg外源Cu土壤上分別增加44.7%、114.3%和32.5%(P＜0.05),而在 100mg/kg外源Cu土壤上下降16.1%,但差異并不顯著.

100mg/kg外源Cu土壤上,木霉制劑組海州香薷地上部Cu積累量雖略有下降的原因,推測與此時木霉在土壤中活性較高相關(guān).一方面,木霉制劑通過提高海州香薷生物量和土壤Cu有效性極顯著提高了根Cu積累量;另一方面,由于木霉對Cu的吸附作用對海州香薷根部的Cu產(chǎn)生固持作用,因此限制了根Cu向地上部的轉(zhuǎn)移,導(dǎo)致地上部Cu積累量略有下降,這其實也是該株木霉增強海州香薷Cu抗逆性的體現(xiàn)之一.

圖3 木霉制劑對Cu污染土壤上海州香薷Cu含量影響Fig.3 Effect of Trichoderma sp. preparation on Cu accumulation of Elsholtzia splendens

滅菌制劑組,單株總Cu積累量和根Cu積累量僅在100mg/kg外源Cu土壤上增加,而在200,400mg/kg外源Cu土壤上均顯著降低(P＜0.05).且除100mg/kg外源Cu土壤上地上部外,所有Cu積累量指標均低于木霉制劑組.可見木霉制劑對海州香薷Cu積累作用主要是里氏木霉FS10-C及其代謝產(chǎn)物的作用.

3 結(jié)論

3.1 施加木霉制劑可在無污染,100和200mg/kg外源Cu土壤上提高海州香薷株高以及地上部和根的生物量,促進海州香薷生長.

3.2 木霉制劑具有活化土壤Cu作用,在100和400mg/kg外源Cu土壤上可不同程度提高海州香薷整株、地上部和根的Cu積累量(除100mg/kg外源Cu土壤上,地上部Cu積累量略有降低外).

3.3 里氏木霉 FS10-C制劑可通過促進海州香薷生長和提高土壤Cu的植物有效性增強海州香薷Cu吸收能力,強化海州香薷對Cu污染土壤的修復(fù)效應(yīng),是一種頗具研究潛力的生物修復(fù)劑.

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