黃士堂，王祥云，褚泰偉

北京大學(xué) 化學(xué)與分子工程學(xué)院，放射化學(xué)與輻射化學(xué)重點(diǎn)學(xué)科實(shí)驗(yàn)室，北京分子科學(xué)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室，北京 100871

組織乏氧是實(shí)體腫瘤化療和放療耐受的重要原因，對(duì)組織乏氧程度的深入了解將會(huì)對(duì)腫瘤的診斷和治療提供便利[1-3]。硝基咪唑類化合物能夠在細(xì)胞內(nèi)酶(主要是黃嘌呤氧化酶)的作用下發(fā)生單電子還原，產(chǎn)生陰離子自由基。在正常細(xì)胞中，該中間體被迅速氧化成原化合物，擴(kuò)散到細(xì)胞外；在乏氧細(xì)胞中，該中間體被進(jìn)一步不可逆還原，與細(xì)胞內(nèi)組分共價(jià)結(jié)合，并滯留在細(xì)胞內(nèi)達(dá)到持續(xù)性攝取的效果。因而硝基咪唑類化合物被廣泛用于靶向乏氧組織的藥物載體[4-6]。影響乏氧組織攝取的因素有很多，例如化合物的脂溶性、分子大小、電荷性質(zhì)以及氧化還原電位等[7-10]。電荷能夠影響藥物分子的溶解性、細(xì)胞穿透性、組織器官分配、細(xì)胞代謝以及體內(nèi)清除[11-12]。因此，研究不同電荷性質(zhì)的乏氧顯像劑具有潛在的應(yīng)用價(jià)值和一定的理論意義。

本工作擬選用容易被131I標(biāo)記的酪氨酸分子骨架，偶聯(lián)乏氧靶向基團(tuán)2-硝基咪唑，再通過(guò)適當(dāng)?shù)男揎椃謩e獲得(S)-3-(4-羥基苯基)-2-(3-(2-硝基咪唑基)丙酰胺基)丙酸甲酯(NI-Y-M)、(S)-3-(4-羥基苯基)-2-(3-(2-硝基咪唑基)丙酰胺基)丙酸(NI-Y)和(S)-N-(3-胺丙基)-3-(4-羥基苯基)-2-(3-(2-硝基咪唑基)丙酰胺基)丙酰胺(NI-Y-A)等3種化合物，并進(jìn)行131I標(biāo)記，考察標(biāo)記物的各種性質(zhì)及其在荷瘤小鼠體內(nèi)的生物分布。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

2-硝基咪唑、1,3-丙二胺和N,N-二異丙基乙胺(DIEA)，比利時(shí)Acros 公司；1,3,4,6-四氯-3α,6α-二苯基甘脲(Iodogen)，美國(guó)Sigma公司；L-酪氨酸甲酯鹽酸鹽(H-Tyr-OMe·HCl)，吉爾生化(上海)有限公司；Na131I(無(wú)載體溶液)由中國(guó)原子能科學(xué)研究院提供。雄性昆明小鼠，(20±2)g，中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物所；S180細(xì)胞株由北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供。丙烯酰氯參照文獻(xiàn)[13]合成；三乙胺和1,3-丙二胺在使用前通過(guò)蒸餾純化，其他試劑均為分析純，并未作進(jìn)一步純化。

Bruker ARX-400核磁共振譜儀，Bruker-APEX Ⅳ傅里葉高分辨質(zhì)譜(ESI-MS)，瑞士Bruker公司；Waters 1525高效液相譜儀，美國(guó)Waters 公司；Radiomatic 500TR 液體閃爍計(jì)數(shù)器，美國(guó)Packard 公司；自動(dòng)γ計(jì)數(shù)器，美國(guó)Perkin Elmer 公司；Simplicity 185 純水儀，美國(guó)Milipore公司；CRC-15R放射性活度計(jì)，美國(guó)Capintec 公司；DY-W1型電泳儀，北京試驗(yàn)設(shè)備廠。

1.2 合成部分

三種2-硝基咪唑酪氨酸衍生物的合成路線示于圖1，具體操作如下。

(1)(S)-2-丙烯酰胺基-3-(4-羥基苯基)丙酸甲酯 (2)

將2.31 g H-Tyr-OMe·HCl (0.010 mol)和4.0 mL Et3N(0.027 mol)溶于30 mL CH2Cl2，冰水浴下緩慢滴加0.89 mL丙烯酰氯(0.011 mol)后，室溫下攪拌16 h。分別用1 mol/L HCl(20 mL×1)、飽和NaHCO3(20 mL×1)和飽和NaCl(20 mL×1)洗滌有機(jī)相，干燥，硅膠色譜柱分離，洗脫劑為石油醚和乙酸乙酯的混合溶劑(體積比為1∶1)。最終產(chǎn)品0.863 g，產(chǎn)率為34.6%。

圖1 酪氨酸衍生物的合成

(2)(S)-3-(4-羥基苯基)-2-(3-(2-硝基咪唑基)丙酰胺基)丙酸甲酯(NI-Y-M，3)

將0.045 g 2-硝基咪唑(0.398 mmol)和0.249 g化合物2(1.00 mmol)溶于3.0 mL Et3N/CH3CN(體積比為1∶1)中，加熱回流36 h。旋干溶劑，硅膠色譜柱分離，梯度洗脫，洗脫劑為石油醚和乙酸乙酯的混合溶劑(體積比為2∶1～1∶1)。最終產(chǎn)品0.056 g，產(chǎn)率為38.8%。

1H NMR δ(DMSO-d6):9.24(1H,s,—C6H4—OH),8.41(1H,d,CO—NH—),7.40(1H,s,imi-H),7.12(1H,s,imi-H ),6.90(2H,d,—C6H4—),6.62(2H,d,—C6H4—),4.52(2H,t,imi-N—CH2—CH2—CO),4.32(1H,m,NH—CH—CO),3.56(3H,s,—OCH3),2.72(2H,m,CH—CH2—C6H4),2.68(2H,t,imi-N—CH2—CH2—CO)。高分辨質(zhì)譜(ESI-MS)C16H19N4O6[ M+H ]+:m/z理論值為363.129 91，檢測(cè)值為363.129 81。

(3)(S)-3-(4-羥基苯基)-2-(3-(2-硝基咪唑基)丙酰胺基)丙酸(NI-Y，4)

室溫下，向0.049 g 化合物3(0.14 mmol)滴加1 mol/L NaOH溶液至全部溶解；5 min后，用6 mol/L HCl酸化至pH≈1，出現(xiàn)大量白色晶體，室溫下靜置12 h，過(guò)濾，洗滌。最終產(chǎn)品0.025 g，產(chǎn)率為53.1%。

1H NMR δ(DMSO-d6):12.65(1H,s,COOH),9.20(1H,s,—C6H4—OH),8.26(1H,d,CO—NH—),7.39(1H,s,imi-H ),7.09(1H,s,imi-H),6.91(2H,d,—C6H4—),6.62(2H,d,—C6H4—),4.51(2H,t,imi-N—CH2—CH2—CO),4.30(1H,m,NH—CH—CO),2.70(2H,m,CH—CH2—C6H4),2.67(2H,t,imi-N—CH2—CH2—CO)。高分辨質(zhì)譜(ESI-MS)C15H17N4O6[ M+H ]+:m/z理論值為349.114 26，檢測(cè)值為349.113 94。

(4)(S)-N-(3-胺丙基)-3-(4-羥基苯基)-2-(3-(2-硝基咪唑基)丙酰胺基)丙酰胺(NI-Y-A，5)

將0.056 g 化合物3(0.15 mmol)溶于2.0 mL甲醇，緩慢滴加0.5 mL 1,3-丙二胺(6.0 mmol)，室溫下攪拌6 h。旋干溶劑、過(guò)柱分離，洗脫劑為二氯甲烷和甲醇的混合溶劑(體積比為5∶1)。得最終產(chǎn)品0.045 g，產(chǎn)率為72.6%。

1H NMR δ(DMSO-d6):8.17(1H,d,CO—NH—CH),7.90(1H,t,CO—NH—CH2),7.33(1H,s,imi-H),7.08(1H,s,imi-H),6.92(2H,d,—C6H4—),6.61(2H,d,—C6H4—),4.51(2H,t,imi-N—CH2—CH2—CO),4.33(1H,m,NH—CH—CO),3.05(2H,m,NH—CH2),2.72(2H,m,CH—CH2—C6H4),2.67(2H,t,imi-N—CH2—CH2—CO),2.58(2H,m,CH2—CH2—CH2),1.40(2H,m,CH2—CH2—CH2)。高分辨質(zhì)譜(ESI-MS)C18H25N6O5[ M+H ]+:m/z理論值為405.188 09，檢測(cè)值為405.187 81。

1.3 標(biāo)記物的制備及性質(zhì)測(cè)定

根據(jù)文獻(xiàn)[14-15]，利用Iodogen作為氧化劑，從而分別得到[131I]NI-Y-M、[131I]NI-Y和[131I]NI-Y-A等3種碘標(biāo)記化合物。以[131I]NI-Y-M的制備為例，方法如下：

將100 μg化合物3(NI-Y-M)溶于0.4 mL 0.20 mol/L磷酸鹽緩沖溶液中(pH=7.0)，然后轉(zhuǎn)入已涂好100 μg Iodogen的0.5 mL的離心管中，再加入2.96 MBq Na131I，漩渦振蕩5 min。靜置20 min后，將反應(yīng)物轉(zhuǎn)移，終止反應(yīng)。

通過(guò)HPLC分析標(biāo)記物的放射化學(xué)純度。采用高效液相系統(tǒng)配置Packard 500TR系列的放射性檢測(cè)器，C-18反相柱(Agilent HC-C18.5 μm,4.6 mm×150 mm)，梯度洗脫，流速為1 mL/min。流動(dòng)相條件如下：溶劑A為95%水和5%甲醇，溶劑B為95%甲醇和5%水，溶劑A和溶劑B均含有0.1%的三氟乙酸(TFA)，淋洗梯度列入表1。

表1 流動(dòng)相淋洗條件

將標(biāo)記物的溶液室溫放置24 h后測(cè)定標(biāo)記率的變化。

取0.1 mL標(biāo)記物于離心管中，分別加入4.0 mL正辛醇，4.0 mL 0.025 mol/L 磷酸鹽緩沖溶液(pH=7.4)，漩渦振蕩2 min，離心5 min(3 000 r/min)，分別取出水相和有機(jī)相各0.1 mL檢測(cè)。根據(jù)有機(jī)相與水相的放射性活度比，求出相應(yīng)的油水分配比PO/W，重復(fù)3次取平均值。

1.4 電泳實(shí)驗(yàn)

以0.050 mol/L、pH=7.4的磷酸鹽緩沖液為電泳液，電泳載體為Whatman 3號(hào)濾紙條，長(zhǎng)度20 cm，先用電泳液浸濕，再分別將3種標(biāo)記物點(diǎn)在紙條中間，在200 V電壓下電泳4 h。取出干燥后，將紙條剪成每段1 cm的小段，相同條件下檢測(cè)每段紙條的放射性活度。

1.5 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

健康雄性昆明小白鼠，體重(20±2)g，向其左側(cè)腋部皮下移植約106個(gè)S180細(xì)胞。7～8 d后，腫瘤直徑約10～15 mm。實(shí)驗(yàn)前三天喂食1% KI水溶液進(jìn)行甲狀腺封閉，實(shí)驗(yàn)時(shí)，分別取[131I]NI-Y-M、[131I]NI-Y和[131I]NI-Y-A標(biāo)記液0.1 mL(約111 kBq)，通過(guò)尾靜脈注射到小鼠體內(nèi)。在注射后1、2、4 h，從小鼠眼底取血后，斷頸處死，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)平行5只。剝離腫瘤、各臟器和組織，用水洗滌，拭干后稱重，然后測(cè)量其放射性計(jì)數(shù)。0.1 mL的注射液被作為標(biāo)準(zhǔn)也測(cè)量其放射性計(jì)數(shù)，用來(lái)計(jì)算各器官的放射性攝取(%ID/g)。最后結(jié)果表示為(平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差)。

2 結(jié)果和討論

2.1 化合物合成

實(shí)驗(yàn)中合成的化合物均通過(guò)1H NMR、ESI-MS檢測(cè)。

在合成化合物2時(shí)，試劑丙烯酰氯是參照文獻(xiàn)[13]的方法合成，活性高、易潮解，同時(shí)，由于酪氨酸的酚羥基也具有一定的活性，所以實(shí)驗(yàn)必須控制丙烯酰氯的滴加速度，不能過(guò)快。即使這樣仍不能避免酚羥基副反應(yīng)的發(fā)生，因而副反應(yīng)的存在制約了目標(biāo)化合物產(chǎn)率的提高?；衔?(NI-Y-M)的合成反應(yīng)屬于Michael 加成，反應(yīng)條件比較苛刻，同時(shí)由于2-硝基咪唑溶解度的原因，最終所得產(chǎn)物NI-Y-M 產(chǎn)率較低。化合物4(NI-Y)的合成屬于經(jīng)典的酯類水解反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)單易行，溫和的水解條件既保證了目標(biāo)產(chǎn)物的生成，又避免了酰胺鍵的斷裂。對(duì)于化合物5(NI-Y-A)，最初采用羧酸和胺的直接縮合反應(yīng)，考慮到酪氨酸酚羥基的活性，選用溫和的縮合試劑苯并三氮唑-1-氧三(二甲胺基)磷鎓六氟磷酸鹽(BOP)。TLC監(jiān)測(cè)顯示，縮合反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高，但是由于反應(yīng)體系生成的副產(chǎn)物影響NI-Y-A的分離提純，后來(lái)嘗試酯的氨解反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)于本反應(yīng)體系，室溫條件下反應(yīng)能夠順利進(jìn)行，反應(yīng)較快、轉(zhuǎn)化率高、分離方便。

2.2 標(biāo)記物性質(zhì)的測(cè)定

采用RP-HPLC法分析131I的標(biāo)記物，標(biāo)記結(jié)果示于圖2。由圖2可知：Na131I溶液以及Iodogen與Na131I 反應(yīng)產(chǎn)物的保留時(shí)間均為1.8 min；[131I]NI-Y-M的保留時(shí)間為11.6 min；[131I]NI-Y的保留時(shí)間為9.8 min；[131I]NI-Y-A的保留時(shí)間為7.6 min。3種標(biāo)記物的標(biāo)記率均大于95%，室溫下將標(biāo)記物在空氣中放置24 h后，其標(biāo)記率仍大于95%。因而實(shí)驗(yàn)所得標(biāo)記物具有很好的穩(wěn)定性。

圖2 131I-(a)、[131I]NI-Y-M(b)、[131I]NI-Y(c)和[131I]NI-Y-A(d)的RP-HPLC檢測(cè)譜圖

電泳實(shí)驗(yàn)的結(jié)果示于圖3。由圖3可知：對(duì)于[131I]NI-Y-M 幾乎所有的放射性聚集在原點(diǎn)附近，而[131I]NI-Y、[131I]NI-Y-A分別不同程度的向正極和負(fù)極遷移。這說(shuō)明在生理?xiàng)l件下(pH=7.4)，標(biāo)記物[131I]NI-Y-M不帶電荷，[131I]NI-Y和[131I]NI-Y-A分別帶負(fù)電和正電。

油水分配比的實(shí)驗(yàn)顯示：[131I]NI-Y-M、[131I]NI-Y 和[131I]NI-Y-A 的lgPO/W分別為1.46±0.03(n=3)、-1.97±0.04(n=3)和-1.31±0.03(n=3)，[131I]NI-Y-M具有高的脂溶性，[131I]NI-Y 和[131I]NI-Y-A親水性較高。

2.3 生物分布結(jié)果

[131I]NI-Y-M、[131I]NI-Y 和[131I]NI-Y-A在荷S180腫瘤小鼠體內(nèi)的生物分布結(jié)果列入表2。由表2可知，3種化合物在心、肌肉、腦、脾、肺等器官的放射性攝取低，并且清除較快，而在腫瘤部位則呈現(xiàn)出快攝取慢清除的趨勢(shì)。因而在注射后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，腫瘤與肌肉放射性攝取的比值能持續(xù)維持在相對(duì)較高的水平。以4 h的數(shù)據(jù)為例，[131I]NI-Y-M的腫瘤與肌肉放射性攝取的比值上升至3.33，[131I]NI-Y為2.80，[131I]NI-Y-A為5.00。為了避免小鼠甲狀腺對(duì)碘標(biāo)記化合物的特異性攝取，實(shí)驗(yàn)采用1% KI水溶液喂食小鼠，從甲狀腺的低攝取值可以確認(rèn)甲狀腺已經(jīng)被成功封閉。

從表2還可發(fā)現(xiàn)，雖然3種化合物腫瘤的放射性攝取相對(duì)較高，但是由于它們不同的帶電性質(zhì)，導(dǎo)致在某些器官組織的攝取、代謝、清除存在明顯的差異，腫瘤與這些器官組織的放射性比值差異較大。例如：4 h 時(shí)，[131I]NI-Y-M的腫瘤與血液放射性攝取的比值為0.48，[131I]NI-Y為0.68，[131I]NI-Y-A為1.43。具體而言，對(duì)于[131I]NI-Y-M，血液、肝臟、小腸等器官放射性攝取值高，這也可能與其高脂溶性有關(guān)；而對(duì)于[131I]NI-Y 和[131I]NI-Y-A，腎的放射性攝取值明顯較高，這可能是由于它們的親水性好的緣故。

Kim等[16]發(fā)現(xiàn)，以DO3A、DO2A或NOTA為雙功能連接劑，以三苯基膦為靶向基團(tuán)的64Cu的標(biāo)記物電荷對(duì)其腫瘤特異性影響很大。帶一個(gè)正電荷的64Cu(DO2A-xy-TPP)+比帶2個(gè)正電荷、中性及帶負(fù)電荷的其余5個(gè)標(biāo)記物的肝攝取低，腫瘤/肝的攝取比高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與他們的結(jié)論基本類似。

圖3 [131I]NI-Y-M(a)、[131I]NI-Y(b)和[131I]NI-Y-A(c)電泳實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)譜圖

綜合以上的分析，可以確認(rèn)帶有不同電荷的化合物其在動(dòng)物體內(nèi)的分配、吸收攝取、代謝清除的情況存在不同。由于本實(shí)驗(yàn)僅選用一個(gè)母體分子(2-硝基咪唑的酪氨酸骨架)，樣本太少，目前還難以明確是否化合物電性的改變能夠有效改善腫瘤對(duì)乏氧顯像劑的攝取，但是對(duì)于本實(shí)驗(yàn)選定評(píng)價(jià)體系，從腫瘤與血液、腫瘤與肌肉放射性攝取的比值數(shù)據(jù)能夠確認(rèn)帶正電的標(biāo)記物[131I]NI-Y-A要優(yōu)于中性的標(biāo)記物[131I]NI-Y-M和呈現(xiàn)負(fù)電性的標(biāo)記物[131I]NI-Y。

表2 [131I]NI-Y-M、[131I]NI-Y和[131I]NI-Y-A在荷瘤小鼠中的生物分布

3 結(jié) 論

合成了3種含有2-硝基咪唑的酪氨酸骨架結(jié)構(gòu)化合物NI-Y-M、NI-Y 和NI-Y-A，并采用Na131I，以Iodogen為氧化劑，完成了化合物的標(biāo)記。3種標(biāo)記物的標(biāo)記率均大于95%，室溫下放置24 h穩(wěn)定。電泳實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，同等條件下，標(biāo)記物[131I]NI-Y-M為電中性，[131I]NI-Y和[131I]NI-Y-A分別帶負(fù)電和正電。小鼠體內(nèi)分布實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，在一定程度上具有不同電荷的化合物在體內(nèi)的生物學(xué)行為存在不同。雖然所選評(píng)價(jià)體系的結(jié)果顯示，帶正電的標(biāo)記物[131I]NI-Y-A具有最優(yōu)的腫瘤與血液、腫瘤與肌肉放射性攝取的比值，但是限于實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)體系樣本太少，目前尚難以對(duì)電荷的影響得出明確的結(jié)論，仍需要進(jìn)一步的研究和探索。

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