遲菲菲，田豐偉，王剛，劉小鳴，張秋香，張灝，陳衛(wèi)

（江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

植物乳桿菌LP1001緩解小鼠酒精性肝損傷的研究

遲菲菲，田豐偉，王剛，劉小鳴，張秋香，張灝，陳衛(wèi)

（江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

植物乳桿菌LP1001是一株從泡菜中分離得到的具有良好抗氧化功能的乳酸菌，通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討 其對(duì)急性和慢性酒精性肝損傷的干預(yù)作用。將40只小鼠分成空白組、模型組、低、中、高劑量組5組，比較兩種肝損傷模型中各組小鼠的肝指數(shù)，測(cè)定血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、甘油三酯（TG）和肝勻漿中谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）、甘油三酯（TG）的濃度，并觀察肝臟的病理學(xué)變化。結(jié)果表明，不同劑量的LP1001可在不同程度上抑制酒精引起的ALT、AST、TG和MDA濃度的升高以及GSH的降低，其中高劑量組的作用尤其顯著，可使各指標(biāo)基本恢復(fù)到正常水平；并且LP1001對(duì)慢性酒精性肝損傷的緩解更為明顯，與病理學(xué)觀察結(jié)果相互印證。綜上，植物乳桿菌LP1001對(duì)小鼠的急慢性酒精性肝損傷均能起到一定的保護(hù)作用。

乳酸菌；酒精性肝損傷；小鼠；氧化應(yīng)激

0 引 言

酒精性肝損傷主要包括：酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纖維化、酒精性肝硬化和肝癌，在我國(guó)酒精所致的肝損傷逐年上升[1-3]。已有報(bào)道酒精在肝臟中代謝異常時(shí)會(huì)產(chǎn)生過量的自由基，引起氧化應(yīng)激，導(dǎo)致肝損傷[4-6]。因此，探尋抑制氧化應(yīng)激、預(yù)防和治療酒精性肝病的措施具有重要意義。

乳酸菌具有調(diào)節(jié)腸道菌群，提高免疫力，抗氧化，降膽固醇等多種功能[7-10]，某些乳酸菌還可以通過減輕氧化應(yīng)激、改善腸道通透性和調(diào)節(jié)腸道菌群從而緩解酒精引起的肝功能的下降[11-13]。

植物乳桿菌LP1001為本實(shí)驗(yàn)室以對(duì)過氧化氫的耐受能力為指標(biāo)，從泡菜中篩選得到的一株具有較高抗氧化活性的乳酸菌[14]。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步通過小鼠的急性和慢性酒精性肝損傷模型，對(duì)其護(hù)肝效果進(jìn)行研究。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)健康昆明小鼠，雄性，18～20 g；許可證號(hào)碼：SCXK（滬）2007-0005。飼養(yǎng)于12 h光照/12 h黑暗、相對(duì)濕度40%～60%，室溫（23±2）℃的標(biāo)準(zhǔn)化動(dòng)物房?jī)?nèi)，自由采食和飲水，動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)試劑為MRS培養(yǎng)基；脫脂乳粉。

1.2 主要儀器

SW-CJ-1CV超凈臺(tái)，恒溫培養(yǎng)箱，Eppendorf 5804R冷凍離心機(jī)，UV2100紫外可見分光光度計(jì)，J6大容量冷凍離心機(jī)。

1.3 方法

1.3.1 LP1001的制備

將凍存于-80℃的植物乳桿菌LP1001復(fù)蘇、活化兩代，在MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)18 h后，6 000 r/min離心10 min，棄上清，用無菌的PBS緩沖液清洗兩遍，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%脫脂乳作為保護(hù)劑，凍干濃縮。灌胃小鼠時(shí)，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%生理鹽水重懸，調(diào)整菌液至所需濃度，在37℃水浴中復(fù)蘇30 min后使用。

1.3.2 急性酒精性肝損傷動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

將40只小鼠隨機(jī)分成5組，每組8只，空白組和模型組灌胃脫脂乳，乳酸菌低、中、高劑量組分別灌胃濃度為107，108和109mL-1的植物乳桿菌LP1001菌懸液。連續(xù)30 d，末次灌胃1 h后空白組灌胃脫脂乳，其余各組灌胃體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇，所有樣品均按照10 mL/kg體質(zhì)量進(jìn)行灌胃，每天一次。

1.3.3 慢性酒精性肝損傷動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

將40只小鼠隨機(jī)分成5組，每組8只，所有樣品均按照10 mL/kg體質(zhì)量進(jìn)行灌胃，每天灌胃兩次。上午空白組灌胃脫脂乳，其余各組灌胃乙醇溶液（乙醇體積分?jǐn)?shù)按照20%，25%，30%，35%，40%逐漸增加， 在兩周內(nèi)增至40%后維持此濃度至實(shí)驗(yàn)結(jié)束）；下午空白組和模型組灌胃脫脂乳，乳酸菌低、中、高劑量組分別灌胃濃度為107，108和109mL-1的植物乳桿菌LP1001菌懸液。兩次灌胃間隔8 h，實(shí)驗(yàn)時(shí)間為90 d。

1.3.4 樣品處理

末次灌胃后禁食12 h，摘眼球取血，所得血清用于ALT（谷丙轉(zhuǎn)氨酶）、AST（谷草轉(zhuǎn)氨酶）、TG（甘油三酯）的測(cè)定。頸椎脫臼處死后，迅速解剖小鼠并取出肝臟，將左葉同一部位的肝臟用蘇木精和伊紅（HE）染色，以進(jìn)行病理學(xué)檢查。剩余部分制備成10%的肝勻漿液，用于GSH（谷胱甘肽）、MDA（丙二醛）、TG（甘油三酯）的測(cè)定。ALT、AST、TG、GSH、MDA各 項(xiàng) 指標(biāo)的測(cè)定均按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

所有數(shù)據(jù)均用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，各項(xiàng)指標(biāo)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，以O(shè)ne-way ANOVA進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 LP1001對(duì)小鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量及肝指數(shù)的影響

肝指數(shù)是肝質(zhì)量與體質(zhì)量的比值，它在一定程度上反映了肝臟的健康與否，當(dāng)發(fā)生病變時(shí)往往會(huì)引起器官的萎縮或腫脹從而導(dǎo)致肝指數(shù)也隨之發(fā)生變化。表1為L(zhǎng)P1001對(duì)小鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量和肝指數(shù)的影響。由表1可以看出，急性肝損傷的各組小鼠在體質(zhì)量、肝質(zhì)量與肝指數(shù)上基本沒有差異；慢性肝損傷實(shí)驗(yàn)中，各組小鼠體質(zhì)量較近似，但模型組小鼠的肝質(zhì)量與肝指數(shù)較空白組顯著增加，說明酒精的攝入會(huì)引起肝臟腫脹、變大，而灌胃中、高劑量的LP1001可以使其降低至正常水平。

表1 LP1001對(duì)小鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量及肝指數(shù)的影響

2.2 LP1001對(duì)小鼠血清指標(biāo)的影響

ALT和AST是反映肝損傷的常用酶學(xué)指標(biāo)，主要存在于肝細(xì)胞的胞漿內(nèi)，AST還分布在線粒體中，當(dāng)肝臟受損時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)氨酶可進(jìn)入血液，引起血清中ALT和AST水平升高。TG的濃度則反映了肝細(xì)胞內(nèi)脂肪變性的情況，TG含量越高表明肝細(xì)胞中由于氧化應(yīng)激和脂質(zhì)代謝紊亂引起的脂肪變性越嚴(yán)重。在急性肝損傷實(shí)驗(yàn)中，與空白組相比，模型組血清的ALT與AST活力明顯升高（P＜0.05），灌胃LP1001組可使酶活力降低，尤其是高劑量組的ALT活力已接近正常水平，各組TG的濃度沒有差異；在慢性肝損傷實(shí)驗(yàn)中，模型組的ALT、AST和TG濃度與空白組相比均升高且差異顯著 （P＜0.05），而LP1001的攝入可使其有所下降，尤其是中、高劑量組的LP1001可顯著降低各項(xiàng)指標(biāo)的水平（P＜0.05），并與空白組無差異（見表2）。說明造?；境晒?，且灌胃LP1001能夠使ALT、AST和TG得到改善。

表2 LP1001對(duì)小鼠血清ALT、AST和TG的影響

2.3 LP1001對(duì)小鼠肝勻漿指標(biāo)的影響

自由基及其誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化是造成肝組織損傷的重要原因之一，MDA為脂質(zhì)過氧化的副產(chǎn)物，其量大小可反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化水平，間接反映出肝細(xì)胞受損傷的程度；GSH為體內(nèi)重要的抗氧化物，直接參與酒精代謝過程中自由基的清除，減輕和阻止活性氧的過氧化作用[15-16]，因此TG的濃度反映了肝細(xì)胞脂肪變性的情況，而GSH和MDA則可以表征肝臟氧化損傷的程度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。由表3可以看出，在急性肝損傷實(shí)驗(yàn)中，與空白組相比，模型組肝勻漿的TG和MDA濃度顯著升高，而GSH質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降（P＜0.05），灌胃LP1001后各項(xiàng)指標(biāo)均得到改善，其中，中、高劑量的LP1001使TG水平下降（P＜0.05），高劑量組GSH質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯高于模型組、MDA濃度基本上降低至正常水平（P＞0.05）；在慢性肝損傷實(shí)驗(yàn)中，與空白組相比，模型組肝勻漿的TG和MDA濃度顯著升高，而GSH質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降（P＜0.05），LP1001的攝入（尤其是高劑量組）可以顯著降低TG和MDA的濃度，同時(shí)大大增加GSH的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（與模型組相比，P＜0.05）。從而進(jìn)一步證明造模成功，且高劑量的LP1001可以使酒精性肝損傷基本恢復(fù)到正常水平。

表3 LP1001對(duì)小鼠肝臟TG、GSH和MDA的影響

2.4 LP1001對(duì)小鼠肝臟病理學(xué)改變的影響

2.4.1 急性酒精性肝損傷實(shí)驗(yàn)的病理學(xué)觀察

對(duì)肝組織切片進(jìn)行HE染色，結(jié)果如圖1所示。由圖1可以看出，空白組肝小葉清晰完整，肝索排列整齊，肝細(xì)胞具有正常的形態(tài)與結(jié)構(gòu)，無脂肪變性與炎性浸潤(rùn)；模型組肝索排列雜亂，肝細(xì)胞腫脹變形，胞漿疏松，細(xì)胞核固縮，出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；低劑量組與模型組類似，有較多炎性細(xì)胞；中劑量組比低劑量組略有改善，存在少數(shù)核固縮和炎性細(xì)胞；高劑量組的效果明顯優(yōu)于低、中劑量，肝小葉形態(tài)基本正常，核固縮和炎性細(xì)胞顯著減少。

2.4.2 慢性酒精性肝損傷實(shí)驗(yàn)的病理學(xué)觀察

對(duì)肝組織切片進(jìn)行HE染色，結(jié)果如圖2所示。由圖2可以看出，空白組肝細(xì)胞索結(jié)構(gòu)完整，呈放射狀，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞有明顯的界線且胞漿均勻，無脂肪空洞和炎性浸潤(rùn)；模型組脂肪變性明顯，有大片的脂肪空洞，肝細(xì)胞腫脹變形、胞質(zhì)渾濁，有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，少數(shù)核固縮，出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；低劑量組脂肪空洞較多，肝細(xì)胞腫脹，有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和輕度炎性浸潤(rùn)；中劑量組與模型組和低劑量組相比脂肪空洞略有減少；高劑量組肝臟脂肪變性明顯減輕，幾乎無脂肪空洞，基本正常。

3 討 論

迄今為止，有關(guān)酒精性肝損傷確切的發(fā)病機(jī)制尚不清楚。一般認(rèn)為，長(zhǎng)期、大劑量酒精攝入時(shí)，肝細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強(qiáng)，產(chǎn)生大量的自由基，引起肝組織的氧化損傷[15]，同時(shí)免疫因素及乙醇代謝產(chǎn)物的毒害作用也是可能的致病原因。因此，目前用于防治酒精性肝損傷的多為一些具有抗氧化、清除自由基功能的中藥、天然提取物，如：鐵皮石斛、玉米肽、蛇床子素、輪葉黨參提取物、白藜蘆醇等[17-21]。

近年來隨著對(duì)乳酸菌的深入研究，利用乳酸菌改善酒精性肝病越來越受到關(guān)注[11-12,22]。本研究選用的植物乳桿菌LP1001為前期篩選的、已證明具有較好抗氧化能力的一株乳酸菌：能夠耐受1 mmol/L的過氧化氫，完整細(xì)胞與無細(xì)胞提取物對(duì)DPPH自由基與羥自由基均具有較高的清除率，其清除能力與1 mmol/L抗壞血酸相當(dāng)[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)濃度的乳酸菌可以降低血清中ALT與AST兩種指示酶的活力，降低血清和肝臟中TG的濃度，而且還可以改善體內(nèi)的氧化指標(biāo)：酒精的攝入使得肝臟中MDA濃度大大升高，GSH質(zhì)量分?jǐn)?shù)相應(yīng)減少，而乳酸菌則能夠降低MDA濃度，同時(shí)增加GSH的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。高劑量的乳酸菌 （濃度為109CFU/mL）具有最佳的治療效果，能夠使機(jī)體的各項(xiàng)指標(biāo)恢復(fù)到接近正常的水平。另外，乳酸菌在慢性損傷中的護(hù)肝作用要比急性損傷更為有效和顯著。

綜上所述，本研究所采用的植物乳桿菌LP1001可以對(duì)小鼠急慢性酒精性肝損傷發(fā)揮一定的保護(hù)作用，尤其是高劑量組，各項(xiàng)指標(biāo)均與模型組有顯著的差異并基本接近正常水平，推測(cè)其機(jī)理可能與乳酸菌較高的抗氧化、清除自由基的能力有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)沒有設(shè)計(jì)藥物組，因此可以進(jìn)一步采用不同藥物作為陽(yáng)性對(duì)照，比較LP1001與目前市場(chǎng)上常用護(hù)肝藥的療效。由于本菌來源于傳統(tǒng)食品，所以可用于發(fā)酵食品或與其他成分復(fù)配來開發(fā)新產(chǎn)品，從而提出了采用食源性微生態(tài)干預(yù)調(diào)節(jié)腸道菌群、緩解酒精性肝損傷的新策略。

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Investigations on the effects of Lactobacillus plantarum 1001 on alcoholic liver injury in mice

CHI Fei-fei,TIAN Feng-wei,WANG Gang,LIU Xiao-ming,ZHANG Qiu-xiang,ZHANG Hao,CHEN Wei
（School of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China）

Lactobacillus plantarum 1001（LP1001）was screened from Chinese pickles and showed high antioxidative activities.Its effects on alcohol-induced liver injury were investigated in mouse models with acute and chronic alcoholic liver injury.For both liver injury models,40 male Kunming mice were randomly separated into 5 groups：control group,model group,and low,middle,high dose groups of LP1001.The coefficient of hepatic weight,serum alanine aminotransferase（ALT）,aspartate transaminase（AST）,triglyceride（TG）and liver homogenate glutathione（GSH）,malonaldehyde（MDA）,triglyceride（TG）were determined by biochemical assays.Meanwhile,histological analysis was also carried out.The results indicated that LP1001 feeding could lower the levels of ALT,AST,TG and MDA and increase the GSH levels compared to the model group.The effects changed with the dose of LP1001 supplementation and the high dose group was especially superior to other groups.Moreover,the protective effects were even more significant on chronic model than acute model,which was also confirmed by liver pathology changes.Therefore,LP1001 can provide additional protective and therapeutic strategies for both acute and chronic alcoholic liver injuries.

lactic acid bacteria;alcoholic liver injury;mice;oxidative stress

Q939.11+7

A

1001-2230（2012）09-0004-04

2012-03-22

科技部863計(jì)劃（2011AA100901）。

遲菲菲（1988-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称肺⑸铩?/p>

陳衛(wèi)